一、脂质体介导胶质细胞源性神经营养因子基因转染对大鼠脊髓损伤后神经功能的影响（论文文献综述）
吴子健[1]（2021）在《通腑逐瘀法指导下抵当汤加减调控AQP4表达治疗大鼠急性脊髓损伤的作用机制研究》文中研究表明目的 本次研究结合急性脊髓损伤（acute spinal cord injury,ASCI）的研究现状和热点,基于导师的临床经验,以通过抑制水通道蛋白4（aquaporin 4,AQP4）的表达从而减轻ASCI后脊髓水肿为切入点,旨在探讨通腑逐瘀法治则指导下抵当汤加减治疗ASCI的可能作用机制,以期为推广通腑逐瘀法治疗ASCI提供理论依据。方法 第一部分:10周龄SD大鼠30只,按随机数字表法随机分为假手术组（A组）、自制打击器2cm组（B1组）、自制打击器4cm组（B2组）、NYU组1.25cm组（C1组）、NYU组2.5cm组（C2组）,每组各6只。除Sham组外,其余各组采用改良Allen’s法造模。B1、B2组将9g打击杆分别从2cm、4cm处自由坠落撞击T10脊髓,C1、C2组使用NYU打击器分别从1.25cm、2.5cm处撞击T10脊髓。各组造模完成后分别于1、3、5、7d进行BBB评分和Reuter评分,7d后行灌注取材,石蜡包埋切片,尼氏染色,观察各组组织受损程度和神经元存活率。第二部分:10周龄SD大鼠60只按随机分配方法随机分为假手术组（Sham）、模型组（Model）、抵当汤组（DDD）、TGN-020组（TGN-020）和抵当汤联合TGN-020组（DDD+TGN-020）,每组各12只。Sham组仅打开椎板暴露脊髓但不损伤脊髓;其余各组均采用自制脊髓打击器从40mm高度对脊髓进行打击。Sham组和Model组术后不予任何治疗措施干预,DDD组于术后3d予以抵当汤加减每日灌胃,持续3d,根据大鼠与人用药剂量体表面积换算法,DDD组大鼠每日用药剂量为5.04g/kg,采用蒸馏水进行稀释一定比例配制后予以灌胃处理,每日早晚各1次。TGN-020组处理方法:腹腔注射给药,每日用药剂量为5mg/kg,给药时间为3d。DDD+TGN-020组处理方法:予TGN-020腹腔注射给药,随后给予DDD灌胃处理。干预结束后进行行为学评价（BBB评分、斜板实验及Reuter评分）观察大鼠神经功能恢复情况,取材后进行脊髓组织大体观察和含水率检测、HE染色观察组织受损程度,尼氏染色观察神经元形态,免疫荧光检测各组脊髓组织AQP4、GFAP共表达的阳性细胞个数,Western Blot法检测各组脊髓组织中AQP4、GFAP、CSPG、PCNA、NGF、BDNF、GAP-43蛋白的表达量,q PCR法检测各组脊髓组织中CSPG、PCNA基因的表达量,电镜下观察各组髓鞘和神经元组织形态,高尔基染色观察树突和树突棘形态。第三部分:8周龄SD大鼠40只随机分为空白血清组和含药血清组,含药血清组给予5.04g/kg DDD灌胃,持续3d,空白血清组予等剂量超纯水灌胃,持续3d,干预结束后提取血清备用。每次取胚胎大鼠8-12只,通过机械-酶消化法提取星形胶质细胞（Astrocytes,AS）,细胞采用10%的高糖培养基培养,观察细胞传代至第3代进行后续实验。首先,免疫荧光鉴定细胞中GFAP含量,随后进行实验分组:空白组（Control group,CG）、模型组（Model group,MG）、空白血清组（Blank serum group,BSG）、DDD含药血清组（DDD）、TGN-020干预组（TGN-020）、DDD联合TGN-020组（DDD+TGN-020）,除MG外,其余各组均以划痕法进行造模,造模完成后DDD予以含药血清干预,BSG予以等剂量空白血清干预,TGN-020予以100nm TGN-020干预,DDD+TGN-020先予TGN-020干预后再予DDD干预。MTT法检测DDD含药血清干预AS的安全干预浓度、最佳干预时间和干预浓度,MTT法检测各组对RAS活性的影响,免疫荧光染色法检测RAS中AQP4和GFAP共表达的细胞数,Western Blot法检测各组RAS中AQP4、GFAP和NGF、BDNF、GAP-43蛋白的表达量,镜下观察DDD含药血清对RAS迁移率的影响。统计学方法:实验所得数据均使用SPSS21.0软件进行统计学处理,计量资料以均值±标准误（`X±S）表示,所得数据均经过正态性分布检测,若符合正态分布,则采用单因素方差分析,方差齐则采用LSD法,方差不齐则采用Games-Howell法;若不符合正态分布,则采用非参检验。以P<0.05提示差异具有统计学意义。结果 第一部分:自制脊髓打击器与NYU打击器建立脊髓损伤模型研究1.各组脊髓外观形态比较A组T10节段处硬脊膜完整,脊髓组织呈均匀乳白色,形态饱满圆润;B1、B2、C1、C2组T10节段处硬脊膜均完整,颜色呈不同程度的鲜红色或暗红色,损伤处可见水肿、瘀血及瘢痕组织增生,相对于B1、C1组,B2、C2组水肿更严重、瘀血范围更广、颜色更深、瘢痕组织更多。2.行为学评分比较BBB评分结果显示,A组术后除因手术致运动量减少外,未出现双下肢功能异常的表现,评分为21分;其余各组均出现不同程度的运动功能障碍,具体表现为:B2与B1、C2与C1相比,BBB评分显着降低,差异具统计学意义（P<0.05）;B1与C1、B2与C2相比,BBB评分无显着差异（P>0.05）。Reuter评分结果显示,A组术后未发现感觉功能异常现象;其余各组术后均出现不同程度的感觉功能异常现象,具体表现为B2、C2组术后1d牵张反射消失,肌力、肌张力减弱或消失,疼痛回缩反射迟钝,背部感觉存在或消失;B1、C1组术后1d除肌力消失外,牵张反射、肌张力、疼痛回缩反射、背部感觉均存在,术后3d肌力开始恢复。B2与B1、C2与C1相比,Reuter评分显着降低,差异具统计学意义（P<0.05）。B1与C1、B2与C2相比,Reuter评分无显着差异（P>0.05）。3.尼氏染色尼氏染色结果显示,A组脊髓组织结构完整,灰白质边界清晰,神经元细胞形态规则、胞核大、核仁清晰可见、数量多,胞质内可见斑块样尼氏体。相比A组,其余各组结构破坏更严重,灰白质结构不清,组织空白间隙更大,损伤处可见细胞呈空泡样改变或细胞皱缩、体积减小,神经元数量减少,尼氏体模糊或消失。4.脊髓受损面积比结果表明,A组未见受损区域,比值为0,其余各组均高于A组,差异具有统计意义（P<0.05）;相对于B1和C1,B2和C2损伤面积比值明显升高,差异具有统计意义（P<0.05）;B1与B2、C1与C2损伤面积比值差异不具有统计意义（P>0.05）。5.各组脊髓前、后角神经元损伤程度比较通过分析前、后角神经元阳性细胞数结果显示,A组神经元数目多,尼氏体含量多,其余各组均少于A组,差异具有统计意义（P<0.05）;相对于B1和C1,B2和C2神经元阳性细胞数明显减少,差异具有统计意义（P<0.05）;B1与B2、C1与C2神经元阳性细胞数差异不具有统计意义（P>0.05）。第二部分:抵当汤加减调节AQP4表达对SCI大鼠脊髓水肿的作用研究1.各组脊髓组织的大体观察从大体观察上来看,Sham组脊髓组织颜色鲜白,组织完整,未见瘀血部位和水肿;Model组在打击损伤部位可见明显的瘀血区域,瘀血颜色深红,瘀血范围较大,并可见明显脊髓水肿;DDD组在打击损伤部位可见较小的瘀血区域,瘀血部位颜色淡红,可见轻度水肿;DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组大体观察相似,肉眼见无显着差异。2.各组脊髓组织含水率与Sham组相比,其余各组脊髓组织含水率均显着增高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组脊髓组织含水率均显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组组间比较,脊髓组织含水率没有显着差异（P>0.05）。3.行为学观察结果各组大鼠BBB评分、斜板实验结果以及Reuter评分显示,与Sham组相比,其余各组BBB评分和斜板实验得分均显着降低（P<0.05）,Reuter评分均显着升高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组BBB评分均显着升高（P<0.05）,Reuter评分均显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组组间比较无显着差异（P>0.05）。4.HE染色Sham组组织结构完整,神经元等细胞形态结构良好,未见瘢痕组织或空洞形成,未见瘀血区域或炎性物质渗出。Model组损伤部位可见组织结构离乱,大量瘢痕组织和脊髓空洞的形成,可见明显的瘀血区域,并伴有大量的炎性细胞浸润,神经元等细胞皱缩,数量减少。其余三组可见组织形态结构较完整,可见少量脊髓空洞的形成,瘀血区域范围较小,炎性细胞清润较少,神经元等细胞形态结构较完整。使用Image J软件对各组空洞面积进行定量分析,结果显示,与Sham组相比,Model组脊髓空洞面积显着增加（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组脊髓空洞面积显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组脊髓空洞面积组间比较不具有显着差异（P>0.05）。5.尼氏染色观察各组神经元形态Sham组脊髓形态结构完整,灰质呈蝴蝶状,灰白质界限清晰,可见较多的神经元分布,神经元胞质内可见染色清晰的斑块状尼氏体,神经元胞体饱满,细胞核大,核仁明显。Model组脊髓组织破坏严重,结构不完整,灰、白质界限不清,可见大量的炎性细胞浸润,神经元皱缩、液化、坏死,形成较多的空泡,尼氏体较小或消失。相对Model组,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组脊髓结构较完整,隐约可见灰白质界限,神经元仍可见,数量较多,空泡样改变减少,尼氏体数量较多、较饱满。但相对于Sham组,神经元仍存在固缩,胞浆减少,核变小,尼氏体减少等病理改变。6.免疫荧光检测各组AQP4、GFAP的阳性细胞表达量AQP4阳性细胞表达呈绿色,GFAP阳性细胞表达呈红色,DAPI染色呈深蓝色,AQP4+/GFAP+细胞表达呈黄色树枝状,各组染色背景干净,表达清晰,细胞核数量无显着差异（P>0.05）,具有可比性。Sham组少见或未见明显的AQP4+/GFAP+细胞,Model组可见较多的AQP4+/GFAP+细胞,且细胞亮度高,胞体肿胀程度严重。与模型组相比,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组细胞数量较少,亮度较低,细胞肿胀程度减轻。对各组的AQP4+/GFAP+细胞进行计数和统计,与Sham组相比,其余各组AQP4与GFAP的阳性细胞占比均显着增高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组AQP4与GFAP的阳性细胞占比显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组间相比较,AQP4与GFAP的阳性细胞占比无显着差异（P>0.05）。7.Western Blot法检测各组AQP4、GFAP、PCNA、CSPG、NGF、BDNF、GAP-43的蛋白表达量各组蛋白条带背景清晰,无杂带现象,蛋白表达量趋势明显,具有可比性。与Sham组相比,各组脊髓组织中AQP4、GFAP、PCNA、CSPG蛋白的灰度值显着增高（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白的灰度值显着降低（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组脊髓组织中AQP4、GFAP、PCNA、CSPG蛋白的灰度值显着降低（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白的灰度值显着增高（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组组间比较结果显示,各组脊髓组织中AQP4、GFAP、PCNA、CSPG、NGF、BDNF、GAP-43蛋白的灰度值差异不具有统计学意义（P>0.05）。8.各组脊髓组织中PCNA和CSPG基因表达量各组基因检测的扩增曲线变化平稳,溶解曲线为平滑的单峰形态,说明引物设计好,模板未见污染,实验结果具有可比性。各组目的基因相对表达量结果显示,与Sham组相比,各组脊髓组织中PCNA、CSPG基因的表达量显着增高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组脊髓组织中PCNA、CSPG基因的表达量显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组组间比较结果显示,各组脊髓组织中PCNA、CSPG基因的表达量差异不具有统计学意义（P>0.05）。9.透射电子显微镜观察髓鞘和神经元组织形态Sham组脊髓组织在透射电镜下可见髓鞘外形规则,厚薄均一,形似同心圆状,结构完整,未见破裂、缺失等改变,板层结构均匀致密,胞内线粒体丰富,胞浆饱满,清晰可见。Model组髓鞘结构不规则,部分髓鞘断裂缺失,厚薄不一,局部可见褶皱卷曲,板层结构松散、融合,线粒体肿胀,甚至部分溶解消失;DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组可见髓鞘结构较完整,形态部分不规则但较Model组改善,部分髓鞘可见卷曲、厚薄不一,板层结构较均匀,虽有部分缺失,但松散程度相对Model组较轻,仍可见清晰的线粒体,但数量较Sham组少,胞体较小。10.电镜观察树突和树突棘形态各组脊髓经高尔基染色后结果显示:Sham组脊髓树突结构完整、形态规则、长度较长,树突上密布树突棘,树突棘分布整齐、均匀致密、数量较多;Model组脊髓树突形态不规则,部分断裂缺失,长度较短,较为纤细,树突棘数量少,稀疏分布,排列紊乱;与Model组相比,DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组脊髓树突形态有所改善、树突较长、结构较完整、周经较粗,树突棘数量较多,排列更为规则、整齐。对各组脊髓树突长度及树突棘进行定量分析,结果显示,与Sham组相比,Model组树突长度明显降低（P<0.05）,树突棘数量明显减少（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组树突长度明显增加（P<0.05）,树突棘数量显着增多（P<0.05）;DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组组间相比,差异不具有统计学意义（P>0.05）。第三部分:抵当汤加减含药血清对反应性星形胶质细胞的活化、迁移及神经生长相关细胞因子分泌的作用1.原代AS镜下观察原代细胞培养2d,镜下可见AS细胞呈不规则形状散在分布,部分细胞形似星形,细胞核大、呈椭圆形,细胞胞浆丰富,从胞体向四周发出长而有分支的突起;将原代细胞传代至第三代可见细胞生长状态良好,适宜进行后续实验。2.AS鉴定免疫荧光染色结果显示,GFAP染色呈阳性,阴性对照组未见任何阳性染色,提示GFAP呈特异性表达,所提取的细胞为AS。3.DDD含药血清对AS的安全干预浓度,以及干预RAS的最佳干预时间和最佳干预浓度DDD含药血清干预AS的安全浓度范围为:0-15%,DDD含药血清干预RAS最佳的干预浓度为10%,最佳干预时间为48h。4.DDD含药血清对RAS活性的影响MTT结果显示,与CG组相比,其余各组RAS活性均降低（P<0.05）;与MG相比,BSG组RAS活性无显着差异（P>0.05）,DDD、TGN-020和DDD+TGN-020组RAS活性均显着下降（P<0.05）;DDD、TGN-020和DDD+TGN-020组间比较无显着差异（P>0.05）。5.DDD含药血清对RAS迁移率的影响损伤24h后,各组RAS与对侧细胞完全分离,中间形成一条空白的划痕区域,划痕区未见或少见RAS;48h后部分细胞开始向对侧延伸突触,划痕区域出现部分肥大的RAS,细胞胞浆丰富,胞体呈球形,发亮,细胞加速分裂;72h后划痕区域缩小,部分RAS与对侧RAS突触交织,划痕开始愈合。在整个愈合过程中,24h各组划痕区域面积比无显着差异（P>0.05）;自48h开始,与MG组相比,BSG划痕区域面积比无显着差异,其余各组均明显较大（P<0.05）。DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组组间比较无显着差异（P>0.05）。72h后,MG组与BSG组划痕区域面积比无显着差异（P>0.05）。与MG组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组划痕区域面积比明显较大（P<0.05）,组间比较无显着差异（P>0.05）。以上划痕区域面积比的改变反映了RAS在损伤发生后向受损区域的迁移速率。6.各组对RAS中AQP4、GFAP荧光表达量的影响使用免疫荧光染色法对RAS中AQP4、GFAP和细胞核进行了标记。染色结果显示,AQP4+细胞呈绿色,GFAP+细胞呈红色,细胞核呈蓝色,荧光双标的细胞呈黄色的不规则树枝状。其中,CG组仅见12个零星分布的AQP4+/GFAP+细胞;MG组和BSG可见较多的AQP4+/GFAP+细胞,亮度较高,细胞肿胀程度严重;DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组可见较少的AQP4+/GFAP+细胞,亮度较低,细胞肿胀程度较轻。对AQP4+/GFAP+细胞进行计数统计,结果表明,与CG相比,其他各组阳性细胞占比显着增多（P<0.05）;与MG相比,除BSG组无显着差异外（P>0.05）,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组阳性细胞占比显着减少（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组阳性细胞占比组间相比无显着差异（P>0.05）。7.各组对RAS中AQP4、GFAP和NGF、BDNF、GAP-43蛋白表达量的影响结果显示,与CG组相比,其余各组AQP4和GFAP蛋白表达量均显着增高（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白表达量均显着降低（P<0.05）;与MG组相比,除BSG组无明显差异外（P>0.05）,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组AQP4和GFAP蛋白表达量均显着降低（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白表达量均显着增高（P<0.05）,3组组间比较无显着差异（P>0.05）。结论 1.自制简易脊髓打击器从20mm、40mm高处垂直撞击脊髓组织具有和NYU打击器从12.5mm、25mm处打击脊髓损伤程度相似的脊髓损伤动物模型,自制简易脊髓打击器安全性高,稳定性好,操作简便,价格低廉,可供科研工作者参考。2.通腑逐瘀法治则指导下抵当汤加减可有效消除SCI大鼠损伤处水肿,促进神经功能康复。其具体的作用机制为:通过抑制AQP4的表达可抑制反应性星形胶质细胞活化,减少胶质瘢痕形成,提高神经营养因子、神经生长因子及细胞膜生长相关蛋白的表达,促进神经功能康复。3.DDD含药血清能通过抑制AQP4的表达,有效减轻RAS水肿,减少RAS活化和减缓RAS迁移,促进RAS中神经营养因子的分泌。
高磊[2]（2021）在《BMP-7基因转染BMSCs治疗大鼠脊髓损伤的实验研究》文中提出目的:探讨BMP-7基因转染骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells,BMSCs）移植治疗大鼠脊髓损伤的作用。方法:采用密度梯度离心法结合全骨髓贴壁法分离、培养BMSCs。在体外培养至第3代后,流式细胞仪检测所得到细胞表面标志物CD44和CD29,成脂诱导及成骨诱导检测细胞是否具有干细胞分化能力。用LV-BMP7-GFP结合体对BMSCs进行转染,评估绿色荧光蛋白GFP的表达情况。造模后随机分为假手术组（A组）、对照组（B组）、BMSCs组（C组）、LV-BMP7-BMSCs组（D组）,于术后第3天进行治疗,治疗后1d、3d、7d、14d、21d、28d,采用BBB评分标准,对治疗后大鼠双下肢运动功能恢复情况进行评估。治疗28d后,采用免疫组化、免疫荧光检测NF-200、GFAP的表达情况,采用辣根过氧化物酶逆行示踪法检测神经元回路的重塑情况。结果:脊髓损伤治疗后第14d、21d、28d,D组BBB评分高于B组、C组（P<0.05）。免疫组化检测D组NF200表达水平高于A组、B组、C组（P<0.05）。与A组相比,B组、C组、D组GFAP表达水平升高（P<0.05）;三组间进行比较,GFAP表达水平无差异（P>0.05）。免疫荧光检测D组NF-200红色荧光面积百分比高于A组、B组及C组（P<0.05）;与A组相比,B组、C组及D组GFAP绿色荧光面积百分比较高（P<0.05）,但B组、C组及D组之间进行比较,GFAP绿色荧光面积百分比无统计学差异（P>0.05）。D组被目辣根过氧化物酶阳性标记的神经细胞数高于B组和C组（P<0.05）。结论:BMP-7基因转染BMSCs后移植治疗大鼠脊髓损伤,可促进大鼠脊髓损伤神经元修复以及神经元回路重塑,有利于大鼠脊髓损伤后神经功能的恢复,为BMSCs移植治疗SCI最终应用于临床提供理论基础。
周全[3]（2021）在《高压氧对脊髓神经元HSP32的负调控及在减压病预防中的应用》文中认为减压病（Decompression sickness,DCS）是潜水与高气压活动中的核心医学问题,重点在于预防。脊髓是DCS最易累及的靶器官之一,DCS脊髓损伤起病急,病情重,常遗留严重后遗症,但目前仍缺乏有效防治手段。高压氧（Hyperbaric oxygen,HBO）预处理是指提前一段时间（通常十多小时）进行HBO暴露,通过动员内源性保护机制达到增强机体对抗损伤能力的一种疾病预防手段。我们前期研究发现,HBO预处理可以通过适度升高体内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平上调脊髓神经元热休克蛋白（Heat shock protein,HSP）32表达,对抗大鼠DCS脊髓损伤。深入研究表明,HBO预处理通过ROS/p38/Nrf2通路上调脊髓神经元HSP32表达,但同时还通过激活MEK1/2/Bach1通路抑制HSP32过度表达。研究证实,虽然HSP32可以通过分解游离血红素并产生具有保护效应的代谢产物发挥抗氧化、抗炎和抗凋亡的作用,但是过度表达则可能产生有害作用。因此,HBO在诱导神经元HSP32表达的同时又启动负调控的生理意义可能是避免HSP32水平的过度增加。然而,除了MEK1/2外,其它信号分子是否参与上述负调控?全面掌握HBO对HSP32的调控机制,有助于深入理解HBO预处理作用规律,寻找潜在干预位点。既然HBO上调HSP32同时存在负调控作用,将其抑制后HSP32会过表达,这种过表达存在什么规律?过表达的HSP32是否会对神经元造成损伤?也即负调控的生理意义,也有必要深入研究。此外,在较低压强甚至常压条件下呼吸纯氧,但同时抑制负调控机制,是否也能够有效诱导HSP32的表达并发挥预防DCS损伤作用?本课题即针对上述问题展开,目的是进一步探讨HBO对脊髓神经元HSP32负调控的作用机制并揭示其生理意义,探索利用此负调控机制,拓展常压氧在预防DCS损伤中的潜在应用,为HBO和常压氧预处理的开展以及DCS预防提供理论依据与拓展思路。第一部分高压氧对脊髓神经元HSP32的负调控机制研究目的:进一步探索HBO诱导脊髓神经元HSP32表达的正负调控机制。研究方法:以原代大鼠脊髓神经元为研究对象。首先,通过磷酸化蛋白质谱技术及Western blot技术,筛查神经元280 k Pa-60 min HBO暴露激活的与HSP32调控可能相关的磷酸化信号分子,明确其在HBO暴露过程中及暴露后的磷酸化变化规律。其次,通过RNA干扰、特异性抑制剂等手段,明确这些信号分子与HSP32表达的关系,以及与关键信号分子MEK1/2及p38间的上下游关系。最后,使用ROS清除剂,明确HBO暴露后ROS与这些信号分子激活的关系。研究结果:HBO暴露促进了大鼠脊髓神经元TAK1、MEKK4及B-Raf的磷酸化,这些信号分子的磷酸化水平在HBO暴露40 min时显着上升,60 min时达峰,HBO结束后显着下降。抑制TAK1或干扰TAK1表达,可显着抑制HBO暴露后MEK1/2的磷酸化,并可部分抑制p38的磷酸化,对HSP32的表达则有进一步促进的作用;干扰MEKK4表达后,HBO对p38磷酸化及HSP32表达的上调作用均被显着抑制,MEK1/2的磷酸化则未受影响;抑制B-Raf对p38、MEK1/2磷酸化以及HSP32表达均无显着影响。清除线粒体ROS,可显着抑制HBO暴露后p38、MEK1/2及TAK1的磷酸化以及HSP32的表达。研究结论:大鼠脊髓神经元中,HBO暴露通过线粒体ROS激活TAK1,并通过MEK1/2通路对HSP32表达进行负调控;同时还可活化MEKK4,并和TAK1一同激活p38通路上调HSP32表达。第二部分高压氧对脊髓神经元HSP32负调控的生理意义研究目的:探索HBO联合抑制负调控诱导HSP32过表达对脊髓神经元对抗损伤能力的影响,明确HBO暴露后HSP32负调控机制的生理意义。研究方法:以原代大鼠脊髓神经元为研究对象。首先,通过设置HBO暴露梯度并联用负调控通路关键信号分子MEK1/2的抑制剂,检测神经元HSP32表达变化,建立HBO联合抑制MEK1/2诱导神经元HSP32过表达的模型。其次,利用氧化应激及氧糖剥夺模型（模拟DCS脊髓损伤致病机制）损伤神经元,并检测神经元活力及各类损伤指标变化,研究过表达HSP32对神经元对抗损伤能力的影响。最后,检测HSP32过表达后,产物游离铁、一氧化碳以及胆绿素的水平变化,通过抑制各产物作用,观察HSP32产物在其过表达不利效应中的作用。研究结果:HBO暴露可使脊髓神经元中HSP32适度增高（约为对照组2.5倍）,并能促进损伤模型处理后神经元的存活,改善神经元氧化、炎症损伤及凋亡指标的恶化;抑制MEK1/2调控通路后,过度表达的HSP32（约为对照组4.5倍）则完全抵消了这种保护效应。HSP32过表达也可引起神经元内游离铁及胆绿素/胆红素水平的显着升高,降低游离铁水平可显着改善HSP32过表达对神经元对抗损伤能力的不利影响,而抑制胆绿素/胆红素则可进一步削弱HSP32带来的神经元保护作用。研究结论:HBO通过促进大鼠脊髓神经元HSP32适度表达可以提高神经元对抗损伤的能力;而抑制负调控后,过度表达的HSP32可以抵消这种保护作用,该不利效应主要由HSP32下游产物游离铁介导。HBO对HSP32的负调控通过抑制其过度表达,从而避免不利效应的产生。第三部分HSP32负调控在减压病脊髓损伤预防中的应用研究目的:基于HSP32负调控机制,观察常压氧联合MEK1/2抑制剂对大鼠脊髓HSP32表达的影响以及在对抗DCS脊髓损伤中的作用。研究方法:以SD大鼠为研究对象。首先,使用100 k Pa-60 min常压氧联合MEK1/2抑制剂U0126处理大鼠,检测大鼠脊髓HSP32表达的变化规律。其次,于HSP32表达峰值时间点,采用700 k Pa-90 min空气暴露200 k Pa/min快速减压方案处理大鼠,观察常压氧联合U0126预处理对大鼠DCS发病率,后肢运动功能,以及脊髓和血清中氧化损伤、炎症及凋亡指标的影响。研究结果:常压氧联合U0126处理后大鼠脊髓HSP32表达显着增加,并于联合处理后12 h达到峰值。快速减压后,常压氧联合U0126预处理显着降低了大鼠DCS发病率（71.4%vs.42.8%）,改善了大鼠运动功能,显着抑制脊髓及血清中的氧化、炎症损伤及凋亡等指标的增长,HSP32拮抗剂锌卟啉可部分抑制常压氧联合U0126预处理带来的保护效应。常压氧或U0126单独处理对大鼠DCS发病率以及损伤指标均无显着影响。研究结论:常压氧联合MEK1/2抑制剂U0126预处理可以通过上调脊髓组织HSP32表达有效减轻DCS脊髓损伤。该方法不需加压即可实施,具备潜在的应用价值。
曾友根[4]（2020）在《NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究》文中研究说明目的:本研究通过观察NSCs和OECs联合移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞神经营养因子,凋亡及抗凋亡蛋白因子表达影响,探讨细胞移植对SNHL损伤耳蜗细胞保护作用的部分机制。方法:（1）细胞培养:选取胎鼠作为移植细胞组织来源,对NSCs和OECs培养、形态观察及鉴定。（2）动物造模:采用庆大霉素对大鼠进行SNHL造模,将筛选出符合要求的大鼠随机分为实验组和对照组,每组10只,实验组予NSCs和OECs联合移植,对照组予输注人工外淋巴液代替细胞移植。（3）细胞移植:将荧光标记的NSCs和OECs通过圆窗植入耳蜗内,术后记录各组大鼠体重变化,检测大鼠ABR听力阈值变化和听觉耳动反射阈值,并采集样本检测。（4）耳蜗切片HE染色。（5）耳蜗免疫荧光染色检测移植后NSCs和OECs荧光标记物。（6）TUNEL法检测凋亡细胞阳性细胞数和MOD值。（7）免疫组织化学法检测神经营养因子及凋亡免疫阳性细胞。（8）Western-blot法检测样本BDNF、NT-3和Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达影响。结果:（1）细胞培养鉴定结果:NSCs染色鉴定标记物呈nestin阳性,OECs染色鉴定标记物呈p75NTR阳性,培养获得了纯度较高的细胞。（2）听觉耳动反射检测结果:实验组大鼠耳廓反射阈值改善,耳廓抖动变化增强,对照组改变不明显。（3）ABR阈值变化结果:与对照组比较,实验组在1周后ABR阈值变化不明显（P>0.05）,在2周后实验组ABR阈值变化升高（P<0.05）。（4）耳蜗免疫荧光染色结果:实验组移植后NSCs标记分化的细胞部分能表达神经元细胞标志物Nestin,OECs标记分化的细胞分能表部达OECs标志物p75NTR,对照组耳蜗未发现荧光标记的细胞。（5）HE染色结果:对照组见内、外毛细胞变性坏死,SGCs部分坏死,核萎缩,损伤明显,细胞空泡样变性,密度降低,排列疏松混乱不齐,实验组整体病理损伤减低。（6）TUNEL阳性细胞数检测结果:与对照组比较,实验组TUNEL阳性细胞数明显减少（P<0.05）,细胞凋亡指数占比减少,MOD值减少（P<0.05）。（7）免疫组化检测结果:与对照组比较,实验组BDNF和NT-3阳性细胞数及IOD值明显增多（P<0.05）,同时抗凋亡因子Bcl-2阳性细胞数及IOD值升高,促凋亡因子Bax、Caspase-3阳性细胞数及IOD值减少（P<0.05）。（8）Western-blot检测结果:与对照组比较,实验组耳蜗组织样本中BDNF、NT-3,Bcl-2蛋白表达水平升高,Bax、Caspase-3蛋白表达水平降低（P<0.05）。结论:（1）NSC联合OEC移植对SNHL大鼠耳蜗具有保护作用,能减轻耳蜗细胞的损伤。（2）NSC联合OEC移植可能通过调节神经营养因子的表达水平而参与了耳蜗细胞的保护过程。（3）NSC联合OEC移植可能通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2,下调凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达路径而参与了对SNHL耳蜗细胞凋亡的保护机制。
胡金金[5]（2020）在《静脉注射Ngb转染ADSCs联合瑞格列奈靶向治疗大鼠脊髓损伤的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:研究静脉注射脑红蛋白（Neuroglobin,Ngb）转染脂肪干细胞（Adipose-derived stem cells,ADSCs）联合瑞格列奈对大鼠脊髓损伤的疗效,为临床治疗脊髓损伤提供理论依据。方法:1.取3月龄的健康SD大鼠一只,从腹股沟区脂肪组织中提取ADSCs,细胞传代培养至第三代,流式细胞仪检测传代细胞表面抗原,鉴定为ADSCs后浓缩冻存。将Ngb通过聚合酶链反应（PCR）扩增,与慢病毒载体pLenti6.3-IRES—EGFP成功连接,再转染293T细胞,最后将病毒液转染ADSCs。荧光显微镜检测GFP的表达,蛋白印迹法（Western blot,WB）检测ADSCs中Ngb表达;用超顺磁性氧化铁纳米颗粒（Superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs）标记Ngb成功转染的AD SCs,检测ADSCs的移植效率及存活率。2.采用改良Allen?s法建立大鼠脊髓损伤模型48只,随机分为空白对照组、瑞格列奈组、转染干细胞组、转染干细胞+瑞格列奈（即联合组）。转染干细胞组、联合组均分别静脉注射0.3ml SPIONs标记Ngb转染的ADSCs（1×107/ml）,1次/日,共6d。联合组、瑞格列奈组分别予以瑞格列奈（0.4mg/kg）灌胃,1次/日,共6d。空白对照组注射等量的DMEM培养基。3.各组实验大鼠分别在第1d、3d、5d、1w、2w和4w采用损伤行为学（Basso-Beattie-Bresnaha n,BBB）法对大鼠脊髓损伤程度进行评分,在1w和4w分别行HE染色、透射电镜观察大鼠脊髓病理变化,WB检测脊髓组织Ngb的表达情况。结果:1.ADSCs的提取及鉴定:从SD大鼠腹股沟脂肪组织成功分离出ADSCs,传代培养后经流式细胞学技术检测细胞表面抗原CD49d、CD44的表达分别为47.21%、50.05%,CD14、CD45的表达分别为0.72%、2.57%。2.Ngb的示踪:Ngb转染的ADSCs培养至第3天时发现有明显GFP表达,采用培养后5天的Ngb转染的ADSCs进行动物实验,在第1W,第2W及第4W转染干细胞组大鼠脊髓组织内均检测到GFP的表达,提示Ngb在脊髓损伤部位有表达,且随时间的延长表达逐渐增多。3.SPIONs标记的ADSCs存活率检测结果:SPIONs标记的ADSCs组第1d、第3d、第5d存活率分别为96.12±0.75%、95.35±1.24%、95.61±1.35%,未被SPIONs标记的ADSCs组第1d、第3d、第5d存活率分别为95.43±1.12%、96.45±1.70%、96.10±0.12%,两组无统计学差异（P>0.05）。4.BBB评分:造模后3d各组大鼠BBB评分均在0-2分,四组两两比较,差异无统计学意义（P>0.05）,提示造模成功;造模后5d、7d、14d、28d四组大鼠BBB评分趋势始终为:空白对照组低于瑞格列奈组,瑞格列奈组低于转染干细胞组,联合组最高,四组间两两比较,差异有统计学意义（P<0.05）。5.HE染色结果:第1w时各组大鼠脊髓组织中均出现不同程度的炎症细胞及成纤维细胞浸润、组织紊乱、神经细胞空泡样变及残留组织间隔增大等改变,其中空白对照组最为明显,瑞格列奈组炎症细胞浸润相对较少,神经元空泡样变数量较少,转染干细胞组及联合组的病理改变最少;第4w时各组大鼠脊髓组织出现不同程度组织排列紊乱、胶质瘢痕形成、神经元空泡样变,空白对照组比瑞格列奈组明显,瑞格列奈组比转染干细胞组明显,联合组改变最少。6.电镜结果:第1w时各组大鼠脊髓组织中神经髓鞘结构水肿粘连、突触间隙增大及神经突触减少等改变。第4w时神经组织脱髓鞘病变加重、部分髓鞘消失、出现神经元细胞溶解及胶质细胞数量增多等改变,以上两个时间点的观察结果显示空白对照组改变比瑞格列奈组明显,瑞格列奈组改变比转染干细胞明显,联合组改变最少。7.WB检测Ngb结果:空白对照组、瑞格列奈组、转染干细胞组及联合组第1w时Ngb表达量分别为0.08±0.04、0.09±0.03、0.41±0.10、0.45±0.09,第4w时Ngb表达量分别为0.12±0.04、0.15±0.02、0.61±0.08、0.72±0.12,两个时间点空白对照组和瑞格列奈组与联合组比较,差异有统计学意义（P<0.05）,联合组Ngb表达量最多,神经功能恢复最好。结论:静脉注射Ngb转染的ADSCs能靶向迁移到脊髓损伤部位,并且对大鼠脊髓损伤具有一定疗效,联合瑞格列奈治疗效果更加明显。
唐浩帅[6]（2020）在《慢病毒载体介导Shh基因转染雪旺细胞移植修复脊髓损伤的实验研究》文中研究说明【目的】脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）后的神经功能恢复一直是困扰医学界的难题,其中轴突的再生和髓鞘化是突破这一难题的重要修复方式,本研究通过慢病毒介导音猥因子（Sonic Hedgehog,Shh）转染大鼠雪旺细胞,持续稳定分泌Shh因子,同时促进雪旺细胞的增殖活性以及分泌神经营养因子功能,移植稳定表达Shh因子的雪旺细胞于脊髓损伤部位,探讨Shh因子联合雪旺细胞在修复脊髓损伤中的作用及其发挥协同作用的相关机制,为细胞移植联合基因修饰促进SCI修复提供新策略。【方法】1.大鼠雪旺细胞的分离、培养和鉴定:本研究选取出生后3-5天的SD（Sprague Dawley）大鼠,在其坐骨神经中分离雪旺细胞（Schwann Cells,SCs）,通过双酶消化和差速贴壁对雪旺细胞进行分离、培养以及纯化,S-100免疫荧光对雪旺细胞进行鉴定。2.慢病毒转染雪旺细胞及筛选:构建p LVX-IRES-Puro-Shh慢病毒表达载体,将纯化后的雪旺细胞传代至6孔板中加入病毒工作液,转染成功后加入嘌呤霉素筛选出稳定表达Shh因子的雪旺细胞（S-SCs）。3.检测细胞活性及表达因子:利用MTT法进行细胞活性测定,绘制细胞生长曲线;多时间点ELISA法检测Shh因子及BDNF、NGF的表达水平的变化。4.动物模型的建立及移植后行为学评价:雌性SD大鼠（240±10g）,8周龄,采用Impactor Model II打击系统,建立脊髓挫伤模型,大鼠SCI后7天,在损伤部位进行移植。行为学评价包括SCI后当天以及SCI后12周内每隔2周对各组大鼠进行BBB评分,评估各组大鼠后肢功能的恢复情况。5.移植后损伤区域神经细胞改变:SCI后第12周,通过NF200标记轴突,损伤中心横切染色,观察脊髓损伤局部轴突改变情况;SCI后第2、12周,通过Nestin标记神经干细胞、Olig2标记少突胶质细胞前体细胞、GFAP标记星形胶质细胞,损伤中心横切染色,观察神经细胞的增殖和分化情况。6.移植后损伤区域白质和髓鞘改变:SCI后第2、12周,各组大鼠以损伤部位为中心进行横切,行甲苯胺蓝染色,高倍镜下观察损伤局部的白质和髓鞘改变。【结果】1.细胞形态与生长情况观察:经筛选后转染Shh因子的雪旺细胞符合典型雪旺细胞特征,S-100染色观察转染Shh因子雪旺细胞与正常细胞形态一致。纯化培养后光镜下观察各组雪旺细胞生长情况,S-SCs组细胞密度高于SCs组与V-SCs组,慢病毒转染后未对细胞生长产生负担。2.细胞增殖活性及表达因子检测:通过MTT法检测发现细胞增殖曲线为指数型,S-SCs组细胞增殖活性高于V-SCs组和SCs组,无负代谢影响,其差异具有统计学意义（P<0.05）;通过ELISA法进行不同时间点Shh、BDNF和NGF含量检测,S-SCs组明显高于SCs组和V-SCs组,可持续稳定分泌至第8周。3运动功能评价:脊髓损伤后12周内对动物进行BBB评分,各组大鼠后肢功能均有恢复,在损伤后第12周,与DMEM移植组和SCs移植组相比,S-SCs移植组BBB评分最高,其差异具有统计学意义（P<0.01）,S-SCs移植组更好的促进了大鼠后肢的运动功能恢复。4.移植后损伤区域神经细胞改变:免疫荧光染色结果显示,与SCs移植组组和DMEM移植组相比,S-SCs移植组的损伤中心NF200阳性细胞数最多（P<0.01）;在损伤后第2周和12周,免疫荧光染色结果显示损伤中心Nestin阳性细胞、损伤中心及周围白质的Olig2阳性细胞数,S-SCs移植组最多,SCs移植组和DMEM移植组较少（P<0.01）;损伤后第2周,损伤区域GFAP阳性细胞数DMEM移植组多于SCs移植组和S-SCs移植组（P<0.05）,至第12周S-SCs移植组GFAP阳性细胞数最少,其差异具有统计学意义（P<0.01）。5.移植后损伤局部白质和髓鞘的改变:在SCI第2周时,各组SCI中心白质区损伤严重;第12周时,DMEM组白质区域神经纤维结构不清,排列紊乱;而S-SCs组白质区域神经纤维结构清晰,可见囊性结构中有髓鞘出现,与DMEM组相比可明显改善SCI后损伤面积,减少慢性期的空洞形成。【结论】1.雪旺细胞通过慢病毒转染Shh基因后,能够持续、稳定表达Shh因子,提高雪旺细胞的增殖活性以及神经营养因子BDNF、NGF的表达水平,并且其效果具有长期稳定的特征。2.脊髓损伤局部移植持续稳定表达Shh因子的雪旺细胞,较单纯移植SCs或DMEM,可显着减少损伤区域胶质瘢痕形成,促进损伤区域轴突再生和髓鞘化,促进大鼠后肢功能恢复。3.Shh因子能够增强雪旺细胞的自身活性,并维持稳定表达,通过基因修饰手段将雪旺细胞与Shh因子联合,优势互补,产生协同作用,在损伤后激活内源性神经细胞,促进神经干细胞向少突胶质细胞方向分化,保护轴突并促进轴突的再髓鞘化,为基因修饰联合细胞移植修复脊髓损伤提供新策略。
张文[7]（2020）在《BMP-7基因转染BMSCs移植对大鼠脊髓损伤后神经元修复的初步研究》文中研究表明研究目的:脊髓损伤目前尚无有效治疗方式,本研究以慢病毒载BMP-7基因转染骨髓间充质干细胞,诱导其向神经元分化;并将慢病毒载BMP-7基因转染的BMSCs移植治疗大鼠脊髓损伤,探究对大鼠脊髓损伤神经元修复的影响,为促进脊髓功能修复提供新的靶点和策略。方法:体外培养大鼠BMSCs,随机分为空白对照组（常规培养）、LV-GFP组（转染LV-GFP）、LV-BMP7-GFP组（转染LV-BMP7-GFP）,采用倒置显微镜观察细胞形态,成脂诱导分化、成骨诱导分化检测细胞分化能力,MTT法检测细胞存活率,免疫细胞化学实验检测神经元标记物NF-200、SYN1表达情况,qRT-PCR检测NF-200、SYN1mRNA表达情况。采用Allen’s打击装置制作大鼠脊髓损伤模型,随机分为假手术组（常规饲养）、模型组（脊髓蛛网膜腔内注射生理盐水）、BDNF组（脊髓蛛网膜腔内注射BDNF）、BMSCs组（脊髓蛛网膜腔内注射BMSCs）、LV-BMP7-BMSCs组（脊髓蛛网膜腔内注射LV-BMP7-BMSCs）;治疗后6 h、1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d采用BBB评分评估大鼠后肢功能,采用免疫组织化学实验、qRT-PCR、WesternBlot检测神经元修复指标NF-200、GFAP表达情况。结果:1、慢病毒载BMP-7基因转染后,LV-GFP组和LV-BMP7-GFP组BMSCs存活率与转染前相比,无显着性差异（P>0.05）;LV-GFP转染后3 d,MOI=10组平均荧光强度最高（P<0.05）。2、细胞免疫组化结果显示:空白对照组和LV-GFP组NF-200、SYN1表达呈阴性;LV-BMP7-GFP组NF-200、SYN1表达呈阳性,胞体和轴突被染成亮棕黄色。3、细胞qRT-PCR结果显示:LV-BMP7-GFP组NF-200、SYN1 mRNA相对表达量高于对照组和LV-GFP组（P<0.05）。4、脊髓损伤治疗后14 d,BDNF组、LV-BMP7-BMSCs组大鼠BBB评分高于模型组和BMSCs组（P<0.05）;治疗21 d、28 d后,LV-BMP7-BMSCs组大鼠BBB评分高于模型组、BDNF组和BMSCs组（P<0.05）。5、与假手术组相比,BDNF组、BMSCs组和LV-BMP7-BMSCs组大鼠脊髓组织中NF-200表达水平升高（P<0.05）;BDNF组和LV-BMP7-BMSCs组NF-200表达水平高于模型组、BMSCs组（P<0.05）。6、与假手术组相比,其他各组大鼠脊髓损伤后GFAP表达水平升高（P<0.05）;模型组、BDNF组、BMSCs组和LV-BMP7-BMSCs组之间GFAP表达水平无统计学差异（P>0.05）。结论:1、慢病毒载BMP-7基因转染BMSCs后得到的细胞形态与神经元样细胞相似,神经元标记物阳性表达,证明慢病毒载BMP-7基因转染BMSCs,促进其向神经元分化。2、慢病毒载BMP-7基因转染BMSCs移植治疗脊髓损伤,可促进脊髓损伤神经元修复,一定程度恢复神经功能,为临床治疗脊髓损伤提供理论依据。
吴宇[8]（2020）在《低强度脉冲超声激励雪旺细胞移植修复脊髓损伤的实验研究》文中认为[目的]脊髓损伤（Spinal cord injuries,SCI）是一种高度致残性疾病,改善脊髓损伤后局部微环境促进损伤轴突再生和神经功能恢复已成为当前研究的重要方向。在脊髓损伤微环境中,神经营养因子是调节失衡微环境中多种病理生理过程的重要蛋白分子,其在保护细胞存活、改善炎症反应、促进轴突再生以及再髓鞘化过程中起着不可替代的作用。研究表明,雪旺细胞（Schwann cells,SCs）通过分泌BDNF、NT-3、NGF、FGF、GDNF等多种神经营养因子,协同作用于损伤后微环境,促进神经功能的恢复。前期研究证明,低强度脉冲超声（Low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS）可以促进包括骨髓间充质干细胞、神经干细胞等细胞的神经营养因子的分泌。本研究旨在利用雪旺细胞分泌多样神经营养因子的特性,采用LIPUS体外激励雪旺细胞促进神经营养因子的分泌,通过移植LIPUS激励的雪旺细胞到脊髓损伤局部发挥神经保护作用及炎症调节作用,促进脊髓损伤大鼠轴突再生和运动功能恢复,为脊髓损伤的细胞移植联合疗法提供一种新的方法。[方法]本实验分为两个部分:（1）分离培养雪旺细胞及激活态雪旺细胞（预损伤7天）;观测LIPUS激励的雪旺细胞（LIPUS-SCs）在神经营养因子分泌、细胞增殖、凋亡、迁移等生物学特性方面的改变,评价LIPUS对雪旺细胞的调控作用;并与激活态雪旺细胞进行比较评价。（2）观察LIPUS-SCs细胞移植后,对损伤后微环境的改善作用及胶质瘢痕形成、轴突生长、再髓鞘化情况;探讨LIPUS-SCs细胞移植通过NRG1/ErbB信号通路促进轴突再生修复脊髓损伤的作用机制。体外实验部分:雪旺细胞及激活态雪旺细胞的分离、纯化及鉴定:从4周龄雌性Wistar大鼠的坐骨神经中分别提取雪旺细胞及激活态雪旺细胞（预损伤7天）,使用双重酶消化和差速贴壁法对细胞进行培养纯化。S-100荧光染色鉴定细胞纯度。LIPUS激励系统的建立及实验分组:对纯化至第3代的雪旺细胞进行强度为50m W/cm2,每次5min,连续3d的刺激。本部分研究分为三组:SC组、LIPUS-SCs组与ASCs组。LIPUS调节细胞生物学特性相关检测:采用ELISA法检测上清液中BDNF、NT-3、NGF的表达水平,探究LIPUS激励对于雪旺细胞神经营养因子表达的影响;CCK-8法检测雪旺细胞细胞增殖活性;Annexin V-FITC/PI双染色法检测雪旺细胞细胞凋亡情况;Transwell细胞迁移实验评价体外雪旺细胞细胞迁移情况。通过与ASCs组进行比较,综合评价LIPUS对雪旺细胞的调控作用效果。体内实验部分:动物实验模型及分组:60只成年雌性wistar大鼠,建立脊髓胸10（T10）节段脊髓损伤大鼠模型,分为4组:假手术组（Sham组）、损伤组（Injury组）、SCs移植组、LIPUS-SCs移植组。于脊髓损伤后第7天进行细胞移植治疗。大鼠运动功能恢复的行为学评价:从损伤后即刻开始,每周1次直到第8周实验结束,对各组大鼠进行BBB评分,观察其运动功能恢复情况。神经营养因子及炎症因子改变检测:ELISA法检测脊髓组织神经营养因子BDNF、NT-3、NGF;Western blot检测炎症因子IL-1β、IL-10的改变情况。综合评价LIPUS-SCs细胞移植对神经保护及炎性调节的作用。损伤后局部组织保留及炎症改变检测:在脊髓损伤后8周,取大鼠灌注脊髓组织用于HE染色以观察各组组织保留及炎症改变情况。轴突再生及星形胶质细胞活化情况检测:在脊髓损伤后8周,对脊髓纵切切片进行神经丝蛋白-200（NF200）,胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色,DAPI染核。观察比较细胞移植后轴突生长,星形胶质细胞活化及胶质瘢痕形成情况。NRG1/ErbB信号通路改变检测:脊髓损伤后8周,Western blot法检测各组脊髓组织NRG1、ErbB2及MBP表达改变,明确LIPUS-SCs细胞移植通过NRG1/ErbB信号通路促进轴突再生修复脊髓损伤的作用机制。[结果]1.成功分离纯化了雪旺细胞及激活态雪旺细胞（预损伤7天）,经S-100荧光染色鉴定,细胞纯度在95%以上。2.LIPUS激励促进雪旺细胞BDNF、NT-3、NGF的分泌表达:在接受LIPUS激励后,LIPUS-SCs组中BDNF、NT-3、NGF的表达与SCs组相比明显升高,差异具有统计学意义（P<0.01）;与ASCs组的神经营养因子分泌情况对比发现,达到与ASCs相似表达水平（P?0.05）。3.LIPUS激励提高雪旺细胞增殖活性:与未经LIPUS处理的SCs组相比（100%）,LIPUS-SCs组的细胞活性明显提高（114.1%±1.754%）,差异具有统计学意义（P<0.01）。同时,与ASCs组的细胞活性（112.5%±2.032%）对比发现,LIPUS-SCs组的细胞活性高于ASCs组（P<0.05）。4.LIPUS激励是一种安全的物理干预方式:Annexin V-FITC/PI双染色法发现,LIPUS激励后的雪旺细胞凋亡率比正常雪旺细胞低（2.003%±0.4888%vs.1.447%±0.1050%,P?0.05）,LIPUS激励不会诱发细胞凋亡。5.LIPUS激励促进雪旺细胞迁移:通过Transwell细胞迁移实验发现,结晶紫染色的细胞数量在LIPUS-SCs组（53.50±4.203个/视野）显着高于SCs组（31±4.761个/视野）,差异具有统计学意义（P<0.01）。在ASCs组也观察到较多的结晶紫染色细胞（57.50±6.557个/视野）,与LIPUS-SCs组相比差异没有统计学意义（P?0.05）。6.LIPUS-SCs细胞移植促进大鼠运动功能恢复:在细胞移植后,到第8周大鼠后肢功能均有一定恢复;到第8周实验结束时,大鼠BBB评分在LIPUS-SCs移植组（15.667±0.578分）最高,SCs移植组（14±0分）次之,injury组（6.333±0.578分）最低,差异具有统计学意义（P<0.01）。7.LIPUS-SCs细胞移植促进脊髓组织局部营养因子表达并改善炎性反应:ELISA对损伤后2周脊髓损伤中神经营养因子的分泌进行检测,结果表明,LIPUS-SCs细胞移植组中脊髓局部BDNF、NT-3、NGF表达水平最高,优于SCs移植组,差异具有统计学意义（P<0.01）。LIPUS-SCs细胞移植还有很好的炎性调节作用,其可以抑制促炎症因子IL-1β过度表达,促进抑炎因子IL-10的表达上升。8.LIPUS-SCs细胞移植促进神经功能恢复:HE染色显示,细胞移植尤其是LIPUS-SCs细胞移植有助于损伤后组织形态的保留,减少脊髓空洞形成及炎性细胞的浸润;NF200/GFAP免疫荧光双标染色显示,在SCs及LIPUS-SCs细胞移植组中,和Injury组相比,观察到更多的NF200标记的轴突生长,而GFAP免疫荧光强度明显低于Injury组（P<0.05）;且LIPUS-SCs移植组中NF200阳性轴突的数量及平均长度明显多于SCs移植组（P<0.05）。9.LIPUS-SCs细胞移植通过激活NRG1/ErbB信号通路促进轴突再生修复脊髓损伤:通过Western blot对NRG1/ErbB信号通路关键蛋白进行检测,结果显示,LIPUS-SCs组中,NRG1,ErbB2及MBP的蛋白表达水平较SCs组明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。[结论]1.低强度脉冲超声激励雪旺细胞,可以显着提高营养因子BDNF、NT-3和NGF的表达;促进细胞迁移能力及细胞增殖活性;且不会诱发细胞凋亡,是一种安全的物理干预方式。2.与预损伤获得的激活态雪旺细胞相比,LIPUS-SCs可以达到与之相似的营养因子分泌及细胞迁移能力,为雪旺细胞的高效获取提供了一种新的方法。3.LIPUS-SCs细胞移植有利于损伤组织的保留,可以有效促进局部营养因子分泌,调节炎症反应,抑制反应性星形胶质细胞增生,有助于脊髓损伤后轴突再生及轴突生长,获得更好的运动功能恢复。4.LIPUs-SCs细胞移植通过激活NRG1/ErbB信号通路促进轴突再生修复脊髓损伤。
唐亮[9]（2018）在《SHH基因转染激活态雪旺细胞移植修复脊髓损伤的实验研究》文中指出【目的】脊髓损伤临床修复面临难题,再髓鞘化是修复的主要瓶颈之一,本课题通过脂质体介导音猥因子（Sonic Hedgehog,SHH）基因转染大鼠激活态雪旺细胞,过表达音猥因子并增强激活态雪旺细胞增殖和表达神经营养因子的活性,将其移植于损伤局部,探讨音猥因子和激活态雪旺细胞修复脊髓损伤的有效性,并分析两者促进损伤后轴突髓鞘化的协同作用及其机制。【方法】体外研究1.激活态雪旺细胞的分离培养、鉴定和基因转染:选择出生4-6天SD（Sprague Dawley）大鼠,预结扎坐骨神经激活雪旺细胞（Schwann Cells,SCs）,1周后切取损伤神经,分离培养、纯化SCs,S100免疫荧光鉴定,保证纯度>95%,未预结扎坐骨神经分离获得未激活SCs作为对照。pEGFP-N1-SHH表达质粒已经构建并进行验证,脂质体介导pEGFP-N1-SHH和空载质粒pEGFP-N1转染激活态雪旺细胞（Activated Schwann Cells,ASCs）,流式细胞分选绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）表达阳性细胞。2.细胞活性检测:流式分选后对数生长期细胞5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU）染色观察细胞增殖情况,转染后不同时期酶联免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测SHH因子及脑源性神经营养因子（Brain-Derived Neurotrophic Factor,BDNF）、神经生长因子（Nerve Growth Factor,NGF）的表达情况。Ⅰ组为未激活SCs组,Ⅱ组为未转染的ASCs组,Ⅲ组为转染空载质粒的ASCs（Vector-ASCs,V-ASCs）组,Ⅳ组为转染SHH基因的ASCs（SHH-ASCs,S-ASCs）组。体内研究1.大鼠脊髓损伤模型制备及分组:8-10周龄雌性SD大鼠,共计216只,IMPACTOR MODEL-Ⅱ脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）打击系统制作胸10（Thoracic 10,T10）节段脊髓打击模型,A组为DMEM移植组,B组为ASCs移植组,C组为S-ASCs移植组。2.细胞移植和行为学评价:SCI后1周损伤局部细胞移植。SCI后和移植后当天,SCI后每2周到第12周,每组8只,进行BBB评分（Basso,Beattie&Bresnahan locomotor rating scale）对各组大鼠后肢功能恢复情况进行评估。3.SCI后局部SHH因子表达:SCI后第2、4、8、12周,每组8只,SCI中心5mm节段,组织蛋白抽提试剂（Tissue Protein Extraction Reagent,T-PER）联合超声裂解提取总蛋白,二喹啉甲酸（Bicinchoninic Acid,BCA）法总蛋白定量,ELISA法测定SHH因子表达水平。4.SCI后局部轴突改变:SCI后第12周,每组8只,SCI中心行神经丝蛋白200（Neurofilament Protein 200,NF200）免疫荧光染色,4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）核染,轴突计数,观察脊髓损伤局部轴突改变情况。5.损伤局部神经细胞增生及分化:SCI后第2、12周,每组8只,SCI中心分别行巢蛋白（Nestin）、少突胶质细胞转录因子-2（Oligodendrocyte transcription factor-2,Olig2）（增加损伤中心周围白质）、胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP）免疫荧光染色,DAPI核染,细胞计数,观察脊髓损伤局部神经细胞增殖和分化。6.损伤局部白质及髓鞘变化:SCI后第4、12周,每组8只,SCI中心快蓝（Luxol fast blue,LFB）髓鞘染色,计算白质面积比例、髓鞘面积比例,观察脊髓损伤局部白质、髓鞘变化。7.数据统计分析:数据收集、统计采用SPSS 20.0软件完成,数据均使用`X±S表示。多组均数之间采用单因素方差分析法进行显着性检验,并利用LSD法进行多组均数之间的两两显着性检验;两组均数之间比较应用t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。【结果】体外研究1.细胞增殖观察:EdU染色发现Ⅳ组（S-ASCs,26.17±4.03%）染色阳性率最高,Ⅱ组（ASCs,20.41±3.16%）和Ⅲ组（V-ASCs,19.34±2.82%）其次,Ⅰ组（SCs,11.86±2.98%）最低,具有统计学意义（P<0.05）。2.SHH、BDNF和NGF的表达:Ⅰ组和Ⅱ组经传代、Ⅲ组和Ⅳ组经流式分选后培养1、2、4、6、8周,不同时期SHH、BDNF和NGF的表达,Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组均高于Ⅰ组,其中Ⅳ组表达水平最高,具有统计学意义（P<0.05）。体内研究1.行为学评价:SCI后第2周到第12周各组大鼠后肢功能都有恢复,SCI后第12周实验结束时,C组（16.13±2.03分）最高,B组（13.50±1.77分）其次,A组（9.25±1.58分）最低,具有统计学意义（P<0.01）。2.SCI后局部SHH因子的表达:SCI后第2、4周,C组表达水平最高,B组其次,A组最低,具有统计学意义（P<0.01）,第8、12周,3组表达水平比较无统计学意义（P?0.05）,基本接近正常大鼠脊髓表达水平。3.SCI后局部轴突改变:SCI后第12周,SCI中心轴突（NF200阳性）计数C组（55.13±12.16根/视野）最多,B组（23.63±8.75根/视野）其次,A组（10.50±5.58根/视野）最少,具有统计学意义（P<0.01）。4.SCI后局部神经细胞增生及分化:SCI后第2、12周,SCI中心神经干细胞（Nestin+细胞）、损伤中心和周围白质少突胶质细胞前体细胞（Olig2+细胞）计数C组最多,B组其次,A组最少,具有统计学意义（P<0.05）,各组内比较,随时间延长无统计学意义（P?0.05）;SCI后第2周,SCI中心星形胶质细胞（GFAP+细胞）计数B组和C组多于A组,具有统计学意义（P<0.01）,至第12周C组最少,具有统计学意义（P<0.01）。5.SCI后局部白质及髓鞘变化:SCI后第4到第12周,各组大鼠白质面积比例基本稳定无改变,无统计学意义（P?0.05）,白质髓鞘面积比例B组和C组明显增加,具有统计学意义（P?0.05）;两个时间,白质面积、髓鞘面积比例C组最大,B组其次,A组最小,具有统计学意义（P<0.05）。【结论】1.脂质体介导SHH表达质粒转染激活态雪旺细胞可过表达SHH因子,强化激活ASCs,促进细胞增殖,并促进BDNF和NGF的表达,且可维持至转染后6周以上。2.亚急性期脊髓损伤局部移植SHH基因转染强化激活的ASCs,比较单纯ASCs和DMEM,可以更好的促进大鼠损伤局部轴突髓鞘化、保护轴突,获得后肢功能的恢复,确定联合SHH因子和ASCs移植修复SCI的有效性。3.SHH因子可强化激活ASCs且转染细胞可成功表达SHH因子,两者联合既提供外源性移植细胞,又激活内源性神经细胞,增加神经干细胞和少突胶质细胞前体细胞,协同促进轴突髓鞘化,保护轴突,进一步支持髓鞘化和功能恢复的相关性。
王天仪[10]（2015）在《坐骨神经预损伤后miR-124-3p调节GAP-43表达并促进轴突生长的实验研究》文中研究说明目的本研究通过观察脊髓后索损伤后大鼠背根神经节中microRNA表达水平的变化,探讨坐骨神经预损伤对脊髓后索损伤大鼠背根神经节microRNA表达的影响,以揭示坐骨神经预损伤促进脊髓后索损伤修复的机制并寻找关键microRNA,同时在细胞水平调控其表达,观察该关键microRNA对背根神经节神经元产生的影响,以期进一步找到坐骨神经预损伤的替代疗法。方法1.应用microarray 3.0芯片检测脊髓后索损伤及用坐骨神经预损伤干预后索损伤过程中发生改变的microRNA,运用生物信息学方法分析发挥调控作用的关键microRNA。2.在m RNA水平上验证目标microRNA的功能:应用查询Target Scan数据库、miRBase数据库及查阅文献的方法预测目标microRNA的靶基因,进而运用RT-q PCR技术检测坐骨神经预损伤组在各个时间点该靶基因m RNA的表达。3.在蛋白水平上验证目标microRNA的功能:本实验应用Western blot技术检测了坐骨神经预损伤组,单纯脊髓后索损伤组靶蛋白的表达量。检测坐骨神经预损伤组靶蛋白表达趋势与目标microRNA的表达趋势。4.运用免疫组化、HE染色的方法观察坐骨神经预损伤后后索损伤白质的组织形态结构、NF200、IL-1、GFAP及背根神经节中NF200指标的变化。5.运用反义microRNA寡核苷酸抑制剂在体外培养的背根神经节神经元中抑制目标microRNA,并用免疫细胞化学技术观察与空白背根神经节神经元相比其靶蛋白表达和轴突生长情况。6.在抑制目标microRNA的同时抑制其靶蛋白的活化,用于判断是否存在目标microRNA的其它靶基因能促进轴突生长。7.应用SPSS 18.0软件对所得数据进行分析。计量资料以均数±标准差（（?）±s）表示。组间比较采用方差分析（ANOVA）和SNK检验。两样本比较采用student t检验。P<0.05为有统计学意义。结果1.脊髓后索损伤及用坐骨神经预损伤干预后,共有681个microRNA在损伤后4小时、3天、7天、14天发生至少1次表达变化。全部发生变化的microRNA中miR-124-3p在单纯脊髓后索损伤后第7天、14天分别上调了5.12倍与4.17倍。这两个上升倍数在其各自所属时间点所有上调的microRNA中均位于第5位。而在坐骨神经预损伤干预组,脊髓后索损伤后第7天、14天miR-124-3p下调,分别为-3.55倍和-6.18倍,这使miR-124-3p初步纳入研究者视线。后经过RNA质检、RT-q PCR生物学与技术重复、PCA检验,芯片数据可靠（一级验证）。2.miR-124-3p在坐骨神经预损伤组的表达情况是由坐骨神经预损伤和脊髓后索损伤两个条件共同存在来实现的,单独损伤脊髓后索或单独损伤坐骨神经该microRNA无类似表达改变出现。3.生物信息学分析说明miR-124-3p在单纯脊髓后索损伤后的第7天、14天上调并执行了相似聚类的分子生物学功能,在经过坐骨神经预损伤干预后,在脊髓后索损伤后的第7天、14天下调,执行了与单纯脊髓后索损伤组不同聚类的生物学功能。4.坐骨神经预损伤使脊髓后索损伤局部及背根神经节中NF200表达增加,损伤局部神经纤维形态更加规整。而坐骨神经预损伤的存在与否对脊髓组织样本中IL-1及GFAP指标无明显影响。5.抑制miR-124-3p表达后,背根神经节神经细胞中GAP-43表达上调,轴突延长。6.应用Target Scan数据库查询及文献查阅预测miR-124-3p的靶基因为STAT3。7.miR-124-3p对STAT3蛋白表达的调控是翻译抑制。坐骨神经预损伤后背根神经节组织中STAT3及p-STAT3蛋白在后索损伤后7天和14天表达上调。单纯脊髓后索损伤后7天和14天背根神经节组织中STAT3及p-STAT3蛋白表达下调,miR-124-3p与STAT3及p-STAT3的表达趋势相反（二级验证）。8.背根神经节神经元中抑制miR-124-3p后STAT3上调免疫荧光变强、轴突增长,STAT3,p-STAT3及GAP-43上调（三级验证）。9.STAT3蛋白是miR-124-3p/STAT3/GAP-43通路不可或缺的组成部分。结论1.脊髓后索损伤及用坐骨神经预损伤干预后,共有681个microRNA在后索损伤后4小时、3天、7天和14天发生至少1次表达变化。2.miR-124-3p在单纯脊髓后索损伤后第7天、14天明显上调,而在坐骨神经预损伤干预后7天、14天表达趋势变为明显下调。3.miR-124-3p的效用靶基因是STAT3,其对STAT3蛋白表达的调控是翻译抑制。4.miR-124-3p在坐骨神经预损伤组的表达情况是由坐骨神经预损伤和脊髓后索损伤两个条件共同存在来实现的,单独损伤脊髓后索或单独损伤坐骨神经该microRNA无类似表达改变出现。5.坐骨神经预损伤使miR-124-3p在7天、14天表达下调导致背根神经节神经元中STAT3上调,通过GAP-43使背根神经节神经元轴突延长。6.miR-124-3p是坐骨神经预损伤促进脊髓后索损伤修复的关键microRNA之一,miR-124-3p/STAT3/GAP-43通路是坐骨神经预损伤促进脊髓后索损伤修复的关键通路之一。
二、脂质体介导胶质细胞源性神经营养因子基因转染对大鼠脊髓损伤后神经功能的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、脂质体介导胶质细胞源性神经营养因子基因转染对大鼠脊髓损伤后神经功能的影响（论文提纲范文）
（1）通腑逐瘀法指导下抵当汤加减调控AQP4表达治疗大鼠急性脊髓损伤的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 自制脊髓打击器与NYU打击器建立脊髓损伤模型研究 |
| 1.目的 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 6.不足和展望 |
| 第二部分 抵当汤加减调节AQP4 表达对SCI大鼠脊髓水肿的作用研究 |
| 1.目的 |
| 2.材料 |
| 3.方法 |
| 4.实验结果 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 7.不足与展望 |
| 第三部分 抵当汤加减含药血清对反应性星形胶质细胞的活化、迁移及神经生长相关细胞因子分泌的作用 |
| 1.目的 |
| 2.材料 |
| 3.实验方法 |
| 4.实验结果 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 7.不足和展望 |
| 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 附件1 自制简易打击器与NYU打击器 |
| 附件2 脊髓打击损伤模型 |
| 附录3 BBB评分 |
| 附录4 Reuter评分 |
| 附录5 综述 水通道蛋白在急性脊髓损伤中的作用机制 |
| References |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）BMP-7基因转染BMSCs治疗大鼠脊髓损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩略词汇表 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 BMSCs的分离、培养、冻存与复苏 |
| 1.5 BMSCs的鉴定 |
| 1.6 载有BMP-7 基因的慢病毒对BMSCs进行转染诱导 |
| 1.7 大鼠脊髓损伤模型的建立 |
| 1.8 行为学BBB评分 |
| 1.9 标本取材 |
| 1.10 免疫组化检测NF-200、GFAP的表达 |
| 1.11 免疫荧光检测大鼠脊髓组织中NF-200、GFAP |
| 1.12 HRP逆行神经示踪 |
| 1.13 统计学分析 |
| 二、技术路线 |
| 三、结果 |
| 3.1 BMSCs形态学观察和鉴定 |
| 3.2 慢病毒转染情况 |
| 3.3 大鼠脊髓损伤模型造模情况 |
| 3.4 大鼠BBB评分结果 |
| 3.5 免疫组化检测GFAP、NF-200 的表达情况 |
| 3.6 免疫荧光检测BMSCs移植后脊髓内NF-200、GFAP的表达 |
| 3.7 HRP逆行神经示踪结果 |
| 四、讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（3）高压氧对脊髓神经元HSP32的负调控及在减压病预防中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分:高压氧对脊髓神经元HSP32的负调控机制 |
| 一、材料和方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分:高压氧对脊髓神经元HSP32负调控的生理意义 |
| 一、材料和方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第三部分:HSP32负调控在减压病脊髓损伤预防中的应用 |
| 一、材料和方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 HSP32在中枢神经系统疾病中的作用 |
| 参考文献 |
| 在读期间论文发表和科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（4）NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要操作仪器 |
| 2.1.4 主要溶剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 组织来源、细胞提取和培养 |
| 2.2.2 NSCs的传代培养 |
| 2.2.3 OECs培养 |
| 2.2.4 NSCs的鉴定及细胞纯度的计算 |
| 2.2.5 OECs的鉴定及细胞纯度的计算 |
| 2.2.6 细胞活力测定 |
| 2.2.7 细胞冻存 |
| 2.2.8 细胞复苏 |
| 2.3 动物实验及样本检测 |
| 2.3.1 实验动物 |
| 2.3.2 主要试剂 |
| 2.3.3 主要仪器 |
| 2.3.4 主要试剂配制 |
| 2.3.5 庆大霉素耳毒性大鼠模型的建立方法 |
| 2.3.6 实验动物分组及给药 |
| 2.3.7 ABR检测大鼠听力阈值 |
| 2.3.8 听觉耳动反射检测 |
| 2.3.9 制作切片 |
| 2.3.10 切片染色 |
| 2.3.11 耳蜗免疫荧光染色 |
| 2.3.12 TUNEL法(原位切口末端标记法)检测凋亡细胞 |
| 2.3.13 免疫组织化学法检测神经营养因子及凋亡免疫阳性细胞 |
| 2.3.14 Western-blot法检测样本BDNF、NT-3和Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达 |
| 2.4 统计方法 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 细胞的形态观察及鉴定 |
| 3.1.1 NSCs的培养观察及鉴定 |
| 3.1.2 OECs的培养观察和鉴定 |
| 3.2 各组大鼠体重变化结果 |
| 3.3 大鼠听觉耳动反射检测阈值结果 |
| 3.4 各组大鼠ABR阈值变化结果 |
| 3.5 HE染色结果 |
| 3.6 耳蜗免疫荧光染色观察结果 |
| 3.6.1 耳蜗荧光标记NSC结果 |
| 3.6.2 荧光标记OEC观察结果 |
| 3.7 TUNEL法检测凋亡细胞结果 |
| 3.7.1 各组TUNEL阳性细胞数比较 |
| 3.7.2 各组MOD值比较 |
| 3.8 免疫组化检测结果 |
| 3.9 Western-blot检测各组蛋白表达水平结果 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 实验性感音神经性耳聋动物模型的制备与机制探究 |
| 4.2 神经营养因子减轻SNHL内耳神经损伤后相关机制 |
| 4.2.1 BDNF对 SGNs的保护作用机制探究 |
| 4.2.2 NT-3对SGNs的保护作用机制探究 |
| 4.3 细胞移植抑制耳蜗损伤细胞凋亡机制探索 |
| 4.3.1 Caspase结构、功能与促耳蜗细胞凋亡机制探究 |
| 4.3.2 Bcl-2 结构、功能和抗耳蜗细胞凋亡机制探析 |
| 4.3.3 细胞联合移植激活Bcl-2,抑制Caspase、Bax表达路径保护损伤耳蜗细胞探究 |
| 4.4 细胞联合移植上调神经营养因子,抑制细胞凋亡 |
| 4.5 神经性耳聋常见病因概述 |
| 4.6 神经性耳聋治疗方法概述 |
| 4.7 关于NSC和 OEC的取材、培养与鉴定探究 |
| 4.7.1 NSC的组织取材和分离 |
| 4.7.2 NSC的培养和鉴定方法选择 |
| 4.7.3 OECs的组织取材和分离 |
| 4.7.4 OECs的培养与鉴定选择 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（5）静脉注射Ngb转染ADSCs联合瑞格列奈靶向治疗大鼠脊髓损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 综述:基因治疗脊髓损伤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）慢病毒载体介导Shh基因转染雪旺细胞移植修复脊髓损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、慢病毒介导Shh因子转染雪旺细胞的体外研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验对象 |
| 1.1.2 实验仪器与试剂 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 雪旺细胞的分离培养和转染后形态学观察 |
| 1.2.2 MTT法检测细胞增殖活性 |
| 1.2.3 ELISA 法检测细胞 Shh 和神经营养因子 BDNF 及 NGF 的表达 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 Shh因子促进雪旺细胞增殖及增强分泌活性的机制 |
| 1.3.2 Shh因子的表达及其通路在脊髓损伤中的作用 |
| 1.4 小结 |
| 二、转Shh因子的雪旺细胞移植修复脊髓损伤 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 实验分组 |
| 2.1.3 实验仪器与试剂 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 大鼠行为学功能评价 |
| 2.2.2 大鼠损伤后局部的轴突改变 |
| 2.2.3 大鼠损伤后局部神经干细胞的改变 |
| 2.2.4 大鼠损伤后局部少突胶质细胞的改变 |
| 2.2.5 大鼠损伤后局部星形胶质细胞的改变 |
| 2.2.6 大鼠损伤后局部白质和髓鞘的改变 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 雪旺细胞在修复脊髓损伤中的作用 |
| 2.3.2 Shh 因子联合雪旺细胞移植对损伤局部内源性神经细胞的影响 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 细胞移植在脊髓损伤中的现状与展望 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）BMP-7基因转染BMSCs移植对大鼠脊髓损伤后神经元修复的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩略词汇表 |
| 前言 |
| 第一章 慢病毒载BMP-7 基因转染大鼠BMSCs诱导其向神经元样细胞分化的研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 骨髓间充质干细胞的分离培养[22] |
| 1.1.5 骨髓间充质干细胞鉴定 |
| 1.1.6 最佳感染复数(MOI)检测 |
| 1.1.7 慢病毒转染后骨髓间充质干细胞存活情况 |
| 1.1.8 免疫组化检测神经元样细胞标记物NF-200、SYN1 表达情况 |
| 1.1.9 qRT-PCR检测神经元样细胞标记物NF-200、SYN1 mRNA表达情况 |
| 1.1.10 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 骨髓间充质干细胞培养形态特点 |
| 1.2.2 骨髓间充质干细胞鉴定结果 |
| 1.2.3 慢病毒转染情况 |
| 1.2.4 不同时间点骨髓间充质干细胞存活率 |
| 1.2.5 转染后细胞形态学变化 |
| 1.2.6 免疫组化检测神经元样细胞标记物NF-200、SYN1 表达情况 |
| 1.2.7 qRT-PCR检测神经元样细胞标记物NF-200、SYN1 mRNA表达情况 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 慢病毒载BMP-7 基因转染大鼠BMSCs移植治疗脊髓损伤的修复作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 制作脊髓损伤动物模型 |
| 2.1.5 慢病毒载BMP-7 基因转染BMSCs |
| 2.1.6 动物分组及治疗 |
| 2.1.7 行为学评估 |
| 2.1.8 脊髓组织标本获取 |
| 2.1.9 免疫组化检测脊髓NF-200、GFAP蛋白表达情况 |
| 2.1.10 qRT-PCR检测脊髓组织NF-200、GFAP mRNA表达情况 |
| 2.1.11 Western Blot检测脊髓组织NF-200、GFAP蛋白表达情况 |
| 2.1.12 统计学处理 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 BBB评分 |
| 2.2.2 免疫组化检测脊髓组织NF-200、GFAP蛋白表达情况 |
| 2.2.3 qRT-PCR检测脊髓组织NF-200、GFAP mRNA表达情况 |
| 2.2.4 Western Blot检测脊髓组织NF-200、GFAP表达情况 |
| 2.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附件 |
（8）低强度脉冲超声激励雪旺细胞移植修复脊髓损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、低强度脉冲超声对雪旺细胞的体外调控作用研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 主要仪器和试剂 |
| 1.1.2 低强度脉冲超声激励系统完善及探头支架系统的构建 |
| 1.1.3 雪旺细胞的提取及培养 |
| 1.1.4 雪旺细胞的纯度鉴定 |
| 1.1.5 雪旺细胞的营养因子分泌检测 |
| 1.1.6 雪旺细胞的增殖活性检测 |
| 1.1.7 雪旺细胞的流式凋亡检测 |
| 1.1.8 雪旺细胞的细胞迁移检测 |
| 1.1.9 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 雪旺细胞的形态及纯度鉴定 |
| 1.2.2 LIPUS对雪旺细胞营养因子分泌的影响 |
| 1.2.3 LIPUS对雪旺细胞增殖能力的影响 |
| 1.2.4 LIPUS对雪旺细胞凋亡的影响 |
| 1.2.5 LIPUS对雪旺细胞迁移能力的影响 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 LIPUS在调节细胞生物学特征中的作用 |
| 1.3.2 雪旺细胞在中枢神经系统修复中的作用 |
| 1.3.3 雪旺细胞高效获取的方法比较 |
| 1.4 小结 |
| 二、LIPUS-SCs移植修复脊髓损伤及其机制研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验动物及分组 |
| 2.1.4 脊髓损伤动物模型的制备及护理 |
| 2.1.5 细胞移植治疗 |
| 2.1.6 大鼠BBB评分 |
| 2.1.7 ELISA检测大鼠脊髓组织内的营养因子的表达情况 |
| 2.1.8 大鼠脊髓组织HE染色 |
| 2.1.9 大鼠脊髓组织NF200/GFAP免疫荧光染色 |
| 2.1.10 Western blot法检测NRG1/ErbB信号通路的改变情况 |
| 2.1.11 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 运动功能恢复评价 |
| 2.2.2 脊髓组织营养因子表达及炎性调节情况 |
| 2.2.3 脊髓病变部位的形态学观察 |
| 2.2.4 轴突生长及星形胶质细胞活化情况 |
| 2.2.5 NRG1/ErbB信号通路关键蛋白进行检测 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 细胞移植治疗在脊髓损伤修复中的作用 |
| 2.3.2 营养因子及炎性调节在神经保护中的作用 |
| 2.3.3 NRG1/ErbB信号通路与脊髓损伤 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 图1.LIPUS设备及雪旺细胞激励模型示意图 |
| 图2.雪旺细胞及激活态雪旺细胞(预损伤7d)鉴定 |
| 图3.神经营养因子表达及细胞增殖活性变化分析 |
| 图4.LIPUS激励对细胞凋亡影响 |
| 图5.细胞迁移能力评价 |
| 图6.大鼠运动功能评分 |
| 图7.细胞移植后脊髓组织局部神经营养因子的表达 |
| 图8.细胞移植后脊髓组织局部炎症因子的表达 |
| 图9.细胞移植后脊髓组织HE染色 |
| 图10.细胞移植后脊髓组织NF200/GFAP免疫荧光染色 |
| 图11.细胞移植后脊髓组织NRG1/ErbB信号通路关键蛋白表达 |
| 综述 雪旺细胞联合移植策略在脊髓损伤修复中的应用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）SHH基因转染激活态雪旺细胞移植修复脊髓损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、音猥因子基因转染强化激活态雪旺细胞 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验对象 |
| 1.1.2 实验仪器与试剂 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.1.3.1 雪旺细胞的获取及原代培养 |
| 1.1.3.2 雪旺细胞的扩增和纯化 |
| 1.1.3.3 雪旺细胞的细胞免疫荧光染色 |
| 1.1.3.4 pEGFP-N1-SHH质粒转染雪旺细胞联合流式细胞分选 |
| 1.1.3.5 EdU染色观察细胞增殖活性 |
| 1.1.3.6 ELISA法检测细胞SHH、BDNF及NGF表达 |
| 1.1.3.7 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 细胞培养及纯度鉴定 |
| 1.2.2 EdU染色观察细胞增殖活性 |
| 1.2.3 ELISA法检测细胞SHH、BDNF及NGF表达 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 音猥因子的信号通路及其表达变化 |
| 1.3.2 激活态雪旺细胞的激活机制及其强化 |
| 1.4 小结 |
| 二、基因转染雪旺细胞移植修复脊髓损伤 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 实验仪器与试剂 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.3.1 动物模型制备 |
| 2.1.3.2 细胞移植 |
| 2.1.3.3 术后护理 |
| 2.1.3.4 行为学观察 |
| 2.1.3.5 脊髓损伤局部SHH因子表达 |
| 2.1.3.6 脊髓损伤局部轴突改变 |
| 2.1.3.7 脊髓损伤局部神经细胞增殖及分化 |
| 2.1.3.8 脊髓损伤局部白质及髓鞘变化 |
| 2.1.3.9 统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 实验动物观察 |
| 2.2.2 行为学观察 |
| 2.2.3 脊髓损伤局部SHH因子表达 |
| 2.2.4 脊髓损伤局部轴突改变 |
| 2.2.5 脊髓损伤局部神经细胞增殖及分化 |
| 2.2.6 脊髓损伤局部白质及髓鞘变化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 音猥因子对内源性神经细胞的作用 |
| 2.3.2 激活态雪旺细胞在轴突早期髓鞘化中的作用 |
| 2.3.3 音猥因子在轴突后期髓鞘化中的作用 |
| 2.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 细胞移植修复脊髓损伤的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）坐骨神经预损伤后miR-124-3p调节GAP-43表达并促进轴突生长的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、坐骨神经预损伤后脊髓后索损伤大鼠的miRNA表达谱分析 |
| 1.1 实验分组及各组大鼠背根神经节的miRNA表达谱分析 |
| 1.1.1 对象和方法 |
| 1.1.2 结果 |
| 1.2 microarray结果验证及miR-124-3p表达模式分析 |
| 1.2.1 对象与方法 |
| 1.2.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、坐骨神经预损伤及miR-124-3p对初级感觉神经元轴突生长的影响 |
| 2.1 SNCL对初级感觉神经元轴突生长的影响 |
| 2.1.1 对象和方法 |
| 2.1.2 结果 |
| 2.2 miR-124-3p对初级感觉神经元轴突生长的影响 |
| 2.2.1 对象和方法 |
| 2.2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、DRG神经元中miR-124-3p/STAT3/GAP-43 信号通路的组成及作用 |
| 3.1 DRG神经元中miR-124-3p与 STAT3、GAP-43 及轴突生长的关系 |
| 3.1.1 对象和方法 |
| 3.1.2 结果 |
| 3.2 STAT3是miR-124-3p/STAT3/GAP-43 通路的关键组成部分 |
| 3.2.1 对象和方法 |
| 3.2.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 JAK-STAT通路在脊髓损伤后的神经干细胞、神经祖细胞和活化的星形胶质细胞中的作用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
四、脂质体介导胶质细胞源性神经营养因子基因转染对大鼠脊髓损伤后神经功能的影响（论文参考文献）
- [1]通腑逐瘀法指导下抵当汤加减调控AQP4表达治疗大鼠急性脊髓损伤的作用机制研究[D]. 吴子健. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [2]BMP-7基因转染BMSCs治疗大鼠脊髓损伤的实验研究[D]. 高磊. 石河子大学, 2021(02)
- [3]高压氧对脊髓神经元HSP32的负调控及在减压病预防中的应用[D]. 周全. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [4]NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究[D]. 曾友根. 南昌大学, 2020(08)
- [5]静脉注射Ngb转染ADSCs联合瑞格列奈靶向治疗大鼠脊髓损伤的实验研究[D]. 胡金金. 遵义医科大学, 2020(12)
- [6]慢病毒载体介导Shh基因转染雪旺细胞移植修复脊髓损伤的实验研究[D]. 唐浩帅. 天津医科大学, 2020(06)
- [7]BMP-7基因转染BMSCs移植对大鼠脊髓损伤后神经元修复的初步研究[D]. 张文. 石河子大学, 2020(08)
- [8]低强度脉冲超声激励雪旺细胞移植修复脊髓损伤的实验研究[D]. 吴宇. 天津医科大学, 2020
- [9]SHH基因转染激活态雪旺细胞移植修复脊髓损伤的实验研究[D]. 唐亮. 天津医科大学, 2018(01)
- [10]坐骨神经预损伤后miR-124-3p调节GAP-43表达并促进轴突生长的实验研究[D]. 王天仪. 天津医科大学, 2015(05)