一、Lipases-Catalyzed Alcoholysis for the Preparation of Chiral 1- or 2-Hydroxyalkanephosphonates （论文文献综述）
李远锋[1]（2018）在《黑曲霉细胞表面展示CALB的催化特性及其应用》文中研究指明黑曲霉（Aspergillus niger）具有非常强的蛋白分泌能力,是GRAS（Generally recognized as safe）认证的微生物,是重要工业酶生产的菌株。细胞表面展示技术是将功能蛋白锚定于微生物细胞表面实现将功能蛋白固定于细胞表面,从而赋予细胞全新的功能,其中微生物表面展示酶在生物催化和制备生化产品等方面表现出优秀性能。手性醇是合成一些复杂天然产物的手性中心,是用于生产药物中间体的重要手性砌块,利用酶法催化动力学拆分手性醇是绿色制造领域的研究热点。目前,基于细胞表面展示酶技术制备的全细胞催化剂进行拆分手性醇存在着反应时间长、拆分效率不高、难以实现工业化应用等问题,因此,有必要进行探索和评价新的细胞表面展示酶技术用于拆分手性醇。本文研究了黑曲霉细胞表面展示CALB的催化特性,然后将黑曲霉细胞表面展示CALB首次应用于催化仲醇的动力学拆分。研究内容和结果如下:首先,研究黑曲霉细胞表面展示CALB的菌体表面疏水性及其对不同碳链长度的对硝基苯酚酯类的水解活性,表明黑曲霉细胞表面展示CALB具有较强的表面疏水性,推测其可能在非水相体系催化具有更强的催化活性,对硝基苯酚丁酯为底物时,其水解活性最高。其次,通过化学合成法获得脂肪酶催化仲醇动力学拆分的产物,并建立了脂肪酶催化仲醇动力学拆分的底物和产物的气相色谱检测方法,为黑曲霉细胞表面展示CALB催化仲醇动力学拆分提供实验技术支撑。最后,利用黑曲霉细胞表面展示CALB催化仲醇动力学拆分。以2-辛醇为催化仲醇动力学拆分的模式底物,研究仲醇动力学拆分的关键影响因素,如酰基供体、底物摩尔比、黑曲霉细胞表面展示CALB的添加量、水活度、温度和溶剂等,对黑曲霉细胞表面展示CALB催化仲醇动力学拆分的影响。得到黑曲霉细胞表面展示CALB催化仲醇动力学拆分的优化工艺条件为:以乙酸异丙烯酯为酰基供体,底物:酰基供体摩尔比为1:1,黑曲霉细胞表面展示CALB的添加量为50 g/L,水活度为0.11,反应溶剂为甲苯,温度为45℃,转速为200 rpm。在该优化工艺下,研究黑曲霉细胞表面展示CALB催化2-辛醇动力学拆分的时间进程,得到黑曲霉细胞表面展示CALB催化2-辛醇拆分反应12 h,2-辛醇转化率达47.4%,（R）-乙酸-2-辛酯的eep大于99%,E值大于600,且在该工艺条件下进行8批次连续催化反应的前7个批次,底物摩尔转化率保持在70%以上,具有较好的重复利用性。黑曲霉细胞表面展示CALB继续利用优化工艺条件拓展应用于催化其他7种仲醇的动力学拆分,其中2-戊醇、1-（4-氯苯基）-乙醇、1-（4-溴苯基）-乙醇的底物摩尔转化率达47%以上,eep达到99.6%,E值大于600;3-庚醇、1-苯乙醇、1-（4-甲基苯基）-乙醇的底物摩尔转化率分别为18%、39.3%、43.7%,eep和E值都分别达到99.9%和600以上;4-甲氧基-α-甲基苄基醇的底物摩尔转化率达到48.8%,但eep和E值分别为97.8%和311.3。与已经报道的细胞表面展示脂肪酶催化拆分1-苯乙醇作比较,黑曲霉表面展示CALB催化1-苯乙醇拆分体系的时空产率是文献报道的2倍以上,具有良好的拆分1-苯乙醇的效果。总体来说,黑曲霉细胞表面展示CALB在催化仲醇的动力学拆分表现出了良好的立体选择性,对2-戊醇、1-（4-氯苯基）-乙醇、1-（4-溴苯基）-乙醇、1-苯乙醇、1-（4-甲基苯基）-乙醇、4-甲氧基-α-甲基苄基醇具有良好的拆分效果,黑曲霉细胞表面展示CALB为催化仲醇动力学拆分提供新的催化剂选择。
郑建永[2]（2015）在《米曲霉脂肪酶的分离纯化、基因克隆、表达及其在维生素A合成中的应用研究》文中进行了进一步梳理脂肪酶（EC 3.1.1.3）是生物催化有机合成中应用最广泛的一类水解酶,具有催化效率高、选择性强（化学选择性、立体选择性和区域选择性）、稳定性好且无需辅酶等优点,有机相脂肪酶催化反应已成为国内外生物催化研究的热点和重要领域。本论文以实验室保藏的产脂肪酶米曲霉WZ007菌株为研究对象,对米曲霉脂肪酶的分离纯化、酶学性质、克隆表达及其在维生素A合成中的应用进行研究。论文首先建立了以有机溶剂中脂肪酶催化正丁醇和乙酸乙烯酯的转酯化反应为模式反应,利用酚试剂法检测乙醛含量的高通量脂肪酶转酯化活性筛选模型。当乙醛浓度在0.001-0.150 mM的范围内,吸光值与乙醛浓度具有良好的线性关系。利用该高通量筛选方法,从实验室保藏的产脂肪酶菌株中获得了具有高转酯化活性的WZ007菌株。经过孢子电镜观察、生理生化鉴定、ITS序列分析和黄曲霉毒素含量测定等实验研究,结果表明该菌株WZ007属于米曲霉,不产黄曲霉毒素,因此该菌株具有良好的安全性。论文采用超声波细胞破碎、丙酮沉淀、DEAE离子交换层析、Octyl疏水层析和High Q强阴离子交换层析等方法对米曲霉WZ007胞内脂肪酶进行分离与纯化。经过上述分离与纯化步骤,利用SDS-PAGE电泳检测获得较纯的酶。米曲霉WZ007脂肪酶的酶学性质研究表明,该脂肪酶具有“盖子”结构,对三酰基甘油酯具有广谱的水解活性;米曲霉WZ007脂肪酶的最适温度和pH值分别为50℃和pH 7.5,热稳定性好;米曲霉WZ007脂肪酶对有机溶剂和表面活性剂具有良好的耐受性,Cu2+、Zn2+和Ag+等金属离子对其有明显的抑制作用;5 mM DTT使脂肪酶活力提升了1.8倍,说明该脂肪酶分子结构中游离巯基的存在与酶活力相关。MALDI-TOF-MS质谱分析获得了脂肪酶的部分肽链信息,并发现该脂肪酶与Aspergillus oryzae Triacylglycerol lipase（GenBank登录号:BAA92327.1）具有高度的同源性。论文以米曲霉WZ007 cDNA为模板,根据已报道的tglA基因序列设计引物进行PCR扩增,获得了米曲霉WZ007脂肪酶基因aol,测序结果表明该脂肪酶基因包含一个765 bp的ORF,编码254个氨基酸（GenBank登录号:KP975533）。SignalP 4.1分析表明AOL中无信号肽序列,Tmpred软件分析表明AOL脂肪酶中无跨膜区段,说明该酶是个胞内酶。利用PSIPRED软件预测了蛋白质二级结构,通过SWISS-MODEL软件同源建模构建了AOL的三维结构,推测出AOL的催化三联体为Ser170-His235-Asp222,133VAGYLAG139所组成的α-螺旋是脂肪酶AOL的盖子结构。通过TA克隆将aol与pEASY-E1载体成功连接,在E.coli BL21（DE3）实现了AOL的异源表达,重组酶对R,S-2-苯氧丙酸乙酯具有立体选择性水解活性,这说明克隆获得的基因为目标脂肪酶基因,并成功地实现功能性异源表达。论文利用米曲霉WZ007全细胞催化维生素A中间体二醇的区域选择性乙酰化反应合成单乙酸酯,并对该催化反应的影响因素进行了系统的优化和考察。优化后的反应条件为:甲基叔丁基醚为反应溶剂,乙酸乙烯酯为酰化剂,底物酰化剂摩尔比1:4,反应温度35℃,细胞冻干磷酸缓冲液pH 7.5。在上述反应条件1L反应体系中（底物浓度500 mM、米曲霉WZ007细胞添加量50 g/L）,酶催化反应10 h后,转化率达到100%,产物单乙酸酯的收率98.2%。利用核磁共振谱和气质联用等方法对酶催化产物维生素A中间体1’位羟基单乙酸酯进行结构鉴定。
秦斌[3]（2013）在《基于脂肪酶等蛋白质结构的手性合成酶催化剂的发现与改造》文中研究表明南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）是一种具有广泛应用的脂肪酶,但其对洛芬类衍生物却具有较低的选择性。目前CALB已被通过不同的蛋白质策略对其多种催化性质进行了改造,却仅有很少的研究工作集中在提高CALB对手性羧酸的活性及选择性上。在本论文的第一部分中,为了提高CALB对洛芬类衍生物的活性及选择性,我们基于CALB的结构,利用组合活性位点饱和测试（CAST）和迭代突变（ISM）对其进行了定向进化。得到的CALB突变体对三种洛芬酯表现出了明显提高的活性及选择性,其中最优的具有4个取代的突变体对布洛芬、氟比洛芬、酮洛芬酯均为（S）-选择性,对映选择率分别为31、37和>200。分子模拟表明突变的残基对活性及选择性的提高具有协同效应。酮还原酶是一类对药物合成具有较强吸引力的重要生物催化剂。最近有两种来源于光滑假丝酵母的酮还原酶（CgKRs）被报道,但对CgKRs的底物范围及选择性却尚未有深入的研究。在本论文的第二部分中,我们利用前手性的取代苯乙酮衍生物作为底物,对这两种酮还原酶的活性及选择性进行了研究。结果表明CgKRs对取代苯乙酮衍生物的不对称还原反应具有极高的选择性及与底物结构相关的活性。有趣的是,CgKRs还原对位、间位取代苯乙酮时符合Prelog规则,而还原邻位取代苯乙酮则符合反Prelog规则,即CgKRs对对位、间位取代苯乙酮及对邻位取代苯乙酮展现出相反的选择性。我们利用同源模建及分子模拟得到结果能够进一步阐明上述选择性的机制。本实验室的前期工作表明天然产物莪术二酮能被黑曲霉羟基化,且细胞色素P450单加氧酶在其中发挥了关键的催化作用,同时莪二酮还可在酸性条件下转变为莪术内酯。在本论文的第三部分中,我们利用莪二酮的三个立体异构体作为底物,用黑曲霉进行了羟基化反应,并同时在酸性条件下进行了化学反应。结果表明两对对映异构体的反应路径是对映的,即互为对映异构体的莪二酮底物,经黑曲霉转化反应得到的3-羟基莪二酮也为对映异构体,酸性条件下的得到的莪术内酯同样为对映异构体。利用此反应我们得到了 4个3-羟基莪二酮立体异构体及4个莪术内酯立体异构体。同时,我们还通过基因挖掘得到了黑曲霉中的多个P450s,初步研究表明得到的P450s对莪二酮具有羟基化功能。
赵丽芳[4]（2008）在《脂肪酶的固定化及其催化性能的研究》文中研究说明脂肪酶是一类重要的生物催化剂,因其具有选择性高、催化反应条件温和、无污染等特点,广泛应用于食品加工、医药和精细化工等行业。然而,游离酶稳定性差,易失活,不能重复使用,并且反应后也不易与产品分离,使其难以实现规模化的工业生产。在此条件下,通过酶固定化技术来克服脂肪酶应用的局限成为酶工程领域研究的热点。本论文采用多种方法对假单胞菌脂肪酶（PSL）进行了固定化,并将制备的固定化酶应用于催化拆分两个重要的手性中间体—（S）-2-[（2-甲基-6-乙基）苯基氨基]丙酸（NEMPA）和（S）-2-辛醇。首先选用了介孔分子筛和大孔树脂为载体进行酶的固定化研究。通过载体种类的筛选以及对载体性能和固定化条件的优化,获得了三种固定化酶（SBA-15-PSL,EC-EP-PSL和HP20-PSL）,并对固定化过程的动力学以及固定化机理做了进一步探讨。另外,还采用无载体的固定化方法制备了两种脂肪酶的交联聚集体（CLEAs-PSL）。脂肪酶固定化后,对温度和pH的敏感性有所降低,在水相和有机相中的操作稳定性以及储藏稳定性有了明显的提高。经筛选得到的几种固定化酶,在两个拆分体系中的反应速度、催化活性以及对环境的耐受性较游离酶均有显着的改善,并能够在保持活性和立体选择性不变的情况下多次重复使用,初步解决了游离酶使用过程中遇到的问题,为其它酶类的固定化以及脂肪酶的工业化应用奠定了基础。
张永辉,李晋峰,王科,袁承业[5]（2003）在《Lipases-Catalyzed Alcoholysis for the Preparation of Chiral 1- or 2-Hydroxyalkanephosphonates 》文中认为
二、Lipases-Catalyzed Alcoholysis for the Preparation of Chiral 1- or 2-Hydroxyalkanephosphonates （论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Lipases-Catalyzed Alcoholysis for the Preparation of Chiral 1- or 2-Hydroxyalkanephosphonates （论文提纲范文）
（1）黑曲霉细胞表面展示CALB的催化特性及其应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 细胞表面展示技术研究进展 |
| 1.1.1 细胞表面展示技术简介 |
| 1.1.2 细菌细胞表面展示技术 |
| 1.1.3 酵母细胞表面展示技术 |
| 1.1.4 丝状真菌细胞表面展示技术 |
| 1.2 脂肪酶研究进展 |
| 1.2.1 脂肪酶 |
| 1.2.2 脂肪酶的应用 |
| 1.2.3 南极假丝酵母脂肪酶B |
| 1.3 非水相体系酶催化 |
| 1.3.1 非水相体系酶催化 |
| 1.3.2 非水相体系酶催化的影响因素 |
| 1.4 酶法手性拆分仲醇 |
| 1.4.1 手性药物 |
| 1.4.2 酶法手性拆分仲醇 |
| 1.5 本课题的研究意义及主要研究内容 |
| 1.5.1 本课题的研究意义 |
| 1.5.2 本课题的主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料与设备 |
| 2.1.1 实验菌种 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.1.4 实验溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 黑曲霉细胞表面展示CALB全细胞催化剂的制备 |
| 2.2.2 黑曲霉细胞表面展示CALB表面疏水性的测定 |
| 2.2.3 黑曲霉细胞表面展示CALB水解活力的测定 |
| 2.2.4 黑曲霉细胞表面展示CALB催化仲醇动力学拆分体系 |
| 2.2.5 黑曲霉细胞表面展示CALB催化仲醇动力学拆分能力的分析 |
| 2.2.6 数据统计分析方法 |
| 第三章 酶法仲醇动力学拆分体系的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 乙酸仲酯的化学合成及验证 |
| 3.2.2 酶法仲醇动力学拆分底物和产物的检测方法 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 黑曲酶表面展示CALB催化特性及其催化仲醇拆分的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 黑曲霉细胞表面展示CALB的表面疏水性 |
| 4.2.2 黑曲霉细胞表面展示CALB对不同碳链长度酯的水解相对活力 |
| 4.2.3 酰基供体对黑曲霉细胞表面展示CALB催化2-辛醇动力学拆分的影响 |
| 4.2.4 底物摩尔比对黑曲霉细胞表面展示CALB催化2-辛醇动力学拆分的影响 |
| 4.2.5 黑曲霉细胞表面展示CALB的添加量对催化2-辛醇动力学拆分的影响 |
| 4.2.6 水活度对黑曲霉细胞表面展示CALB催化2-辛醇动力学拆分的影响.. |
| 4.2.7 温度对黑曲霉细胞表面展示CALB催化2-辛醇动力学拆分的影响 |
| 4.2.8 溶剂对黑曲霉细胞表面展示CALB催化2-辛醇动力学拆分的影响 |
| 4.2.9 黑曲霉细胞表面展示CALB催化2-辛醇动力学拆分的时间进程 |
| 4.2.10 黑曲霉细胞表面展示CALB催化2-辛醇动力学拆分的操作稳定性 |
| 4.2.11 黑曲霉细胞表面展示CALB催化8种仲醇动力学拆分 |
| 4.3 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）米曲霉脂肪酶的分离纯化、基因克隆、表达及其在维生素A合成中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 脂肪酶 |
| 1.1.1 脂肪酶的简介 |
| 1.1.2 脂肪酶的结构特征 |
| 1.1.3 脂肪酶非水介质体系的催化特性 |
| 1.2 米曲霉及其脂肪酶 |
| 1.2.1 米曲霉的简介 |
| 1.2.2 米曲霉脂肪酶的研究进展 |
| 1.3 脂肪酶在维生素类药物合成中的应用 |
| 1.3.1 脂肪酶催化立体选择性反应 |
| 1.3.2 脂肪酶催化区域选择性反应 |
| 1.3.3 脂肪酶催化合成维生素酯类衍生物 |
| 1.4 维生素A及其化学合成的研究 |
| 1.4.1 维生素A的简介 |
| 1.4.2 维生素A的化学合成工艺 |
| 1.5 立题依据、研究意义及主要研究内容 |
| 1.5.1 立题依据及研究意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 第二章 脂肪酶转酯化活性筛选模型的建立及微生物的筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 脂肪酶 |
| 2.2.2 试剂与材料 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 试剂的配制 |
| 2.3.2 脂肪酶转酯化反应体系 |
| 2.3.3 酚试剂检测方法 |
| 2.3.4 脂肪酶转酯化转化率与酶活力的计算方法 |
| 2.3.5 气相色谱检测方法 |
| 2.3.6 微生物的培养方法 |
| 2.3.7 菌株WZ007的微生物鉴定方法 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 酚试剂法最适检测波长的确定 |
| 2.4.2 酚试剂法衍生化最适时间的确定 |
| 2.4.3 酚试剂法衍生化最适温度的确定 |
| 2.4.4 酚试剂法标准曲线的建立 |
| 2.4.5 利用气相色谱法的验证实验 |
| 2.4.6 脂肪酶转酯化活性微生物的筛选 |
| 2.4.7 菌株WZ007的微生物鉴定 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 米曲霉WZ007脂肪酶的分离纯化与酶学性质研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 微生物培养基 |
| 3.2.3 缓冲液 |
| 3.2.4 试剂与材料 |
| 3.2.5 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 米曲霉WZ007的培养 |
| 3.3.2 米曲霉WZ007脂肪酶的分离与纯化 |
| 3.3.3 蛋白质浓度测定 |
| 3.3.4 酶活测定方法 |
| 3.3.5 SDS-PAGE分析 |
| 3.3.6 米曲霉WZ007脂肪酶的酶学性质研究 |
| 3.3.7 脂肪酶的MALDI-TOF-MS分析 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 米曲霉WZ007脂肪酶的分离与纯化 |
| 3.4.2 脂肪酶纯度鉴定及分子量测定 |
| 3.4.3 米曲霉脂肪酶的酶学性质研究 |
| 3.4.4 脂肪酶的质谱分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 米曲霉脂肪酶的基因克隆、表达与结构分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌种、质粒及引物 |
| 4.2.2 试剂与材料 |
| 4.2.3 微生物培养基 |
| 4.2.4 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 米曲霉WZ007的培养 |
| 4.3.2 米曲霉WZ007 cDNA的制备 |
| 4.3.3 aol基因PCR引物设计 |
| 4.3.4 aol基因PCR扩增 |
| 4.3.5 重组表达载体pEASY-E1-aol的构建及鉴定 |
| 4.3.6 重组菌的构建与表达 |
| 4.3.7 重组菌脂肪酶的分离与纯化 |
| 4.3.8 重组菌脂肪酶的活力测定 |
| 4.3.9 米曲霉脂肪酶AOL的序列分析及同源建模 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 脂肪酶基因aol的克隆 |
| 4.4.2 米曲霉脂肪酶AOL的结构分析 |
| 4.4.3 米曲霉脂肪酶AOL的E. coli异源表达与纯化 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 米曲霉WZ007细胞催化合成维生素A中间体的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 菌株 |
| 5.2.2 培养基 |
| 5.2.3 试剂与材料 |
| 5.2.4 主要仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 米曲霉WZ007的培养 |
| 5.3.2 米曲霉冻干细胞的制备 |
| 5.3.3 酶催化维生素A中间体二醇单乙酰化的反应条件 |
| 5.3.4 酶催化底物和产物的液相检测方法 |
| 5.3.5 酶催化反应转化率和区域选择性的计算方法 |
| 5.3.6 酶催化产物的气相质谱和核磁检测 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 液相色谱检测标准曲线的建立 |
| 5.4.2 脂肪酶的筛选 |
| 5.4.3 脂肪酶催化区域选择性乙酰化的条件研究 |
| 5.4.4 米曲霉脂肪酶细胞的操作稳定性 |
| 5.4.5 酶催化反应的时间曲线 |
| 5.4.6 酶催化产物的结构鉴定 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士期间发表论文与申请专利 |
| 致谢 |
（3）基于脂肪酶等蛋白质结构的手性合成酶催化剂的发现与改造（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一部分 基于蛋白质结构的南极假丝酵母脂肪酶B的定向进化 |
| 第一章 前言 |
| 1.1. 洛芬类药物 |
| 1.2. 生物催化及生物催化制备布洛芬类药物策略 |
| 1.2.1. 生物催化剂 |
| 1.2.2. 生物催化的特点 |
| 1.2.3. 生物催化与手性药物合成 |
| 1.2.4. 生物催化制备洛芬类药物策略 |
| 1.3. 南极假丝酵母脂肪酶(CALs) |
| 1.3.1. 脂肪酶及脂肪酶在有机合成中的应用 |
| 1.3.2. 南极假丝酵母脂肪酶A/B (CALA,CALB)简介 |
| 1.3.3. CALB在有机合成及制备手性药物中的应用 |
| 1.3.4. CALB制备洛芬类药物 |
| 1.4. 立体选择性酶的定向进化 |
| 1.4.1. CASTing/ISM策略 |
| 1.4.2. PoSAR策略 |
| 1.4.3. CALB的蛋白质工程 |
| 1.5. 本论文第一部分立题依据及主要研究内容 |
| 第二章 基于CALB结构的组合突变库设计与构建 |
| 2.1. 实验材料和方法 |
| 2.1.1. 实验材料及仪器 |
| 2.1.2. 实验方法 |
| 2.2. 结果与讨论 |
| 2.2.1. CAST组合突变位点的设计 |
| 2.2.2. 突变库的构建 |
| 2.2.3. 总结 |
| 第三章 CALB组合突变库的筛选及迭代突变 |
| 3.1. 实验材料和方法 |
| 3.1.1. 实验材料 |
| 3.1.2. 实验方法 |
| 3.2. 结果与讨论 |
| 3.2.1. 筛选策略 |
| 3.2.2. 底物合成及手性HPLC检测条件确定 |
| 3.2.3. 突变库A筛选结果 |
| 3.2.4. 迭代突变 |
| 3.2.5. 总结 |
| 第四章 CALB突变体动力学拆分氟比洛芬及酮洛芬酯 |
| 4.1. 实验材料和方法 |
| 4.1.1. 实验材料 |
| 4.1.2. 实验方法 |
| 4.2. 结果与讨论 |
| 4.2.1. 氟比洛芬酯及酮洛芬酯的合成、鉴定及检测 |
| 4.2.2. 动力学拆分氟比洛芬及酮洛芬酯 |
| 4.2.3. 突变M5催化动力学拆分反应的转化率及ee值时间曲线 |
| 4.2.4. 讨论 |
| 第五章 CALB组合突变提高活性及选择性的分子机制 |
| 5.1. 实验材料和方法 |
| 5.1.1. 实验材料 |
| 5.1.2. 实验方法 |
| 5.2. 结果与讨论 |
| 5.2.1. CALB突变影响活性及选择性的分子基础 |
| 5.2.2. 总结及讨论 |
| 第二部分 两种光滑假丝酵母酮还原酶的Prelog及反Prelog选择性 |
| 第六章 两种光滑假丝酵母酮还原酶的Prelog及反Prelog选择性 |
| 6.1. 前言 |
| 6.1.1. 酮还原酶在制备手性药物中的应用 |
| 6.1.2. 酮还原酶的Prelog还原规则 |
| 6.1.3. 本论文第二部分立题依据及主要研究内容 |
| 6.2. 实验材料和方法 |
| 6.2.1. 实验材料 |
| 6.2.2. 实验方法 |
| 6.3. 结果与讨论 |
| 6.3.1. CgKRs不对称还原苯乙酮类衍生物 |
| 6.3.2. CgKRs的同源模建及分子模拟 |
| 6.3.3. CgKRs不对称还原其它底物 |
| 6.3.4. 总结及展望 |
| 第三部分 黑曲霉中P450单加氧酶对莪二酮异构体的羟基化 |
| 第七章 黑曲霉中P450单加氧酶对莪二酮异构体的羟基化 |
| 7.1. 前言 |
| 7.1.1. 细胞色素P450单加氧酶在生物催化领域的研究现状 |
| 7.1.2. 本论文第三部分立题依据及主要研究内容 |
| 7.2. 实验材料和方法 |
| 7.2.1. 实验材料 |
| 7.2.2. 实验方法 |
| 7.3. 结果与讨论 |
| 7.3.1. 黑曲霉对莪二酮三种立体异构体的生物转化 |
| 7.3.2. 黑曲霉中P450s的基因挖掘 |
| 7.3.3. 总结及展望 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 论文发表情况及参与科研课题 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 论文预先检测结果 |
| 附件 |
（4）脂肪酶的固定化及其催化性能的研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 酶与手性 |
| 1.1.1 手性的研究意义及重要性 |
| 1.1.2 手性化合物的制备 |
| 1.1.3 酶在手性技术上的应用 |
| 1.2 脂肪酶 |
| 1.2.1 脂肪酶的概述 |
| 1.2.2 脂肪酶的活性部位结构及其催化机理 |
| 1.2.3 脂肪酶催化拆分 |
| 1.2.4 脂肪酶在应用中存在的问题 |
| 1.3 固定化酶 |
| 1.3.1 固定化酶的概述 |
| 1.3.2 酶的固定化方法 |
| 1.3.2.1 吸附法 |
| 1.3.2.2 包埋法 |
| 1.3.2.3 共价法 |
| 1.3.2.4 交联法 |
| 1.3.3 固定化酶的制备原则 |
| 1.3.4 固定化酶的性质 |
| 1.3.5 酶固定化过程中存在的问题 |
| 1.4 本文的研究思想与主要内容 |
| 1.5 参考文献 |
| 第二章 介孔分子筛固定化脂肪酶的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 脂肪酶溶液的制备 |
| 2.2.4 脂肪酶的固定化 |
| 2.2.5 脂肪酶的活力测定 |
| 2.2.6 蛋白含量的测定 |
| 2.2.7 固定化脂肪酶的活力回收和固定化率 |
| 2.2.8 分子筛SBA-15 的合成与表征 |
| 2.2.9 分子筛SBA-15 的表面修饰 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 固定化载体的选择 |
| 2.3.2 SBA-15 的合成与表征结果 |
| 2.3.3 对SBA-15 载体的改性研究 |
| 2.3.3.1 SBA-15 载体的表面修饰 |
| 2.3.3.2 含不同模板量的SBA-15 的制备 |
| 2.3.4 固定化条件对SBA-15(48)固定化酶的影响 |
| 2.3.4.1 酶浓度对脂肪酶固定化的影响 |
| 2.3.4.2 环境pH 对脂肪酶固定化的影响 |
| 2.3.4.3 缓冲液离子强度对脂肪酶固定化的影响 |
| 2.3.4.4 固定化时间对脂肪酶固定化的影响 |
| 2.3.5 固定化酶的表征 |
| 2.3.6 固定化酶的紫外光谱 |
| 2.3.7 固定化过程分析 |
| 2.4 结论 |
| 2.5 参考文献 |
| 第三章 大孔树脂对脂肪酶的固定化研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 HP20 固定化脂肪酶 |
| 3.2.3 EC-EP固定化脂肪酶 |
| 3.2.4 EC-EP载体活化度的测定 |
| 3.2.5 蛋白含量的测定 |
| 3.2.6 吸附曲线的绘制 |
| 3.2.7 固定化脂肪酶的活力测定 |
| 3.2.8 固定化脂肪酶的固定化效率和活力回收 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 载体的筛选 |
| 3.3.2 HP20-PSL固定化条件的优化 |
| 3.3.3 HP20-PSL的吸附平衡等温线 |
| 3.3.4 HP20-PSL吸附过程的动力学研究 |
| 3.3.5 HP20-PSL的固定化历程 |
| 3.3.6 EC-EP对脂肪酶的固定化 |
| 3.3.7 EC-EP载体活化度的优化 |
| 3.3.8 EC-EP-NH_2-PSL固定化条件的优化 |
| 3.3.9 EC-EP-NH_2 固定化脂肪酶的机理研究 |
| 3.4 结论 |
| 3.5 参考文献 |
| 第四章 交联脂肪酶聚集体的制备 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 脂肪酶的固定化 |
| 4.2.3 CLEAs红外光谱的测定 |
| 4.2.4 固定化脂肪酶的活力测定 |
| 4.2.5 蛋白含量的测定 |
| 4.2.6 固定化脂肪酶的固定化效率和活力回收 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 沉淀剂的选择 |
| 4.3.2 CLEAs制备条件的优化 |
| 4.3.2.1 酶浓度对CLEAs的影响 |
| 4.3.2.2 沉淀剂用量对CLEAs的影响 |
| 4.3.2.3 交联剂的加入量对CLEAs的影响 |
| 4.3.2.4 交联时间对CLEAs的影响 |
| 4.3.3 表面活性剂对CLEAs的影响 |
| 4.3.4 CLEAs的红外光谱 |
| 4.3.5 戊二醛在CLEAs制备过程中的反应机理 |
| 4.4 结论 |
| 4.5 参考文献 |
| 第五章 固定化酶酶学性质的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 温度对固定酶的影响 |
| 5.2.3 pH对固定化酶的影响 |
| 5.2.4 金属离子对固定化酶的影响 |
| 5.2.5 固定化酶的相对活力 |
| 5.2.6 固定化酶的剩余活力 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 温度对固定化酶活性和稳定性的影响 |
| 5.3.2 pH对固定化酶活性和稳定性的影响 |
| 5.3.3 金属离子对固定化酶活性的影响 |
| 5.3.4 固定化酶在水相和有机相中的稳定性 |
| 5.3.5 固定化酶的储藏稳定性 |
| 5.4 结论 |
| 5.5 参考文献 |
| 第六章 固定化脂肪酶催化拆分2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸的研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 仪器和药品 |
| 6.2.2 背景电解质溶液和样品溶液的配制 |
| 6.2.3 实验方法 |
| 6.2.4 NEMPA 转化率(C)的检测 |
| 6.2.5 NEMPA 对映体过量值(e.e.p)的检测 |
| 6.2.6 立体选择性比率(E)的计算 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 固定化酶的筛选 |
| 6.3.2 Ac-CLEA和EC-EP固定化酶催化拆分NEMPA |
| 6.3.2.1 温度对催化拆分的影响 |
| 6.3.2.2 pH对催化拆分的影响 |
| 6.3.2.3 固定化酶加入量对催化拆分的影响 |
| 6.3.2.4 催化拆分NEMPA的反应进程 |
| 6.3.2.5 催化拆分NEMPA的动力学分析 |
| 6.3.3 固定化酶的重复使用 |
| 6.3.4 有机溶剂对固定化脂肪酶活性和立体选择性的影响 |
| 6.3.5 表面活性剂对固定化脂肪酶活性和立体选择性的影响 |
| 6.4 结论 |
| 6.5 参考文献 |
| 第七章 固定化脂肪酶催化拆分手性2-辛醇的研究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料和方法 |
| 7.2.1 主要试剂和仪器 |
| 7.2.2 酶催化(R,S)-2-辛醇的酯交换反应 |
| 7.2.3 底物转化率的测定 |
| 7.2.4 2-辛醇的光学纯度(e.e.)的测定 |
| 7.2.5 立体选择性比率(E)的测定 |
| 7.2.6 产物的分离 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 固定化酶的筛选 |
| 7.3.2 固定化酶拆分2-辛醇反应条件的确定 |
| 7.3.3 提高固定化酶拆分2-辛醇的催化活性和立体选择性 |
| 7.3.3.1 固定化酶的水含量 |
| 7.3.3.2 有机溶剂 |
| 7.3.4 固定化酶拆分2-辛醇的反应进程 |
| 7.3.5 固定化酶的重复使用 |
| 7.4 结论 |
| 7.5 参考文献 |
| 攻读博士期间的主要成果 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 致谢 |
（5）Lipases-Catalyzed Alcoholysis for the Preparation of Chiral 1- or 2-Hydroxyalkanephosphonates （论文提纲范文）
| Scheme 1 |
| Scheme 2 |
四、Lipases-Catalyzed Alcoholysis for the Preparation of Chiral 1- or 2-Hydroxyalkanephosphonates （论文参考文献）
- [1]黑曲霉细胞表面展示CALB的催化特性及其应用[D]. 李远锋. 华南理工大学, 2018(12)
- [2]米曲霉脂肪酶的分离纯化、基因克隆、表达及其在维生素A合成中的应用研究[D]. 郑建永. 浙江工业大学, 2015(06)
- [3]基于脂肪酶等蛋白质结构的手性合成酶催化剂的发现与改造[D]. 秦斌. 沈阳药科大学, 2013(01)
- [4]脂肪酶的固定化及其催化性能的研究[D]. 赵丽芳. 吉林大学, 2008(11)
- [5]Lipases-Catalyzed Alcoholysis for the Preparation of Chiral 1- or 2-Hydroxyalkanephosphonates [J]. 张永辉,李晋峰,王科,袁承业. Chinese Journal of Chemistry, 2003(01)