一、W32/Toget@MM病毒出现（论文文献综述）
王思权[1]（2021）在《抗沙门氏菌Peg菌毛单克隆抗体制备的一种简捷方法与初步应用》文中进行了进一步梳理沙门氏菌（Salmonella）是全世界面临挑战的传染性人畜共患病原菌,主要通过消化道感染,主要存在于宿主肠道,可引起腹泻、呕吐等疾病,至今已发现沙门氏菌包含2600多种血清型,不仅给养殖业带来较大损失,还对人类健康和全球公共卫生构成一定威胁。准确而快速的沙门氏菌诊断方法,是防止该病的关键。沙门氏菌Peg菌毛通过介导细菌与宿主黏附定植的互作,作为影响沙门氏菌致病性的重要黏附定植因子存在于D群沙门氏菌如鸡白痢、鸡伤寒和肠炎沙门氏菌血清型中,而上述三种病原菌严重影响家禽业的发展;鉴于展呈Peg菌毛后细菌自身的颗粒抗原性,使其有望成为检测沙门氏菌的潜在靶标。单克隆抗体由于其特异性强、纯度高、均一性好等优点,在病原检测和疾病诊断方面显示出极大的优势。传统单克隆抗体制备程序较为繁琐,本研究旨在以一种简便快捷的方式制备抗沙门氏菌Peg菌毛蛋白的单克隆抗体,并建立可检测鸡白痢沙门氏菌的玻板凝集方法。具体内容如下:1.抗沙门氏菌Peg菌毛单克隆抗体的简捷制备方法为研发沙门氏菌Peg菌毛单克隆抗体,本研究首次利用实验室构建的一种S9H-Peg靶标抗原重组菌株（其中S9H是一种泛性惰性载体菌株,保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCCNo.2091）作为免疫原,调整浓度至5×109 cfu/mL对6周龄BALB/c小鼠进行免疫,不需添加任何佐剂,剂量100μL/只,共免疫4次,每次间隔10 d。选取凝集抗体效价最高的3只小鼠,利用鼠杂交瘤细胞融合技术,获得产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。以S9H-Peg为阳性对照,以S9H作为阴性对照,通过玻板凝集试验技术筛选出能够产生特异性抗Peg菌毛单克隆抗体的5 株杂交瘤细胞,分别为:72-Ⅰ-F8、97-Ⅰ-E4、97-Ⅱ-B9、112-Ⅱ-F5、152-Ⅰ-D4。连续传代40代,测试杂交瘤细胞株分泌抗体的稳定性,最终获得3株稳定分泌抗Peg菌毛单克隆抗体杂交瘤细胞,其细胞上清凝集效价经检测均可稳定在1:2,依次命名为:97-Ⅰ-E4、97-Ⅱ-B9、152-Ⅰ-D4。分别制备小鼠腹水,并纯化。对三株单克隆抗体的特性进行测定包括:（1）抗体亚类测试,结果显示,三株单抗均为IgG2b/κ链;（2）抗体效价测定,玻板凝集法（S9H-Peg菌株作为凝集抗原,浓度为:5×109 cfu/mL）检测,结果显示,3株单克隆抗体效价分别为1:320、1:160和1:320;（3）特异性检测:①采用玻板凝集方法,利用实验室前期构建的,11种携带靶标抗原（包括沙门氏菌菌毛Peg、沙门氏菌菌毛Sef14、沙门氏菌菌毛Saf、沙门氏菌菌毛SipD、沙门氏菌Ⅰ型菌毛、大肠杆菌菌毛K88ac、大肠杆菌菌毛K99、大肠杆菌菌毛987P、大肠杆菌菌毛F18ab、大肠杆菌菌毛F18ac和大肠杆菌菌毛Sfm）的惰性载体菌株,对单克隆抗体的特异性进行验证。结果显示,三株单克隆抗体,都能够与Peg靶标（携带Peg菌毛的S9H-Peg）发生特异性凝集反应,而不与10种携带其他靶标抗原发生特异性凝集反应,与阴性对照菌株S9H（不携带Peg菌毛）也不发生凝集反应,显示了高度的特异性。②间接免疫荧光试验中,将所制备的单克隆抗体作为一抗,以羊抗鼠IgG-HRP为二抗,分别与S9H-Peg和S9H菌株对照共孵育,在荧光显微下观察,结果显示,制备的单抗能够特异性识别并结合S9H-Peg菌株,能够观察到菌体发绿色荧光;而不与S9H菌株对照结合,观察不到荧光。③Western blot分析显示,制备的单克隆抗体与表达Peg菌毛的阳性菌株（S9H-Peg）发生特异性反应,单克隆抗体可识别Peg菌毛的主要亚单位蛋白PegA,在20kDa处出现特异性条带;而与对照菌株S9H不发生反应,无特异性条带产生。本研究采用简捷方法成功制备了针对沙门氏菌Peg菌毛的单克隆抗体,该方法的简捷性主要体现在以下几个方面:（1）免疫原制备的简便（无需进行抗原的抽提或原核表达与蛋白纯化等复杂过程）;（2）免疫程序简单、耗时短,且无需佐剂;（3）抗体筛选过程方便快捷（仅需进行玻板凝集测试,而无需进行ELISA检测等复杂流程）。一定程度的简化了单克隆抗体的制备流程,减少了工作量,提高了单克隆抗体的制备效率。2.鸡白痢沙门氏菌玻板凝集检测方法的建立和初步应用上一章研究中成功获得了三种针对沙门氏菌Peg菌毛的单克隆抗体,经测试,三株单抗均具有玻板凝集特性,且前期试验表明,三株单抗叠加使用由于靶标抗原多个结合决定族,可以使抗原抗体结合更充分,提高反应敏感性,所以效果优于单独使用。基于上述试验背景,本章利用第一章制备的三株单克隆抗体（97-Ⅰ-E4、97-Ⅱ-B9、152-I-D4）,经稀释1:100倍,混合后建立了鸡白痢沙门氏菌玻板凝集方法。首先,对建立方法的敏感性进行测试,结果显示,该方法对鸡白痢沙门氏菌NCTC5776纯培养物的检出限为104cfu/反应。其次,对所建立检测方法的特异性进行验证,通过玻板凝集试验,利用表达Peg菌毛的沙门氏菌（包括:鸡白痢沙门氏菌NCTC5776、鸡白痢沙门氏菌ATCC700623）、不表达Peg菌毛的沙门氏菌（包括:鼠伤寒沙门氏菌STM 43-3、鼠伤寒沙门氏菌W32、圣保罗沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌36、猪霍乱沙门氏菌29、猪霍乱沙门氏菌U80、田纳西沙门氏菌）以及非沙门氏菌（包括:大肠杆菌APEC TW-XM、大肠杆菌ETEC C83901、大肠杆菌ETEC C83902、大肠杆菌ETEC C83903、大肠杆菌ETEC987P、大肠杆菌ETEC987P、大肠杆菌ETEC987P-X进行测试）,结果显示,该方法能够特异性检测表达Peg菌毛的沙门氏菌,而与不表达Peg菌毛的沙门氏菌及非沙门氏菌不存在任何交叉反应,特异性好。接着,进一步对该方法的临床应用进行了初步探索:（1）对模拟污染无菌饮用水的检测,向样品中人工污染不同浓度的沙门氏菌,再用所构建的方法进行检测,结果显示,当样品中污染量为102cfu/mL时,即可在预增菌后通过本方法检出鸡白痢沙门氏菌;（2）对模拟污染鸡饲料样品的检测,向无菌无抗生素的饲料样品中添加鸡白痢沙门氏菌NCTC5776单细菌。增菌后,对模拟污染的饲料进行检测,结果显示,经10小时增菌,该方法能够检测出饲料中的鸡白痢沙门氏菌污染,敏感度为4×104cfu/反应;（3）对临床疑似鸡白痢沙门氏菌感染的18只病鸡进行剖检病检测,无菌环境下研磨病灶脏器（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胆囊）制备样品,分别用传统方法和本研究构建的方法对样品中的沙门氏菌进行检测。结果表明,经过预增菌过程,应用建立的玻板凝集方法,从18份样品中共检出5份鸡白痢沙门氏菌阳性样品,经传统分离鉴定方法复检,二者结果相符。此外,传统分离鉴定方法过程较为繁琐,而本方法仅需对样品进行前增菌,即可用于检测,且玻板凝集反应仅需2min即可得到结果,方便快捷。显示了本方法良好的实用性。综上,利用实验室构建的S9H-Peg靶标抗原重组菌株,建立了一种单克隆抗体制备的简捷方法,该方法在抗原准备、免疫程序以及杂交瘤细胞筛选方面,均显示了极大的简便性。利用该方法,成功制备出3株针对沙门氏菌Peg菌毛的特异性凝集性单克隆抗体。此外,以三株单抗作为检测抗体,利用玻板凝集的方式建立鸡白痢沙门氏菌的快速检测方法,该方法特异性强、敏感度高。而后进行了人工模拟污染样品检测和临床样品检测,比较传统国标检测方法,新建立的方法能够实现对鸡白痢沙门氏菌的快速、准确检测。本研究提供了将携带外源抗原（Peg）的惰性载体应用于单克隆抗体制备与筛选的成功案例,为单克隆抗体的制备策略提供了新的思路与现实依据。同时,为以Peg菌毛为靶标的鸡白痢沙门氏菌诊断技术提供了物质材料与试验基础。
靳锴[2]（2021）在《鸡性别决定过程中SMAB2可变剪切体(SMAD2WΔ11)功能及其调控机制的研究》文中提出性别决定（Sex Determination）是一个复杂且可塑的发育过程,一直以来都是生物学,医学和畜牧学等领域的研究热点。研究性别决定的机制不仅对于理解生物的发育和分化具有重要意义,而且能够有效的提高经济动物的生产效率。尤其是鸡的性别与生产力关系极大,在家禽生产中,商品蛋禽中雌禽的生产效益远高于公禽;而在肉禽生产中,雄禽生长快,产肉多,饲料报酬均显着地高于雌禽。因此如果能够有效的控制鸡的性别,能够大幅提高其生产效率,并能够避免在出生时对雏鸡进行淘汰而带来的资源浪费和相关的伦理问题,其重要性和意义不言而喻。因此一直以来,建立高效和准确的性别控制方法都是家禽生产研究中的热点。然而,迄今为止鸡性别决定的具体机制仍不清楚,极大的制约了性别控制技术在家禽生产中的研究与开发,与此同时也影响了鸡作为模型在病毒学,胚胎学,发育生物学和转化医学等领域的应用,所以迫切的需要对其性别决定的机制进行深入的探索。近年来,研究表明可变剪切作为一种重要的调控方式不仅广泛的参与生物的生命活动,同时也深入的参与了性别决定过程,果蝇中Sxl和小鼠中Sry基因性别决定过程中均发现存在可变剪切的调控。虽然目前有研究指出在鸡胚胎发育过程中存在可变剪切事件,表明可变剪切事件参与了鸡胚胎的性别决定过程,然而可变剪切在鸡（或鸟类）性别决定过程中的作用与功能仍需进一步的探究。基于此,本研究利用最新的单分子实时测序技术PacBio Sequel Ⅱ与传统的二代测序技术Illumina HiSeq系统的研究了鸡胚胎性别决定过程中关键时间点的基因表达和两性可变剪切差异,发现并鉴定出鸡性染色体同源基因SMAD2在W染色体上存在特异性可变剪切表达SMAD2W△11,并通过体内外实验证明其在性别决定中的生物学功能,并对其机制进行了探究。为鸡（鸟类）性别决定机制的研究提供参考依据,并为后续深入研究鸡性别决定过程中其他基因可变剪切事件的功能和机制提供了了理论支撑。具体的研究结果如下:（1）多组学测序显示W染色体基因SMAD2在鸡胚的性别决定过程中存在特异表达的转录本对性别决定不同时期的雌雄胚胎（E0,HH Stage 1）,生殖腺（E3.5-E6.5,HH Stage 21-HH Stage 30）和性腺（E18.5,HH Stage 44）的组织样本进行二代测序,实验结果发现整体样本间的整体转录水平差异较小,进一步的分析显示两性之间在胚胎期（E0,HHStage 1）存在84个差异基因,其中在雄性中高表达基因37个,雌性中高表达基因47个,性染色体上基因62个（Z:30,W:32）;两性在生殖腺组织的决定过程中差异表达基因数目分别为122（E3.5,雄性40,雌性82）,59（E4.5,雄性14,雌性45）,59（E5.5,雄性22,雌性37）和124（E6.5,雄性46,雌性78）,其中性染色体上的差异基因分别为65个（E3.5,Z:27,W:38）,44 个（E4.5,Z:8,W:36）,22 个（E5.5,Z:1,W:21）和 53 个（E6.5,Z:16,W:37）;在性腺组织（E18.5,HHStage44）中存在 3000个差异基因,在雄性中高表达基因有1952个,雌性中高表达基因有1048个,其中性染色体上基因243个（Z:206,W:37）。对性别决定不同时期的雌雄胚胎（E0,HHStage 1）,生殖腺（E3.5-E6.5,HH Stage21-HHStage30）和性腺（E18.5,HH Stage 44）的组织样本进行混样,根据性别分为雌性和雄性两组进行建库和三代单分子实时测序（SMRT）。雄性SMRT文库共产生了共检测出56,844,862条Subreads,雌性SMRT文库共检测出53,056,064条Subreads。进一步的处理后获得26,089条雄性非冗余转录本,雌性23,889条非冗余转录本。对两性差异分析的结果显示两性全长转录本在性别决定过程中的常染色体上差异较小,但是在性染色体上差异较大,其中在雄性在Z染色体上的特异表达转录本为417条,W为0,而雌性在Z染色体上特异表达的转录本为208条,在W染色体上为60条,分析结果显示有12个基因在W染色体上存在雌性特异表达的转录本,分别是UBP2,UBE2R2,ZSWIM6,SPIN和SMAD2等基因。将三代测序结果与二代测序中不同时期和性别中的转录本表达量进行联合分析,发现W染色体上SMAD2基因存在特异的可变剪切,且在两性性别决定过程中存在表达差异。在胚胎发育的0天,两性Z染色体上SMAD2转录本的表达无差异,而在性别分化阶段（3.5天,4.5天,5.5天和6.5天）,雄性中SMAD2Z的转录本表达均高于雌性,与此同时,结果显示18.5天的生殖腺中雄性SMAD2Z的表达显着高于雌性。相反的是,在整个发育阶段,雄性中均未检测到SMAD2W的表达,在雌性中,SMAD2W在3.5天-6.5天均存在表达,在18.5天转录本的表达量较高。这些结果表明SMAD2Z和SMAD2W可能在鸡胚胎雌性发育中扮演不同的作用。（2）体内外研究SMAD2Z和SMAD2W可变剪切在鸡胚性别决定过程中的功能分别鉴定和克隆SMAD2Z和SMAD2W的全长及对应的可变剪切体,qRT-PCR结果发现在早期两性胚胎发育过程中两性SMAD2Z和雌性SMADW中的均存在可变剪切表达,其中两性中SMAD2Z的mRNA表达以SMAD2ZFL和SMAD2ZΔ3为主,雌性中SMAD2W的mRNA表达则是以SMAD2WFL,SMAD2W△3 和 SMAD2W△11 为主。进一步的 Northern Blot 结果证明 SMAD2W 可变剪切体SMAD2W△11在卵巢中真实存在且特异表达。在此基础上针对SMAD2Z和SMAD2W全长及其可变剪切体的序列成功构建对应的慢病毒过表达载体并验证活性,与此同时依据其共有序列部分构建了 3条SMAD2的干扰载体,并验证活性后选择干扰效率最好的载体进行慢病毒包裹。在体外成功分离了两性CEF细胞系并进行了进一步的培养和鉴定,分别在DF-1细胞和两性CEF细胞上对SMAD2Z全长和SMAD2W△11的功能验证,发现无论是在DF-1细胞上,还是在两性CEF细胞中,干扰SMAD2后,雄性相关基因的表达出现下降,而雌性相关的基因上升,过表达SMAD2Z后,出现了相反的现象。与此同时,过表达SMAD2W△11能够引起雌性相关基因的表达上升,而雄性相关基因的表达出现下降。通过在鸡胚上建立高效的鸡胚体内注射模型并进行功能验证,组织学观察的结果发现干扰SMAD2能够诱发性腺由雄性向雌性表型的性别反转（7/34,20.59%）,而过表达SMAD2W△11也会诱发性腺由雄性向雌性反转（10/46,21.73%）,而同时干扰SMAD2和过表达SMAD2W△11则能够进一步促进这种现象（23/41,56.10%）,与此相反的是单独过表达SMAD2Z,则会诱发性腺由雌性向雄性反转（21/44,47.73%）。Western Blot和qRT-PCR对性别相关基因的检测结果进一步验证了表型变化的准确性。这些结果共同表明SMAD2Z能够诱导胚胎向雄性决定,而SMAD2W△11则会诱导胚胎向雌性方向决定。（3）SMAD2W△11调节鸡胚雌性性别决定的分子调控机制探究分别构建SMAD2Z和SMAD2W△11的His标签原核融合表达载体,诱导表达和纯化后进行鉴定,通过His-Pulldown和质谱（MS）技术分别鉴定SMAD2Z和SMAD2W△11在卵巢和睾丸中的结合蛋白差异,发现差异蛋白集中在分化发育相关通路,激素合成和蛋白后修饰过程相关通路中,其中性激素合成通路关键基因CYP19A1在卵巢中与SMAD2W△11存在特异结合。通过Co-IP技术进一步验证了 His-Pulldown互作的准确性,并进一步的对CYP19A1在鸡胚性别决定过程中的功能进行验证。体内的验证结果表明,CYP19A1的过表达能够有效的促进鸡胚向雌性方向决定,而干扰则会导致鸡胚向雄性方向决定。综合上述结果可以得出推论,W染色体上特异的可变剪切体SMAD2△11能够通过结合CYP19A1促进鸡胚雌性性别决定过程,其具体的机制仍然有待进一步的研究。
魏柯[3]（2021）在《钙化性主动脉瓣病变内皮间质转化的表达及其调控研究》文中研究表明钙化性主动脉瓣疾病（Calcific Aortic Valve Disease,CAVD）是当今最常见的心血管疾病之一,给临床治疗和社会经济带来了巨大的负担。随着研究的深入,人们发现CAVD不仅是瓣膜退行性变与钙盐沉积导致的后果,其病变的病理过程还涉及内皮损伤、细胞分化、脂质浸润、慢性炎症、基质重塑、进展性钙化及新生血管形成等复杂变化的主动过程,细胞间的转化及一些基因的变异在其发生发展中也扮演重要角色。内皮间质转化（Endothelial-mesenchymal transition,EndoMT）在胚胎期心血管系统的发育、心脏纤维化、动脉粥样硬化和肺动脉高压等方面发挥着重要的病理生理作用,主动脉瓣内皮细胞（Valvular Endothelial Cells,VECs）在CAVD中也发生了向瓣膜间质细胞（Valvular Interstitial Cells,VICs）的表型和功能转变。然而,关于这一领域存在几个挑战,包括缺少对EndoMT在整个疾病过程中变化趋势的描述;缺乏完整准确的EndoMT定义,依靠传统方法无法识别已经发生完全EndoMT的细胞;以及无法追踪研究发生了 EndoMT的细胞功能与发病机制。因此,利用人病变标本和CAVD动物模型详细描述EndoMT在钙化性瓣膜病发生发展过程中的表达;改进造模周期过长的传统CAVD动物模型并结合遗传谱系示踪技术追踪瓣膜内皮细胞在疾病过程中的变化,进一步探究发生部分与完全EndoMT细胞的功能;分析挖掘CAVD患者瓣膜样本测序数据,并用传统分子生物学实验技术研究可能影响EndoMT和CAVD的关键靶点基因,对于明确EndoMT在钙化性瓣膜病中的作用具有十分重要的意义,也为疾病的预防干预提供新的策略。既往研究多局限于组织样本层面和体外细胞实验,还没有研究利用在体CAVD动物模型去研究EndoMT在CAVD疾病进展早期与晚期的表达与作用。所以本研究第一部分构建了兔和小鼠的CAVD动物模型,分别在疾病过程的不同时期进行主动脉瓣标本取材和观察,最后结合人源主动脉瓣钙化样本,在病理及分子层面验证CAVD病程中EndoMT的表达。第一部分构建了传统的动物模型并观察了疾病过程中EndoMT的表达,然而传统CAVD小鼠模型存在造模时间长,成功率低等问题,所以本研究结合高脂小鼠模型和导丝损伤小鼠模型的经验,开发构建与临床病程更相符且造模周期短、成功率高、一致性好的CAVD小鼠模型。学界中对EndoMT在CAVD过程中的作用仍存在争议,遗传谱系示踪技术是研究发育和疾病过程中细胞来源、转化、分化的最直接强力的证据,因此,本研究又建立了内皮细胞谱系示踪小鼠,并结合之前的CAVD动物建模方法,初步观察了瓣膜内皮细胞在谱系示踪小鼠病变过程中的命运及转化。目前尚无非手术方法预防或治疗钙化性主动脉瓣疾病,这在很大程度上是因为我们对疾病机制的了解有限。前两部分的研究发现了 EndoMT对CAVD起到一定作用,EndoMT的本质是构成主动脉瓣的两类细胞VECs和VICs的相互作用和转化,本研究的第三部分分析挖掘前期人类钙化瓣膜测序数据,找到了可能干预的钙化关键基因DUSP1和与EndoMT有关的基因PDK4,通过体外实验对两种基因的功能和相关通路进行了研究,结果提示DUSP1可以抑制VICs的钙化,敲低PDK4抑制了VECs的EndoMT过程,为CAVD的治疗提供了新的潜在靶点。第一部分:内皮间质转化在钙化性主动脉瓣膜中的表达背景:钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）是世界范围内严重威胁心血管健康的疾病,其发病机制不明。内皮间质转化（EndoMT）在胚胎期主动脉瓣的发育中发挥重要作用,成年后钙化性主动脉瓣疾病的发生发展可能与EndoMT这一过程的重新激活有关。EndoMT可能是CAVD疾病预防和治疗的一个有价值的治疗靶点,本研究拟探讨EndoMT及相关转录因子在不同物种钙化主动脉瓣膜组织中的表达变化。方法:收集临床中钙化瓣膜和正常瓣膜标本做EndoMT现象的验证;构建兔CAVD模型,分别于4周、8周、12周对高脂组及对照组兔主动脉瓣组织进行取材;构建单纯高脂喂养载脂蛋白E敲除（Apolipoprotein E,ApoE-/-）小鼠CAVD模型,分别在8周、16周、20周、24周、28周、32周、36周、40周对小鼠主动脉瓣膜进行取材。改良钙化瓣膜脱钙方法,通过H&E、Masson染色观察瓣膜形态结构;通过茜素红和Von Kossa染色评估瓣膜钙盐沉积情况,通过免疫组化和免疫荧光法检测内皮标志物CD31、VE-cadherin与间质标志物αSMA、vimentin及EndoMT转录因子SNAIL1/2的共定位表达情况。在分子层面分别检测人源和小鼠主动脉瓣标本中与EndoMT相关的RNA表达水平。结果:人和兔的钙化主动脉瓣切片内皮区域有内皮和间质标记物共表达区域;钙化组小鼠瓣膜切片有EndoMT转录因子高表达区域。与正常瓣膜相比,人和小鼠钙化瓣膜中内皮、间质标记及EndoMT相关转录因子在RNA表达水平上存在显着差异。结论:本研究利用人源主动脉瓣样本及兔和小鼠CAVD动物模型样本在病理及分子层面验证了 CAVD中EndoMT现象的存在,并且连续时间点检测小鼠内皮和间质标志物,其变化趋势反映EndoMT随着疾病进程逐渐加重。第二部分:钙化小鼠模型的改良与内皮细胞谱系示踪小鼠模型的构建及其内皮间质转化的表达背景:传统的高脂喂养CAVD小鼠模型造模周期长,出现主动脉瓣的狭窄和钙化的比例不高;而导丝损伤CAVD小鼠模型机械损伤较重,手术难度及死亡率高,且急性损伤模型的病理生理与临床慢性病变过程差别大,需要一种成型时间快,病理过程与临床类似的动物模型。EndoMT在主动脉瓣病变中的作用仍缺少关键性的直接证据,需要特异性内皮细胞谱系示踪小鼠来证明EndoMT在钙化性主动脉瓣疾病中的作用。方法:构建导丝损伤联合高脂喂养ApoE-/-小鼠,并与单纯导丝损伤小鼠对比,分别于4周、8周、12周、16周对模型小鼠进行超声评估并取材,通过H&E、Masson染色观察瓣膜形态结构,通过茜素红染色评估瓣膜钙盐沉积,免疫荧光法检测内皮与间质标志物的共定位表达情况,比较不同模型的造模效果。构建一种内皮特异性表达红色荧光蛋白（Red Fluorescence Protein,RFP）的谱系示踪ApoE-/-小鼠,采用单纯高脂喂养及高脂联合导丝损伤的方法诱导小鼠主动脉瓣钙化。结果:相比单纯高脂喂养和单纯导丝损伤小鼠,导丝损伤联合高脂喂养ApoE-/-小鼠CAVD模型的主动脉流速明显增快,出现钙化时间更早,在8周出现主动脉瓣钙化。成功构建内皮细胞谱系示踪ApoE-/-小鼠,高脂喂养8周后及导丝损伤4周后有a SMA与RFP共定位现象,提示EndoMT现象。结论:导丝损伤联合高脂喂养ApoE-/-小鼠是一种成型快,造模效果好,一致性高的改良CAVD小鼠模型,优化了既往CAVD小鼠动物模型,扩展了其应用,为CAVD的基础研究提供了一种合适可靠的动物模型。本研究首次利用内皮细胞谱系示踪小鼠进行CAVD小鼠建模,为EndoMT在CAVD发病和疾病进展中的作用提供了新的强力证据。第三部分:DUSP1与PDK4在CAVD中的表达及相关机制探究背景:CAVD的发病机制不明,手术与介入仍是其治疗的唯一手段,预防或减缓CAVD进展的非手术治疗的分子机制或靶点仍然难以找寻,需要利用临床样本和动物模型筛选及验证潜在干预靶点。方法:利用人钙化主动脉瓣和正常主动脉瓣的mRNA测序及单细胞转录组测序结果筛选差异基因,结合外部组织验证及文献回顾确定了在钙化组显着下调的2个基因DUSP1和PDK4。利用CAVD小鼠模型组织切片探究DUSP1在主动脉瓣上的时空分布。采集正常主动脉瓣膜用胶原酶法消化获取人原代主动脉瓣间质细胞（VICs）,用磁珠法分选获取主动脉瓣内皮细胞（VECs）。对VICs促钙化培养后在不同时间点检测DUSP1、PDK4及相关钙化标记物的变化趋势。利用siRNA抑制DUSP1的表达后检测其对VICs成骨转化过程的影响。利用腺病毒载体对VECs进行PDK4的过表达及敲低后用TGF β诱导VECs发生EndoMT,检测转染后细胞内皮、间质标记及EndoMT转录因子的变化情况。结果:免疫荧光染色提示DUSP1主要分布于主动脉瓣的心室侧;连续7天观察促钙化培养后VICs的DUSP1及PDK4变化趋势,发现DUSP1早期显着上升,后期下调,PDK4早期显着下调后持续下调。siRNA抑制DUSP1后BMP2表达上调,3天后茜素红染色与对照组相比着色较深,茜素红定量有显着差异;腺病毒过表达PDK4后促进VECs的EndoMT,敲低PDK4后抑制TGF β诱导VECs的EndoMT。结论:敲低DUSP1加速VICs的钙化,过表达PDK4后促进VECs的EndoMT,敲低PDK4可以抑制TGF β诱导VECs的EndoMT过程。体外实验提示DUSP1对VICs的钙化有保护作用,敲低PDK4抑制了 VECs的EndoMT过程,为以后针对EndoMT的干预及预防治疗CAVD的药物研究提供靶点。
程爽爽[4]（2019）在《香菇优良菌株的选育》文中研究表明我国既是香菇生产大国,也是香菇消费大国,随着人民生活水平的不断提高,人们对香菇的品质要求越来越高,传统的栽培模式及生产品种远不能满足市场的需求。因此,选育高品质香菇新品种是迫在眉睫。本研究选取不同特性香菇品种及优良野生菌株为亲本,采用单单杂交及单双杂交共获得2509株杂交菌株。根据其菌丝生长和农艺性状多指标选出优良杂交菌株13株。主要研究结果如下:（1）单核菌株的分离及筛选由13个亲本经单孢分离获得724株单核菌株。采用菌丝生长速率、菌落类型、菌落长势和生长指数4个指标,对单核菌株进行选择,筛选出187株优良单核菌株。（2）香菇杂交及初筛依据亲本特性设计了21个杂交方案获得2509株杂交菌株。根据杂交菌株的生长速率、菌落类型、生长指数、萌发期和上料时间等指标,选出优良杂交菌株750株。（3）香菇菌株的农艺性状测定对选出的750株杂交株及本研究室已有诱变菌株共1057株进行了栽培研究,经菌丝生长情况及子实体形成时间及温度、每袋产量、成菇数量、单菇质量、菇形和硬度的等指标测定,选出了出菇早、产量高、菇形较好、硬度大的优良菌株13株。（4）优良菌株鉴定经拮抗试验、酯酶同工酶电泳研究,本研究选出的13株优良菌株为优良杂交菌株。
常雪娇[5]（2018）在《红螯螯虾TRIM32抑制白斑综合征病毒感染机制研究》文中研究指明二十世纪七十年代以来,水产养殖的科技进步,推动了沿海养殖业的兴起。在十大水产品生产国中,中国居于首位。根据中国渔业统计年鉴数据,我国渔业经济总值逐年上升,并且养殖业占有巨大的比例。截至2016年,全国对虾养殖总产量达127.17万吨。但是,随着渔业的迅速发展,养殖过程中的疾病频发给整个虾类养殖产业带来了巨大的经济损失。目前,国内外虾类养殖中,危害最大的病毒是白斑综合征病毒,白斑综合征病毒（White spot syndrome virus,WSSV）是一种无包涵体、具囊膜、一端有尾巴结构的杆状双链DNA病毒。WSSV宿主范围广、传染能力强、致死率极高,给全球不同虾类养殖业造成重创。鉴于没有适于WSSV增殖的对虾细胞系,WSSV致病机理及宿主的抗病毒免疫机制仍知之甚少。基于前期对虾白斑病毒（White spot syndrome virus,WSSV）感染红螯螯虾（Cheraxquadricarinatus）后的转录组数据分析发现,红鳌螯虾在感染 WSSV 12 h 后其 TRIM32（Tripartite motif-containing 32）显着上调。作为一种参与泛素化修饰的重要蛋白,TRIM32在甲壳动物抗病毒方面的功能暂不明确。TRIM是一类高度保守的蛋白,参与细胞增殖、分化、发育、凋亡、肿瘤抑制、细胞自噬和抗病毒免疫反应等等过程。其中,TRIM32的抗病毒功能越来越受到关注。而在无脊椎动物中,TRIM32是否也具有抗病毒功能暂未见相关报道。为了进一步表征CqTRIM32在红螯螯虾抗WSSV感染中的作用,我们克隆了CqTrim32的cDNA全长序列。多序列比对显示CqTrim32含有保守的RING-finger结构域,但没有B-BOX结构域和卷曲螺旋区结构域,这与传统的TRIM家族蛋白有所不同。系统发育树构建表明,CqTrim32是作为一个独立的分支,没有近缘关系的物种。运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对健康红螯螯虾CqTrim32组织分布特征进行分析,结果显示,Trim32在不同组织器官均有不同程度表达,其中,在肌肉和神经中的表达量最高,Hpt组织中次之。红螯螯虾注射WSSV后,Hpt组织CqTrim32在24h和48h的表达量显着上调。同时,体外培养的Hpt细胞感染WSSV 12 h和24 h后,CqTrim32的mRNA转录水平显着上调;利用双链RNA干扰技术对Hpt细胞中的CqTrim32进行敲降,WSSV的早期表达基因IE1和晚期囊膜蛋白表达基因VP28的转录水平在6h显着上调。利用原核表达载体pMal-C2x进行蛋白表达和MBP beads进行亲和层析纯化,利用western-blot进行纯化后蛋白的鉴定,结果表明:成功表达并纯化pMal-C2x-TRIM32,可以用于后续的实验。在rCqTRIM32的重组蛋白转染实验中,在病毒感染6h时,病毒转录复制受到显着抑制,这进一步表明CqTRIM32在WSSV感染Hpt细胞的过程中发挥抗病毒作用。利用细胞免疫荧光技术检测了病毒感染后Hpt细胞泛素化的变化情况,结果表明在随着WSSV感染Hpt细胞的过程中泛素化的强度增加,与此同时,在CqTrim32干扰后检测其泛素化的强度,发现敲降CqTrim32细胞中的整体的泛素化水平降低,表明CqTRIM32参与了其泛素化的过程。Pulldown分析结果表明,CqTRIM32蛋白可以与WSSV囊膜蛋白VP28互作,这暗示CqTRIM32可能直接通过与病毒囊膜蛋白VP28直接相互作用,并介导泛素化过程来促进病毒的降解,是一种抑制病毒感染的关键因子。
董平[6]（2018）在《丘脑网状核介导皮层丘脑通路在防御性逃跑行为的神经环路研究》文中指出恐惧是一种当面临可能会对生存产生威胁的刺激时产生的情绪反应,而对危险性刺激产生迅速有效的应对是保障一个物种的生存和延续的关键。当动物认为该危险刺激源是可以控制或者躲避的时候,动物一般会倾向采取主动防御策略,即逃跑行为（flight）,然而当该危险刺激源是无法控制或者躲避的时候,动物则更倾向采用被动防御策略,如冻结行为（freezing）。目前关于freezing相关的环路机制的研究相对较多,而关于flight相关的环路研究则相对较少。丘脑网状核（Thalamic reticular nucleus,TRN）是一个 γ-氨基丁酸能（γ-aminobutyric acid,GABA）神经元富集的核团,主要负责整合和调控丘脑和皮层之间的信息的传递。TRN被认为参与感觉运动处理、睡眠节律及注意力等过程。早期的研究认为TRN是一个同质性很高的核团,但是越来越多的证据都表明TRN不同亚区的神经元结构和功能上存在异质性。位于TRN的前背侧的边缘区丘脑网状核（limbic TRN）,与位于TRN的后侧的感觉区丘脑网状核（sensory TRN）从神经元结构和功能上都存在着差异。近来有研究发现,TRN还被发现参与调节恐惧学习的过程,但是其在恐惧行为中的具体作用环路机制尚不清楚。除此之外,TRN还接受来自调节防御性行为的关键核团的投射（如前额叶皮层,杏仁核等）,但是这些核团具体是投射到TRN的什么区域?具体是哪种类型的神经元?在全脑尺度上,TRN不同亚区多对应的上游输入及下游输出神经环路又是如何组成?这些上下游核团又是如何通过TRN进而影响动物的主动或者被动防御性行为呢?关于这些,我们知之甚少。为了研究以上科学问题,首先,我们利用光纤记录了 TRN的PV神经元群体的钙信号活性在条件性逃跑行为中的变化,我们发现是limbic TRN而不是sensory TRN中的PV 阳性神经元活动的升高与防御性逃跑行为的出现呈正相关。然后,我们通过光遗传学激活或抑制limbic TRN中PV 阳性神经元可以双向调控动物防御性逃跑行为的启始。然后,我们利用逆向跨单突触病毒、顺向标记病毒分别追踪了 limbic TRN和sensory TRN的全脑输入和输出环路,发现limbic TRN中的PV阳性神经元既接受来自前扣带回皮层（Cingulate cortex,Cg）中的谷氨酸能神经元输入,又抑制性投射至丘脑内背侧核（Mediodorsal thalamic nucleus,MD）。最后,我们通过细胞类型特异的三级环路追踪方法绘制了 TRN不同亚区的输入-输出三级环路,并通过结合光遗传学、药理学和电生理的方法证明激活Cg→limbic TRN→MD这条三级环路能够启始防御性逃跑行为,并且limbic TRN对MD的抑制性输出在逃跑行为中是必须的。通过本研究,我们首次揭示了 limbic TRN是如何通过介导皮层到丘脑的神经环路调控了动物的逃跑行为,相信进一步的研究可以帮助我们了解恐惧行为发生的机制,也为我们理解与焦虑和恐惧紊乱等临床等疾病的发病机理提供新的思路。
高培丽[7]（2017）在《产胞外多糖南极微生物的筛选及其胞外多糖的应用研究》文中研究表明胞外多糖（exopolysaccharide,EPS）是微生物在生长过程中分泌到周围环境中的由多种单糖组成的大分子物质,具有来源广、易与菌体分离等优点。极地微生物的胞外多糖具有许多不同的生物活性和新颖的化学结构,在医药、食品加工、化工等领域具有广阔的应用前景。本文采用苯酚硫酸法和醇沉法从10种不同的南极泥沙沉积物样品中共筛选到132株产不同胞外多糖量的菌株,其中（A）产量低于20 mg/L的有7株,占产EPS菌株的5.3%;（B）产量在20-60 mg/L的有25株,占产EPS菌株的18.94%;（C）产量在60-100 mg/L的有79株,占产EPS菌株的59.85%;（D）产量高于100 mg/L的有21株,占产EPS菌株的15.91%。其中来自不同筛选样品、不同筛选批次产EPS量相对较高菌株W38-8、W29-21、W32-2、W13-13、W38-16、W32-3、W14-6、W18-3 和 W20-15,产量最高的三株菌分别为 W38-8、W29-21、W32-2,对应的 EPS 产量分别为 144.22 mg/L、125.61 mg/L、109.56 mg/L。经过16SrDNA基因序列比对鉴定,这9株菌分别是 Lotanella salsilacus,Rheiimeraa soli,Shewanella frigidimarina,Planococcus halocryophilus,Marinobacter sp.,Shewanella sp.,Pseudomonas stutzeri,Planococcus halocryophilus,Flavobacterium sp.。在筛选的基础上,本论文针对培养条件较稳定的W32-2菌株（Shewanella frigidimarina,EPS 产量为 109.56 mg/L）,从多糖理化性质及体外抗氧化活性、多糖对彩虹鲷非特异性免疫活性影响及EPS生产的发酵工艺等三个方面开展深入研究。采用Sevage法除蛋白后,考马斯亮蓝测定结果表明,W32-2粗多糖的蛋白含量仅为0.5%;硫酸咔唑法测得W32-2胞外多糖的糖醛酸含量为8.46%;明胶比浊法测得EPS的硫酸基含量为83.35%,为酸性多糖。DPPH和超氧阴离子清除实验结果显示,W32-2产生的EPS对DPPH有一定的清除能力,当质量浓度为0.5mg/mL时,抗氧化能力最强,对DPPH的清除能力达60.43%,对超氧阴离子的清除率达70.03%。菌株W32-2所产EPS对彩虹鲷血液的非特异性免疫酶活初步实验结果表明,该EPS在一定程度上可以提高彩虹鲷非特异性免疫酶活。实验条件为:a)EPS浓度为3 mg/mL,b)EPS浓度为5 mg/mL,c)pH7.4的1×PBS,注射剂量均为0.1mL,分别在注射后第3 d、5 d、7d、14d、21d和28d测其血清酶活。测试数据表明,注射EPS浓度为3 mg/L实验组的免疫增强效果较好。在整个实验期间,AKP活性最高是对照组的2.29倍,且在第三天达到最大;在实验第7 d时ACP酶活比对照组提高了 51.18%,且SOD活力达最大值;在第14 d时,实验组比对照酶活提高了 33.25%;在第3d时,实验组的CAT酶活比对照提高了 57.64%。该结果表明,菌株W32-2产生的EPS具有作为免疫添加剂的潜力。通过单因子变量实验,确定W32-2产EPS的最佳碳源为果糖,最佳添加量为4%;最佳氮源为酵母提取物,最佳添加量为2%;最佳培养基初始pH值为9;最佳发酵温度为10℃;最佳装液量为150/500 mL;最佳接种量为3%。以上的研究结果为南极产EPS微生物的种类多样性提供了研究基础,对所筛选的冷海希瓦氏菌W32-2所产EPS的理化性质及生物活性进行了研究探索,并对南极菌株EPS作为免疫添加剂的水产养殖应用,及小试发酵生产工艺提供了理论和实践依据。
王青遥[8]（2015）在《联苯环辛二烯类木脂素衍生物制备及其部分生物活性研究》文中研究指明本论文主要由三部分组成。第一部分为前言,主要论述了五味子酚这类联苯环辛二烯类木脂素的研究现状和研究意义。第二部分为本论文中的实验部分,其中化学研究工作分为以五味子酚为代表的联苯环辛二烯类木脂素衍生物的制备和有机合成方法学研究,衍生物生物活性评价包含了衍生物的抗烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）活性、抑菌活性和抗肿瘤活性等。第三部分为本论文的小结与讨论。五味子酚是联苯环辛二烯类木脂素中极具代表性的一种,相比其他联苯环辛二烯类木脂素,五味子酚的生物活性研究主要集中在抗氧化作用及保肝活性方面,其衍生物的制备及其生物活性研究报道较少。基于本课题组前期研究工作中首次发现的具有明显抗TMV活性的天然产物五味子酚、五味子醇甲和五味子乙素,本论文在对该类活性成分进行结构修饰的基础上,并对所得衍生物进行了抗TMV活性为代表多方面的生物活性评价的研究工作。本论文利用拼合原理等新药设计方法设计合成以五味子酚衍生物为主的产物33个,其中包括拼合原理设计产物10个,调节极性产物7个,脱甲氧基产物11个和其他反应产物5个。在衍生物制备的过程中,发现了在碱金属/醇反应体系中脱卤脱甲氧基的化学合成方法。围绕这一线索,通过大量的文献调研,本论文对此方法学进行了系统的研究,确定了该方法的可行性并对该方法的反应机理进行了阐述为脱卤脱甲氧基反应提供了新的合成方法。在化学工作的基础上,本论文对合成的部分衍生物进行了抗TMV活性和抑菌活性的筛选评价工作。抗TMV活性筛选结果表明,五味子酚衍生物具有较强的烟草花叶病毒治疗活性（在0.15 mM浓度时,衍生物W-2的治疗活性为78.0±3.8%;在0.25 mM浓度时,衍生物W-7的治疗活性为64.2±9.4%;在0.5 mM时,衍生物W-16的治疗活性为64.8±6.0%）和保护活性（在0.15 mM浓度时,衍生物W-6的保护活性为83.6±8.8%;在0.5 mM浓度时,衍生物W-2的保护活性为71.5±4.0%）。对部分五味子酚等衍生物进行抑制烟草青枯菌活性筛选,筛选结果显示最高的抑制率小于15%,表明该类衍生物抑菌活性不明显。通过MTT法考察了制备衍生物对人肺癌细胞株A549和人白血病细胞株K562增殖的抑制活性,结果显示部分衍生物对这两种细胞株增殖具有微弱的抑制作用。
徐进新[9]（2012）在《SNX16和SNX11的结构生物学研究》文中研究指明Sorting nexins（SNXs）是一类含有SNX-PX结构域,并在膜泡运输中发挥重要作用的蛋白。PX结构域能与磷脂酰肌醇结合,并介导含有PX结构域的蛋白与富含特定磷脂酰肌醇的膜结合。目前在哺乳动物中已经发现了33种SNXs,有些SNXs只含有PX结构域；有些除了含有PX结构域还含有其他结构域。根据结构域的组成,SNXs可以分为：SNXPX、SNXPX-BAR和SNXPX-other。Sorting nexin16（SNX16）属于SNXPX-other,它除了含有PX结构域外,在C端还有一个Coiled coil结构域。有研究表明,SNX16既能结合初级内体也能结合次级内体,并在表面生长因子受体（EGFR）由初级内体向次级内体的运输中发挥着重要的作用。在果蝇的神经细胞中,SNX16参与突触生长受体（synaptic growth receptor）的运输和突触生长信号传递的调节。研究还表明,SNX16与水泡口炎病毒感染、膀胱癌和丙肝病毒的复制有关,SNX16可能是治疗这些疾病的潜在靶标。目前SNX16发挥功能的分子机制还不清楚,为了更好的了解SNX16执行功能的结构基础,我们开展了SNX16的结构生物学研究。我们解析了SNX16的一个片段（SNX16100-278,氨基酸从100刘278）的3.3A（空间群P21）和3.35A（空间群P212121）的晶体结构。SNX16100-278形成稳定的、剪刀状的二聚体。SNX16100-278包含PX结构域和Coiled coil结构域。二聚体中,两条链的Coiled coil结构域形成平行的左手超螺旋结构。通过结构分析和分子对接,我们发现SNX16100-278二聚体中PX结构域和Coiled coil结构域共同组成独特的PI3P结合口袋。通过将SNX16-PX和高同源性的nCISK-PX结构域进行比对分析,我们发现PX结构域中PPII/a2的构象可调节传统的磷脂酰肌醇结合口袋的大小,并进而决定PX结构域与磷脂酰肌醇结合的特异性。SNXPX是一类仅含有PX结构域的SNXs蛋白。目前认为SNX3、SNX10、 SNX11、SNX12、SNX22和SNX24都属于SNXPX。结构研究也表明,Grd19p（酵母SNX3）、SNX12和SNX22除了具有传统的PX结构域外,不含有其他的结构域。最近一些SNXPX蛋白的生物学功能也开始被研究。SNX3参与组成retromer复合物,调节Wntless的循环运输。SNX10具有诱导细胞成泡的功能。但是这些蛋白发挥功能的结构基础还不知道。进一步的研究发现,SNX10中单独的传统PX结构域并不具备诱导细胞成泡的功能,传统PX结构域下游的31个氨基酸也是SNX10发挥功能所必须的。为了探明SNX10传统PX结构域下游的31个氨基酸是否具有结构,以及SNX10传统PX结构域和下游的31个氨基酸在结构上是如何组织的。我们对SNX10和SNX10的同源蛋白-SNX11（SNX10和SNX11的氨基酸序列有52%的一致性）进行了结构生物学研究。我们没有获得SNX10的晶体,但我们获得了SNX11两个片段（SNX11-142C和SNX11-170C）的晶体结构。通过分析SNX11-170C的结构,我们发现在SNX11传统PX结构域的下游有2个α螺旋（α4和α5）,这两个螺旋与上游传统PX结构域形成紧密的球状结构。据此,我们推测SNX11-170C可能代表了一个新的PX结构域,我们称之为PX-extended（PXe）结构域。通过序列分析,我们推测SNX10可能也具有这个新的PXe结构域。
李旭[10]（2012）在《拟南芥蓝光受体隐花素CRY2光激发机理和功能的生化分析》文中研究说明蓝光受体隐花素Cryptochrome （CRY）是一类光裂解酶类似的黄素蛋白,介导了植物和动物的各种光响应,但是其光化学机理还不是很清楚。有研究者提出隐花素的光激发牵涉到生色团黄素腺嘌呤二核苷酸Flavin adenine dinucleotide（FAD）依赖蓝光的光还原反应,此还原反应是通过蛋白内进化上高度保守的三个色氨酸组成的电子传递链完成的,这三个保守的色氨酸被定义为色氨酸三联体。色氨酸三联体高度保守于光裂解酶/隐花素家族中,其在光还原中的功能是首次在光裂解酶中发现的,但到目前为止已有研究证明依赖色氨酸三联体的光还原反应与光裂解酶体内光依赖的酶活性没有相关性。最近的研究还证明依赖色氨酸的光还原反应不是动物I型隐花素体内光依赖活性所必需的,但是对拟南芥隐花素Cryptochrome1（CRY1）的一些研究结果支持依赖色氨酸的光还原决定了植物的生理功能。为了研究植物隐花素的光激发机理,我们将拟南芥隐花素Cryptochrome2（CRY2）的色氨酸三联体逐个突变,通过对突变的隐花素CRY2光化学和生理学活性的分析来研究以上提出的光还原假设,得到以下几点结论：（1）证明了色氨酸三联体确实参与了隐花素CRY2体外的光还原反应,但是在所有被检测的生理生化活性中,包括幼苗去黄化响应、成株开花、CRY2依赖蓝光的降解活性及蛋白与蛋白的互作,没有一个在色氨酸突变体中被消除,表明依赖色氨酸三联体的光还原反应不是拟南芥隐花素CRY2功能必需的。（2）一些CRY2色氨酸突变体（如CRY2W374A）在被检测的生理响应中呈现出组成型活性,变得更活跃。CRY2W374A突变体蛋白与CRY2信号蛋白Suppressor of PHYA1（SPA1）和Cryptochrome-Interaction Basic Helix-Loop-Helix （CIB1）不依赖蓝光互作,其组成型相互作用支持了光诱导隐花素构象改变的假说,从生物化学角度解释了为什么CRY2色氨酸突变体能够在没有光的条件下组成型活跃。（3）真核体系表达的拟南芥CRY2蛋白结合生色团FAD并保持了蓝光受体的活性,在体外响应蓝光,受蓝光诱导形成二聚体或多聚体,并且ATP能够促进CRY2的二聚化或多聚化,证明蓝光促使CRY2构象的改变。CRY2W374A突变体蛋白在黑暗和蓝光下均能以二聚体形式存在,蓝光能够促进突变体蛋白的二聚化和多聚化。（4）首次发现植物隐花素在体外蓝光特异的蛋白与蛋白互作现象。体外CRY2-CIB1复合体的形成依赖于蓝光与FAD,与体内反应一致。突变体蛋白CRY2W374A在体外能与CIB1持续性结合,支持蓝光诱导CRY2构象的改变,突变体CRY2W374A更接近构象改变后的CRY2.（5）限制性蛋白水解实验首次揭示蓝光能够诱导体外CRY2构象改变,被激活的CRY2空间构象类似于组成型突变体CRY2W374A。鉴定到蓝光诱导CRY2构象改变的位置位于CRY2C端结构域,靠近保守基序DAS中STAESSS序列。光诱导CRY2构象改变正好解释了依赖蓝光的CRY2-CIB1、CRY2-SPA1的相互作用,支持光诱导CRY2PHR-CCT解离论。（6）不同类型细胞中的CRY2有可能拥有不同的生理功能,不同的功能间（如促进光周期控制的开花,抑制下胚轴生长等）存在不同的调控机理。本论文构建的转基因植物：组织特异性启动子启动荧光蛋白GFP、mRNA结合蛋白PABP、隐花素CRY1、CRY2基因的表达,为进一步研究隐花素纵多功能的调控机理和信号传递途径提供了丰富材料。
二、W32/Toget@MM病毒出现（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、W32/Toget@MM病毒出现（论文提纲范文）
（1）抗沙门氏菌Peg菌毛单克隆抗体制备的一种简捷方法与初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 文献综述 |
| 综述一 沙门氏菌Peg菌毛研究进展 |
| 1 peg基因特点 |
| 2 Peg菌毛分泌组装过程 |
| 3 Peg菌毛的表达 |
| 4 Peg菌毛致病性 |
| 5 Peg菌毛潜在应用前景 |
| 综述二 单克隆抗体的研究进展 |
| 1 单克隆抗体的特征 |
| 2 单克隆抗体制备技术 |
| 2.1 鼠杂交瘤技术 |
| 2.2 噬菌体展示技术 |
| 2.3 转基因小鼠技术 |
| 2.4 新兴单B细胞RT-PCR技术 |
| 3 单克隆抗体的溯源分类 |
| 3.1 鼠源性单克隆抗体 |
| 3.2 嵌合型单克隆抗体 |
| 3.3 人源化单克隆抗体 |
| 3.4 全人源单克隆抗体 |
| 4 单克隆抗体的应用 |
| 4.1 单克隆抗体在病原体检测中的应用 |
| 4.2 双特异性单克隆抗体在病原体检测中的应用 |
| 4.3 携带式单克隆抗体在病原体检测中的应用 |
| 4.4 纳米单克隆抗体在病原体检测中的应用 |
| 4.5 Fc修饰性单克隆抗体在病原体检测中的应用 |
| 4.6 DNA/RNA编码单克隆抗体在病原体检测中的应用 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 第一章 抗沙门氏菌Peg菌毛单克隆抗体的简捷制备方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系、实验动物与细菌菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 相关溶液的配置 |
| 2 方法 |
| 2.1 免疫原的制备 |
| 2.2 免疫实验动物 |
| 2.3 细胞融合 |
| 2.4 杂交瘤细胞株筛选 |
| 2.5 杂交瘤细胞的亚克隆与效价检测 |
| 2.6 杂交瘤细胞的冻存和复苏 |
| 2.7 腹水的制备与纯化 |
| 2.8 单克隆抗体特性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清效价监测结果 |
| 3.2 细胞融合 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞筛选 |
| 3.4 阳性细胞亚克隆与效价检测 |
| 3.5 腹水的制备 |
| 3.6 单克隆抗体的特性检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡白痢沙门氏菌玻板凝集检测方法的建立和初步应用 |
| 1 材料 |
| 1.1 细菌菌株、材料、样品 |
| 1.2 培养基与配方 |
| 1.3 主要仪器与设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 沙门氏菌玻板凝集检测方法的建立 |
| 2.2 玻板凝集检测方法敏感性测定 |
| 2.3 玻板凝集检测方法特异性测定 |
| 2.4 玻板凝集检测方法的初步临床应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 敏感性检测结果 |
| 3.2 特异性检测结果 |
| 3.3 对模拟污染瓶装水检测结果 |
| 3.4 对模拟污染饲料的检测结果 |
| 3.5 对临床鸡场病鸡样品中沙门氏菌的检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）鸡性别决定过程中SMAB2可变剪切体(SMAD2WΔ11)功能及其调控机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 鸡性别决定研究进展 |
| 1.1.1 鸡性别决定概述 |
| 1.1.2 鸡性别决定相关基因研究进展 |
| 1.1.3 激素参与鸡性别决定研究进展 |
| 1.1.4 鸡早期性别鉴定和控制技术研究进展 |
| 1.2 测序技术及其在鸡性别决定研究中的进展 |
| 1.2.1 测序技术简介 |
| 1.2.2 测序技术在鸡性别决定研究中的应用 |
| 1.3 可变剪切的研究进展 |
| 1.3.1 可变剪切研究概述 |
| 1.3.2 可变剪切参与性别决定研究进展 |
| 1.3.3 测序技术应用于可变剪切的研究 |
| 1.3.4 家鸡可变剪切的研究进展 |
| 1.4 本课题前期新发现 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第2章 鸡胚性别决定过程中雌雄性腺组织的多组学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 鸡胚胎决定过程中的性腺组织收集和分离 |
| 2.1.5 转录组文库的构建与测序 |
| 2.1.6 组学数据的分析和验证 |
| 2.2 实验结果与分析 |
| 2.2.1 样品的收集和质检 |
| 2.2.2 二代转录组分析 |
| 2.2.3 三代全长转录组分析 |
| 2.2.4 联合分析显示性染色体同源基因SMAD2表达差异 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 鸡SMAD2全长(SMAD2_(FL))及SMAD2可变剪切体(SMAD2_(△11))在胚胎性别决定过程中的功能研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 主要仪器和设备 |
| 3.1.4 SMAD2可变剪切的鉴定与克隆 |
| 3.1.5 SMAD2可变剪切在不同组织中的的表达检测 |
| 3.1.6 SMAD2可变剪切体的功能验证 |
| 3.2 实验结果与分析 |
| 3.2.1 SMAD2可变剪切体的鉴定与克隆 |
| 3.2.2 SMAD2可变剪切体在不同组织中的表达 |
| 3.2.3 SMAD2可变剪切体外功能验证 |
| 3.2.4 SMAD2可变剪切体内功能验证 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 SMAD2_(△11)通过与CYP19A1结合激活胚胎雌性决定和分化通路 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要仪器和设备 |
| 4.1.4 基于His Pulldown技术筛选SMAD2和SMAD2_(△11)的互作蛋白 |
| 4.1.5 免疫共沉淀验证蛋白互作 |
| 4.1.6 CYP19A1在鸡胚胎性别决定过程中的功能 |
| 4.2 实验结果与分析 |
| 4.2.1 基于His Pulldown技术筛选SMAD2Z和SMAD2W_(△11)的互作蛋白 |
| 4.2.2 Co-IP验证SMAD2W_(△11)与CYP19A1的结合关系 |
| 4.2.3 CYP19A1在鸡胚胎性别决定过程中的功能 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论和创新点 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 论文有待改进之处及下一步计划 |
| 论文有待改进之处 |
| 下一步计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一: 附表 |
| 附录二: 附图 |
| 附录三: 氨基酸序列 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）钙化性主动脉瓣病变内皮间质转化的表达及其调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 内皮间质转化在钙化性主动脉瓣膜中的表达 |
| 1. 前言 |
| 2. 方法 |
| 2.1 主动脉瓣组织样本采集 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 主动脉瓣组织的病理石蜡标本制备 |
| 2.4 严重钙化人钙化主动脉瓣膜病理制备方法的改进 |
| 2.5 主动脉瓣组织的冰冻标本制备 |
| 2.6 病理切片制备 |
| 2.7 病理染色 |
| 2.8 组织总RNA提取 |
| 2.9 实时荧光定量PCR (qRT-PCR) |
| 2.10 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 人钙化主动脉瓣病理染色及EndoMT的表达 |
| 3.2 兔CAVD模型的建立及EndoMT的表达 |
| 3.3 小鼠CAVD模型的建立及EndoMT的表达 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 钙化小鼠模型的改良与内皮细胞谱系示踪小鼠模型的构建及其内皮间质转化的表达 |
| 1. 前言 |
| 2. 方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 导丝损伤小鼠CAVD模型的建立 |
| 2.3 导丝损伤联合高脂喂养ApoE~(-/-)小鼠CAVD模型的建立 |
| 2.4 小鼠超声心动测量 |
| 2.5 内皮细胞谱系示踪小鼠的构建 |
| 2.6 内皮细胞谱系示踪小鼠CAVD模型的构建 |
| 2.7 小鼠心脏组织取材 |
| 2.8 小鼠主动脉瓣组织的病理石蜡标本制备 |
| 2.9 病理切片制备 |
| 2.10 瓣膜病理染色 |
| 2.11 流式细胞仪检测 |
| 2.12 转基因小鼠DNA提取及基因鉴定 |
| 2.13 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 导丝损伤小鼠术后瓣膜形态 |
| 3.2 第一批导丝损伤小鼠建模超声 |
| 3.3 导丝损伤小鼠RNA表达变化 |
| 3.4 导丝损伤小鼠的病理染色 |
| 3.5 导丝损伤小鼠的免疫荧光染色 |
| 3.6 内皮细胞谱系示踪小鼠的免疫荧光染色 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 DUSP1与PDK4在CAVD中的表达及相关机制探究 |
| 1. 前言 |
| 2. 方法 |
| 2.1 原代细胞的消化与分选 |
| 2.2 冻存细胞复苏方法 |
| 2.3 促钙液的配置 |
| 2.4 siRNA转染细胞 |
| 2.5 病毒转染细胞 |
| 2.6 TGFβ干预VECs |
| 2.7 细胞总RNA提取 |
| 2.8 流式细胞检测 |
| 2.9 石蜡切片免疫荧光染色 |
| 2.10 人组织样本的RNA提取 |
| 2.11 实时荧光定量PCR |
| 2.12 细胞茜素红染色及钙盐半定量分析 |
| 2.13 生物信息学分析 |
| 2.14 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 单细胞数据分析与挖掘 |
| 3.2 mRNA测序数据分析 |
| 3.3 差异基因的外部样本验证 |
| 3.4 DUSP1在瓣膜组织的空间定位 |
| 3.5 人主动脉瓣间质细胞促钙化后的基因变化 |
| 3.6 siRNA抑制VICs的DUSP1表达 |
| 3.7 TGFβ诱导VECs发生内皮间质转化 |
| 3.8 腺病毒过表达VECs的PDK4表达 |
| 3.9 腺病毒敲低VECs的PDK4表达 |
| 3.10 PDK4抑制剂DCA对导丝损伤小鼠术后瓣膜功能影响 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 综述 内皮间质转化在心血管疾病中的作用 |
| 前言 |
| EndoMT的定义 |
| EndoMT的分子机制 |
| TGF-β和BMP信号通路 |
| Wnt信号通路 |
| Notch信号传导途径 |
| EndoMT与心血管疾病 |
| EndoMT在心脏发生和先天性心脏病中的作用 |
| EndoMT在肺动脉高压中的作用 |
| EndoMT在动脉粥样硬化中的作用 |
| EndoMT在心肌梗死中的作用 |
| EndoMT在心脏纤维化中的作用 |
| EndoMT在钙化性主动脉瓣疾病中的作用 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录: |
| 表A. 主要实验仪器和耗材 |
| 表B. 主要试剂 |
| 表C. qRT-PCR引物序列 |
| 个人简历及学术成果 |
| 教育经历 |
| 荣誉奖励 |
| 发表学术论文 |
| 致谢 |
（4）香菇优良菌株的选育（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 香菇概述 |
| 1.2 育种方法 |
| 1.2.1 人工选择育种 |
| 1.2.2 杂交育种 |
| 1.2.3 原生质体融合育种 |
| 1.2.4 诱变育种 |
| 1.2.5 转基因育种 |
| 1.2.6 分子标记辅助育种 |
| 1.2.7 香菇耐高温菌株的育种现状 |
| 1.3 优良新品种的筛选与鉴定 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 1.5 研究内容 |
| 1.6 技术路线 |
| 第二章 单核菌株的分离及菌丝生长特性研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.3 数据处理 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 单孢分离及单核菌株鉴定 |
| 2.2.2 单核菌株菌丝生长速率比较 |
| 2.2.3 单核菌株菌落长势评分比较 |
| 2.2.4 单核菌株菌落类型分布分析 |
| 2.2.5 低温保藏对单核菌株萌发期的影响 |
| 2.2.6 优良单核菌株筛选 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 香菇杂交及初筛 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 杂交结果 |
| 3.2.2 杂交菌株在综合PDA培养基上筛选 |
| 3.2.3 杂交菌株在木屑平板培养基上筛选 |
| 3.2.4 杂交菌株瓶栽筛选 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 香菇菌株的农艺性状测定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.3 数据处理 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 不同优良菌株子实体形成时间比较 |
| 4.2.2 不同菌株子实体形成温度比较 |
| 4.2.3 不同菌株子实体生长情况比较 |
| 4.2.4 子实体形态及硬度结果分析 |
| 4.2.5 优良菌株性状分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 香菇优良菌株的初步鉴定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果分析 |
| 5.2.1 拮抗试验结果分析 |
| 5.2.2 菌落及子实体形态差异分析 |
| 5.2.3 酯酶同工酶电泳结果分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 6.3 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录A 单核菌株菌丝生长结果 |
| 附录B 杂交菌株在木屑平板上生长的结果 |
| 附录C 杂交菌株瓶栽结果 |
| 附录D 栽培菌株编号及子实体形成时间 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）红螯螯虾TRIM32抑制白斑综合征病毒感染机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词中英文对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 白斑综合征病毒研究概况 |
| 1.1.1 白斑综合征病毒的简介 |
| 1.1.2 WSSV感染宿主范围和感染模型的建立 |
| 1.2 甲壳动物免疫系统简介 |
| 1.2.1 甲壳动物免疫系统的特性 |
| 1.2.2 甲壳动物免疫系统的组成 |
| 1.2.3 细胞免疫和体液免疫 |
| 1.3 蛋白泛素化修饰 |
| 1.3.1 泛素化修饰 |
| 1.3.2 TRIM蛋白家族的简介 |
| 1.3.3 TRIM32的简介 |
| 1.4 研究的技术路线、目的和意义 |
| 1.4.1 研究的技术路线 |
| 1.4.2 研究目的和意义 |
| 第2章 红螯螯虾CqTrim32基因克隆及生物信息学分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂和耗材 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PCR所用引物 |
| 2.2.2 总RNA的提取以及RACE的cDNA的合成 |
| 2.2.3 RACE技术进行CqTrim32全长扩增 |
| 2.2.4 DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.2.5 CqTrim32 ORF扩增 |
| 2.2.6 CqTrim32全长序列验证 |
| 2.2.7 CqTrim32序列的生物信息学的分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 CqTrim32 ORF基因克隆 |
| 2.3.2 CqTrim32的基因序列及推导的氨基酸序列的特征 |
| 2.3.3 CqTrim32的全长序列的鉴定 |
| 2.3.4 红螯螯虾TRIM32与其同源的多序列比对以及进化树的分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 红螯螯虾CqTrim32基因组织分布及WSSV感染后表达时相分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 实验主要仪器 |
| 3.1.4 溶液的配方 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 健康红螯螯虾的无WSSV的检测 |
| 3.2.2 WSSV病毒的提取 |
| 3.2.3 Hpt(造血组织)细胞的分离以及原代培养 |
| 3.2.4 活体实验的处理与样品采集 |
| 3.2.5 RNA的提取和cDNA模板的合成 |
| 3.2.6 荧光定量PCR的引物的合成和鉴定 |
| 3.2.7 SYBR法-荧光定量PCR的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 红螯螯虾WSSV的检测 |
| 3.3.2 WSSV提取后对WSSV质量的检测 |
| 3.3.3 Hpt细胞状态的观察 |
| 3.3.4 总RNA提取质量的检测 |
| 3.3.5 荧光定量PCR产物特异性扩增的检测和其实验结果分析 |
| 3.3.6 CqTRIM32基因的组织分布的特异性 |
| 3.3.7 CqTrim32基因的时相在组织水平和细胞水平的分布 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 红螯螯虾CqTRIM32基因敲降对WSSV转录复制的影响以及对泛素化影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 Hpt细胞分离和细胞培养 |
| 4.2.2 双链RNA干扰 |
| 4.2.2.1 dsRNA引物的合成 |
| 4.2.2.2 dsRNA的合成 |
| 4.2.2.3 dsRNA纯化与验证 |
| 4.2.3 RNA的提取和cDNA的合成 |
| 4.2.4 DsRNA转染以及WSSV感染细Hpt细胞的方法 |
| 4.2.5 细胞免疫荧光 |
| 4.2.6 定量PCR |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 双链RNA的合成和质量鉴定的结果 |
| 4.3.2 双链RNA干扰的效率的检测 |
| 4.3.3 CqTrim32敲降后对病毒转录复制的影响 |
| 4.3.4 CqTrim32敲降后对ubiquibination的影响 |
| 4.3.5 CqTrim32敲降以及病毒时相对ubiquibination的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 CqTRIM32重组蛋白的原核表达及其功能研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 实验主要仪器 |
| 5.1.4 溶液的配方 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 Cq-TRIM32原核表达载体的构建 |
| 5.2.2 CqTRIM32蛋白的诱导表达 |
| 5.2.3 CqTRIM32蛋白的纯化 |
| 5.2.4 Western-blot检测 |
| 5.2.5 Pull down实验 |
| 5.2.6 WSSV的增殖和纯化 |
| 5.2.7 Hpt细胞分离和细胞培养 |
| 5.2.8 蛋白转染 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 rCqTRIM32诱导表达 |
| 5.3.2 rCqTRIM32的功能研究 |
| 5.4 讨论 |
| 结语 |
| 在学期间参加的科研项目及成果 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）丘脑网状核介导皮层丘脑通路在防御性逃跑行为的神经环路研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 前言 |
| 2. 实验材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 小鼠脑定位注射台的搭建 |
| 2.3 小鼠脑内病毒注射、光纤和套管植入 |
| 2.3.1 病毒注射玻璃针的准备 |
| 2.3.2 小鼠开颅手术 |
| 2.3.3 脑内病毒注射 |
| 2.3.4 光纤陶瓷插芯植入 |
| 2.3.5 给药套管植入 |
| 2.4 动物行为学测试 |
| 2.5 光纤记录系统 |
| 2.6 光遗传学操控行为 |
| 2.7 心率记录 |
| 2.8 免疫组织化学 |
| 2.9 逆向标记中起始细胞以及上游神经元的统计 |
| 2.10 下游轴突强度分析 |
| 2.11 急性脑片电生理 |
| 2.12 数据统计分析 |
| 2.13 大脑核团名称缩写表 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 Limbic TRN亚区中PV阳性神经元的活动与逃跑行为的起始正相关 |
| 3.2 Limbic TRN亚区的活动介导了动物的防御性逃跑行为 |
| 3.3 Cg到limbic TRN的谷氨酸环路驱动了防御性逃跑行为 |
| 3.4 Limbic TRN到MD抑制性环路调控了防御性逃跑行为 |
| 3.5 Cg→limbic TRN→MD三级环路参与调控动物的逃跑行为 |
| 4. 讨论 |
| 5. 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 在读期间主要成果 |
（7）产胞外多糖南极微生物的筛选及其胞外多糖的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 极地与极地微生物 |
| 1.1.1 极地微生物研究概况 |
| 1.1.2 极地微生物活性物质的研究 |
| 1.2 微生物多糖的研究概况 |
| 1.2.1 多糖的概念及分类 |
| 1.2.2 微生物多糖的应用 |
| 1.3 胞外多糖的研究概况 |
| 1.3.1 胞外多糖的概念 |
| 1.3.2 胞外多糖的理化性质和生物活性 |
| 1.3.3 胞外多糖的分离纯化及结构鉴定 |
| 1.3.4 影响胞外多糖产量的因素及其应用 |
| 1.4 本研究的意义及内容 |
| 1.4.1 研究意义 |
| 1.4.2 主要研究内容 |
| 2 南极产胞外多糖微生物的筛选及系统发育分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株与培养基 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器 |
| 2.2 产胞外多糖南极微生物的筛选 |
| 2.2.1 菌株的分离 |
| 2.2.2 苯酚硫酸法测定总糖标准曲线的制备 |
| 2.2.3 考马斯亮蓝法测定蛋白含量标准曲线的制备 |
| 2.2.4 样品中总糖含量的测定 |
| 2.2.5 样品中蛋白含量的测定 |
| 2.2.6 产胞外多糖菌株的筛选及其胞外多糖的粗提取 |
| 2.2.7 产胞外多糖极地微生物的分子鉴定及系统发育分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 菌株的分离 |
| 2.3.2 苯酚硫酸法测总糖标准曲线的制备 |
| 2.3.3 考马斯亮蓝法测蛋白含量标准曲线的制备 |
| 2.3.4 产胞外多糖菌株初筛结果 |
| 2.3.5 分子鉴定与系统发育分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 南极微生物胞外多糖的理化性质及生物活性研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株与培养基 |
| 3.2 主要试剂与仪器 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.3 南极微生物胞外多糖理化特征分析 |
| 3.3.1 理化特征的测定 |
| 3.3.2 总糖含量的测定 |
| 3.3.3 蛋白含量的测定 |
| 3.3.4 糖醛酸含量的测定 |
| 3.3.5 硫酸基含量的测定 |
| 3.4 南极微生物胞外多糖体外抗氧化活性的测定 |
| 3.4.1 DPPH自由基清除能力的测定 |
| 3.4.2 超氧阴离子自由基清除能力的测定 |
| 3.5 结果与分析 |
| 3.5.1 理化特征的测定 |
| 3.5.2 总糖含量的测定 |
| 3.5.3 蛋白含量的测定 |
| 3.5.4 糖醛酸含量的测定 |
| 3.5.5 硫酸基含量的测定 |
| 3.5.6 DPPH自由基清除能力的测定 |
| 3.5.7 超氧阴离子自由基清除能力的测定 |
| 3.6 本章小结 |
| 4 南极微生物粗多糖对彩虹鲷非特异性免疫活性的初步探究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要实验材料和仪器 |
| 4.2 粗胞外多糖对彩虹鲷非特异性免疫活性影响的实验 |
| 4.2.1 彩虹鲷的饲喂与注射方法 |
| 4.2.2 血清的制备 |
| 4.2.3 非特异性免疫活性指标的测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 粗胞外多糖对彩虹鲷血清AKP的影响 |
| 4.3.2 粗胞外多糖对彩虹鲷血清ACP的影响 |
| 4.3.3 粗胞外多糖对彩虹鲷血清SOD的影响 |
| 4.3.4 粗胞外多糖对彩虹鲷血清CAT的影响 |
| 4.3.5 粗胞外多糖对彩虹鲷血清LYZ的影响 |
| 4.3.6 非特异性免疫活性变化综合分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 产胞外多糖南极微生物的发酵条件优化 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 菌株与培养基 |
| 5.1.2 主要试剂与仪器 |
| 5.2 培养基成分对菌株W32-2产胞外多糖能力的影响 |
| 5.2.1 不同碳源对菌株W32-2胞外多糖产量的影响 |
| 5.2.2 不同氮源对菌株W32-2胞外多糖产量的影响 |
| 5.2.3 最佳碳源添加量的确定 |
| 5.2.4 最佳氮源添加量的确定 |
| 5.3 发酵条件对菌株W32-2产胞外多糖能力的影响 |
| 5.3.1 初始pH值对菌株W32-2胞外多糖产量的影响 |
| 5.3.2 温度对菌株W32-2胞外多糖产量的影响 |
| 5.3.3 接种量对菌株W32-2胞外多糖产量的影响 |
| 5.3.4 装液量对菌株W32-2胞外多糖产量的影响 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 不同碳源对菌株W32-2胞外多糖产量的影响 |
| 5.4.2 不同氮源对菌株W32-2胞外多糖产量的影响 |
| 5.4.3 最佳碳源添加量的确定 |
| 5.4.4 最佳氮源添加量的确定 |
| 5.4.5 初始pH值对菌株W32-2胞外多糖产量的影响 |
| 5.4.6 温度对菌株W32-2生长及胞外多糖产量的影响 |
| 5.4.7 接种量对菌株W32-2胞外多糖产量的影响 |
| 5.4.8 装液量对菌株W32-2胞外多糖产量的影响 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（8）联苯环辛二烯类木脂素衍生物制备及其部分生物活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 联苯环辛二烯类木脂素概述 |
| 1.2 五味子酚及其生物活性研究进展 |
| 1.2.1 抗氧化作用 |
| 1.2.2 对肝损伤的保护作用 |
| 1.3 五味子酚衍生物的研究现状 |
| 1.4 立题依据及意义 |
| 第二章 实验部分 |
| 2.1 仪器与材料 |
| 2.1.1 仪器与试剂 |
| 2.1.2 五味子酚原料 |
| 2.2 五味子酚衍生物的制备 |
| 2.2.1 基于拼合原理设计合成的衍生物制备 |
| 2.2.2 调节化合物极性设计合成的衍生物制备 |
| 2.2.3 脱甲氧基反应衍生物的制备 |
| 2.2.4 其他衍生物的制备 |
| 2.3 衍生物的理化数据 |
| 2.4 五味子酚衍生物的生物活性测试 |
| 2.4.1 五味子酚衍生物抗TMV活性测试 |
| 2.4.2 五味子酚衍生物抑菌活性 |
| 2.4.3 五味子酚衍生物抗肿瘤活性 |
| 2.5 有机合成方法学研究 |
| 2.5.1 脱卤反应条件优化 |
| 2.5.2 金属钠/叔丁醇体系下的脱卤脱甲氧基反应 |
| 第三章 小结与讨论 |
| 3.1 化学部分 |
| 3.2 活性筛选部分 |
| 3.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 ：缩略词对照表 |
| 附录二 ：论文发表情况 |
| 附录三 ：图版 |
（9）SNX16和SNX11的结构生物学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 SNXs家族蛋白概述 |
| 1.1 Sorting nexins(SNXs) |
| 1.2 PX结构域 |
| 1.2.1 PX结构域的结构 |
| 1.2.2 PX结构域介导PX蛋白与膜结合 |
| 1.2.3 PX结构域与蛋白相互作用 |
| 1.3 SNXs与蛋白分选运输 |
| 1.3.1 SNXs与网格蛋白介导的细胞内吞 |
| 1.3.2 SNXs参与调节蛋白由初级内体到溶酶体的运输 |
| 1.3.3 SNXs调节营养素受体由初级内体向质膜的循环运输 |
| 1.3.4 SNXs调节蛋白由内体向反面高尔基体网的运输 |
| 1.4 SNXs蛋白与信号传递 |
| 1.5 SNXs蛋白的结构生物学研究现状、意义 |
| 第一部分 SNX16的结构生物学研究 |
| 第二章 SNX16的研究背景 |
| 2.1 SNX16的结构域组成 |
| 2.2 Coiled coil结构域 |
| 2.2.1 Coiled coil结构域概述 |
| 2.2.2 Coiled coil结构结构域的结构特征 |
| 2.3 SNX16的结构与功能 |
| 2.3.1 Coiled coil结构域参与SNX16的寡聚化 |
| 2.3.2 SNX16与内体运输 |
| 2.3.3 SNX16与疾病 |
| 第三章 实验材料、设备与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒与菌株 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重组质粒的构建 |
| 3.2.2 目的蛋白的表达 |
| 3.2.3 目的蛋白的纯化 |
| 3.2.4 蛋白酶解实验 |
| 3.2.5 蛋白甲基化修饰 |
| 3.2.6 动态光散射(DLS)实验 |
| 3.2.7 Native-PAGE实验 |
| 3.2.8 蛋白质结晶 |
| 3.2.9 数据收集和结构解析 |
| 第四章 结果与讨论 |
| 4.1 全长SNX16的纯化 |
| 4.2 SNX161~(101-283)的纯化和结晶 |
| 4.2.1 野生型和硒代SNX16~(101-283)的纯化和结晶 |
| 4.2.2 SNX16~(101-283)的甲基化以及甲基化SNX16~(101-283)的结晶和优化 |
| 4.3 SNX16~(100-278)的纯化和结晶 |
| 4.3.1 野生型SNX16~(100-278)的纯化 |
| 4.3.2 SNX16~(100-278)的甲基化 |
| 4.3.3 野生型、甲基化和甲基化硒代SNX161~(100-278)的晶体筛选和优化 |
| 4.4 甲基化硒代的SNX16~(100-278)晶体衍射数据收集、结构解析和结构修正 |
| 4.4.1 数据收集与处理 |
| 4.4.2 结构解析 |
| 4.4.3 SNX16~(100-278)-P2_1和SNX16~(100-278)-P2_12_12_1的结构修正 |
| 4.4.4 SNX16~(100-278)-P2_1和SNX16~(100-278)-P2_12_12_1结构模型的质量评估 |
| 4.5 SNX16~(100-278)的结构分析 |
| 4.5.1 SNX16~(100-278)的总体结构 |
| 4.5.2 SNX16~(100-278)的Coiled coil结构域 |
| 4.5.3 SNX16的PX结构域 |
| 4.5.4 SNX16~(100-278)结构域之间的相互作用 |
| 4.5.5 SNX16~(100-278)二聚体结构中独特的PI3P结合口袋 |
| 4.5.6 SNX16~(100-278)二聚体结构中的膜结合界面 |
| 本篇小结 |
| 第二部分 SNX11的结构生物学研究 |
| 第五章 SNX11的研究背景 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 SNX~(PX)调节内体的形态发生 |
| 5.3 SNX~(PX)的结构与功能 |
| 第六章 实验材料、设备与方法 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 质粒与菌株 |
| 6.1.2 试剂 |
| 6.1.3 仪器设备 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 重组质粒的构建 |
| 6.2.2 目的蛋白的表达 |
| 6.2.3 蛋白的纯化 |
| 6.2.4 蛋白甲基化修饰 |
| 6.2.5 蛋白质结晶 |
| 6.2.6 数据收集、结构解析和修正 |
| 第七章 结果与讨论 |
| 7.1 晶体衍射数据处理、结构解析与修正 |
| 7.1.1 晶体衍射数据处理 |
| 7.1.2 结构解析与修正 |
| 7.1.3 结构模型的质量评估 |
| 7.2 SNX11-142C和甲基化的SNX11-170C的结构分析 |
| 7.2.1 SNX11-142C和甲基化的SNX11-170C的总体结构 |
| 7.2.2 SNX11-170C是一个新的PX结构域 |
| 7.2.3 SNX11-PXe结构域的膜结合界面分析 |
| 7.2.4 SNX11的多序列比对和功能域分析 |
| 7.2.5 不同PX结构域β 2/β 3 Loop的分析 |
| 本篇小结 |
| 第三部分 其他SNXs蛋白的研究 |
| 第八章 SNX17的研究 |
| 8.1 研究背景 |
| 8.1.1 前言 |
| 8.1.2 SNX17及其同源蛋白的结构特征 |
| 8.1.3 SNX17参与质膜蛋白的运输 |
| 8.1.4 SNX17及同源蛋白与信号传导 |
| 8.1.5 PX-FERM-like蛋白与Ras及跨膜蛋白的结合模型 |
| 8.2 实验结果与讨论 |
| 8.2.1 人源SNX17的表达与纯化 |
| 8.2.2 斑马鱼SNX17(dSNX17)的表达与纯化 |
| 第九章 SNX7的研究 |
| 参考文献 |
| 附录1 载体图谱 |
| 附录2 分子克隆的一些方法 |
| 附录3 聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 附录4 培养基配制 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与参加的学术会议 |
（10）拟南芥蓝光受体隐花素CRY2光激发机理和功能的生化分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词 |
| 目录 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 拟南芥蓝光/UV-A受体一隐花素 |
| 1.1.1 植物光受体 |
| 1.1.2 隐花素的发现 |
| 1.1.3 隐花素/光裂解酶家族 |
| 1.2 隐花素的功能 |
| 1.2.1 拟南芥隐花素的表达与亚细胞定位 |
| 1.2.2 拟南芥隐花素的功能 |
| 1.2.2.1 隐花素介导蓝光促进幼苗光形态建成 |
| 1.2.2.2 隐花素调节光周期控制的开花 |
| 1.2.2.3 隐花素介导了光对生物钟的影响 |
| 1.2.2.4 隐花素介导光刺激保卫细胞的发育和气孔的开放 |
| 1.2.2.5 隐花素介导向性生长 |
| 1.2.2.6 隐花素介导光对根发育的调节 |
| 1.2.2.7 隐花素介导磁场感应 |
| 1.2.2.8 隐花素介导的细胞程序性死亡 |
| 1.2.2.9 隐花素不依赖于蓝光的功能 |
| 1.3 隐花素的结构 |
| 1.3.1 光裂解酶的结构与光化学机制 |
| 1.3.1.1 光裂解酶结构与生色团 |
| 1.3.1.2 光裂解酶的光反应机理 |
| 1.3.2 拟南芥隐花素CRYlPHR结构域 |
| 1.3.2.1 拟南芥隐花素生色团 |
| 1.3.2.2 拟南芥CRY1-PHR晶体解析 |
| 1.3.3 拟南芥隐花素C端延伸区CCT结构域 |
| 1.3.3.1 隐花素同源性分析 |
| 1.3.3.2 光诱导隐花素构象改变 |
| 1.3.4 拟南芥隐花素光激发机制与光化学特性 |
| 1.3.4.1 拟南芥隐花素经历依赖蓝光的磷酸化过程 |
| 1.3.4.2 拟南芥CRY2蛋白依赖蓝光的降解活性 |
| 1.5 隐花素介导的蓝光信号传导途径 |
| 1.5.1 拟南芥隐花素传导途径中的信号蛋白 |
| 1.5.1.1 转录因子CIB |
| 1.5.1.2 泛素化E3连接酶COP1 |
| 1.5.1.3 coiled-coil/WD repeat蛋白SPAs |
| 1.5.2 蓝光响应途径 |
| 1.5.2.1 CRY2-CIBs途径 |
| 1.5.2.2 CRY-SPA1/COP1途径 |
| 1.6 动物隐花素 |
| 1.7 本论文的构想 |
| 第2章 拟南芥隐花素通过不依赖于色氨酸三联体光还原反应的光激发机制行使功能 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.1.1 下胚轴长度测量 |
| 2.1.1.2 开花时间统计 |
| 2.1.1.3 定量PCR(Q-PCR) |
| 2.1.1.4 融合蛋白亚细胞定位 |
| 2.1.1.5 免疫印迹(western blot) |
| 2.1.2 酵母双杂交 |
| 2.1.3 体外隐花素CRY2和CIB1蛋白的表达、纯化和分析 |
| 2.1.4 体外蛋白与蛋白的相互作用 |
| 2.2 实验结果与分析 |
| 2.2.1 隐花素CRY2体外光还原反应依赖色氨酸三联体 |
| 2.2.2 拟南芥隐花素CRY2体内生理功能不依赖色氨酸三联体参与的光还原反应 |
| 2.2.3 隐花素CRY2依赖蓝光的降解活性不需要依赖色氨酸参与的光还原反应 |
| 2.2.4 隐花素CRY2W374A/F突变体在黑暗下抑制向地性 |
| 2.2.5 隐花素某些色氨酸三联体突变导致CRY2组成型活跃 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 蓝光诱导体外隐花素CRY2寡聚体的形成 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 溶液配制 |
| 3.1.2 蛋白表达、纯化与光处理 |
| 3.2 实验结果与分析 |
| 3.2.1 昆虫细胞表达突变体CRY2W374A蛋白出现二聚体 |
| 3.2.2 体外CRY2二聚化依赖蓝光与FAD |
| 3.2.3 纯化后的CRY蛋白依然响应蓝光出现多聚化现象 |
| 3.2.4 蓝光诱导体外CRY2多聚化并被ATP促进 |
| 3.2.5 体外pull-down实验显示CRY2依赖蓝光的二聚化现象 |
| 3.2.6 CRY2与CRY2W374A蛋白可能存在构象上的差异 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 蓝光诱导体外隐花素CRY2构象改变 |
| 4.1 实验材料与方法 |
| 4.1.1 植物突变体分析 |
| 4.1.2 一级结构分析 |
| 4.1.3 二级结构预测 |
| 4.1.4 胰蛋白酶识别位点预测 |
| 4.1.5 蛋白表达与纯化 |
| 4.1.6 限制性蛋白水解 |
| 4.2 实验结果与分析 |
| 4.2.1 拟南芥CRY2~(D393A)突变体出现cop1表型 |
| 4.2.2 采用胰蛋白酶消化实验研究CRY2蓝光诱导的构象重组 |
| 4.2.3 蓝光促进CRY2水解 |
| 4.2.4 胰蛋白酶消化实验揭示蓝光诱导了CRY2构象改变 |
| 4.2.5 胰蛋白酶消化实验显示CRY2~(W374A)在蓝光和黑暗下呈现出稳定的构象 |
| 4.2.6 组成型光响应突变体CRY2~(W374A)结构类似于蓝光下CRY2 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 采用组织特异表达方法研究拟南芥的功能 |
| 5.1 实验设计与方法 |
| 5.1.1 选取组织特异性启动子 |
| 5.1.2 载体的选取 |
| 5.1.3 转基因植株构建与筛选 |
| 5.1.4 荧光激活细胞分类 |
| 5.1.4.1 实验步骤 |
| 5.1.4.2 溶液配制 |
| 5.1.5 Promoter-PABP-poly(A)pull-down分离法 |
| 5.1.5.1 实验步骤优化 |
| 5.1.5.2 溶液配制 |
| 5.2 实验结果与分析 |
| 5.2.1 组织特异性启动子启动GFP在不同组织中特异表达 |
| 5.2.2 不同组织中表达的CRY2调控植物不同的生理过程 |
| 5.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A 红光下拟南芥光敏素调节基因的蛋白质鉴定与mRNA分析 |
| A1 实验材料与方法 |
| A1.1 植物生长条件和光源 |
| A1.2 拟南芥幼苗总蛋白的提取 |
| A1.3 双向凝胶电泳 |
| A1.4 蛋白质染色与图像分析 |
| A1.5 蛋白质的原位酶解 |
| A1.6 MADLI-TOF-TOF肽质指纹图分析及数据搜索 |
| A1.7 RT-PCR分析 |
| A2 前沿 |
| A3 实验结果与分析 |
| A3.1 双向电泳鉴定光敏素调节蛋白 |
| A3.2 差异蛋白功能分类与亚细胞定位分析 |
| A3.3 红光下PHYAPHYB突变影响了基因蛋白水平的积累 |
| A3.4 红光下PhyA与phyB影响基因mRNA水平的表达 |
| A4 结论 |
| A 参考文献 |
| 攻读学位期间所发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
四、W32/Toget@MM病毒出现（论文参考文献）
- [1]抗沙门氏菌Peg菌毛单克隆抗体制备的一种简捷方法与初步应用[D]. 王思权. 扬州大学, 2021
- [2]鸡性别决定过程中SMAB2可变剪切体(SMAD2WΔ11)功能及其调控机制的研究[D]. 靳锴. 扬州大学, 2021
- [3]钙化性主动脉瓣病变内皮间质转化的表达及其调控研究[D]. 魏柯. 北京协和医学院, 2021(02)
- [4]香菇优良菌株的选育[D]. 程爽爽. 西北农林科技大学, 2019(02)
- [5]红螯螯虾TRIM32抑制白斑综合征病毒感染机制研究[D]. 常雪娇. 厦门大学, 2018(05)
- [6]丘脑网状核介导皮层丘脑通路在防御性逃跑行为的神经环路研究[D]. 董平. 浙江大学, 2018(03)
- [7]产胞外多糖南极微生物的筛选及其胞外多糖的应用研究[D]. 高培丽. 福建农林大学, 2017(01)
- [8]联苯环辛二烯类木脂素衍生物制备及其部分生物活性研究[D]. 王青遥. 贵州大学, 2015(01)
- [9]SNX16和SNX11的结构生物学研究[D]. 徐进新. 中国科学技术大学, 2012(04)
- [10]拟南芥蓝光受体隐花素CRY2光激发机理和功能的生化分析[D]. 李旭. 湖南大学, 2012(05)