一、蓝舌病病毒人工感染绵羊抗体的监测及分型血清的制备（论文文献综述）
殷佳佳[1]（2020）在《蓝舌病1型病毒VP2蛋白的可溶性表达纯化及免疫原性分析》文中研究指明蓝舌病（Bluetongue,BT）是由蓝舌病毒（Bluetongue virus,BTV）感染引起的一种以昆虫为传播媒介的反刍动物的病毒性传染病,临床症状主要为鼻和唇粘膜充血、流涎、呼吸困难、舌头发绀。BT在世界范围内广泛流行,对全球畜牧养殖业危害极大。预防接种是防控BT的有效措施之一,市场上用来防控BT的疫苗主要有减毒活疫苗和灭活疫苗,但两者都有一定的缺点,目前仍无安全、高效的疫苗上市。VP2蛋白位于BTV外壳的最外层,含有主要的抗原决定簇,能诱导机体产生中和性抗体,在机体抗病毒免疫过程中发挥重要作用。有研究证实,单独的VP2蛋白足以使机体产生保护性免疫应答。本研究旨在利用原核表达系统表达可溶的BTV1 VP2蛋白,并对其免疫原性进行分析,为进一步开展BTV1 VP2蛋白的相关研究奠定基础。本研究采用PCR方法扩增BTV1 VP2基因序列,构建重组质粒p ET-28a-VP2。将阳性重组质粒转化BL21（DE3）和Rosetta（DE3）感受态细胞,诱导表达,并对其进行鉴定。结果表明,两种菌株均能表达重组VP2蛋白,分子量约为109 KDa,在Rosetta（DE3）菌株中可溶性表达效果更好;同时,对Rosetta（DE3）菌株的表达条件进行优化。结果显示,IPTG浓度为0.6 mmol/L、16℃诱导表达16 h时,重组VP2蛋白可溶性表达量最高;通过镍柱亲和层析法纯化重组VP2蛋白,Bradford法测定其浓度为0.4 mg/m L。Western-blot结果显示,重组VP2蛋白能与BTV1阳性血清反应。表明本研究制备的重组VP2蛋白具有良好的免疫反应性。纯化的重组VP2蛋白,以30μg/只的剂量免疫5只6～8周龄Balb/c小鼠,每3周免疫一次,免疫三次。Dot-ELISA结果表明,小鼠的免疫血清能与BTV1灭活病毒发生特异性反应;间接ELISA结果显示小鼠血清效价可达1:2.048×105,说明经重组VP2蛋白免疫后的小鼠体内产生了高水平的特异性抗体;间接免疫荧光（IFA）结果显示,经重组VP2蛋白免疫后产生的抗体能与真核系统表达的VP2蛋白发生特异性反应。本研究表达的重组VP2蛋白不仅为研究其结构和功能提供了实验材料,还为研发安全、高效的BT亚单位疫苗奠定了基础。
韩娇月[2]（2020）在《蓝舌病Ⅰ型病毒VP3蛋白的可溶性表达纯化及免疫原性分析》文中研究表明蓝舌病是由蓝舌病病毒（Bluetongue virus,BTV）引起的一种非接触性传染疾病,通过库蠓属的媒介昆虫在家养或者野生的反刍类动物之间进行传播。受BTV感染的绵羊通常表现出发热、粘膜水肿、溃疡等临床症状。BTV病毒为二十面体对称的RNA病毒,有27种不同血清型。BTV由7种结构蛋白（VP1～VP7）和5种非结构蛋白（NS1,NS2,NS3/NS3a,NS4,NS5）组成。L3基因所编码的VP3蛋白,相对来说是高度保守的结构蛋白,含有群特异性抗原决定簇,是病毒颗粒的主要核心蛋白。本研究通过原核表达系统正确表达蓝舌病I型病毒VP3蛋白并完成纯化,以此来研究该蛋白刺激机体产生保护作用和特异性抗体的情况。构建了p ET-32a-VP3、p ET-28a-VP3、p ET-28a-Nus A-VP3这3个重组载体,转化E.coli BL21（DE3）;将p ET-28a-VP3转化BL21（DE3）（Tf16）;用L-阿拉伯糖及IPTG诱导表达,以选取最优表达方案。最终选用BL21（DE3）（p ET-28a-VP3-Tf16）为最优表达菌,20℃,0.3 mmol/L的IPTG及3.5 mg/m L的L-阿拉伯糖诱导表达12小时效果最佳。在此条件下,上清中VP3蛋白的表达量比未使用分子伴侣时高出1倍。通过镍亲和层析的方法纯化蛋白,纯化后的BTV VP3纯度为75%,浓度为0.32 mg/m L。将纯化后的VP3重组蛋白以30μg/只的剂量免疫2只Balb/c小鼠,在第三次免疫后用ELISA测定血清效价,结果显示:抗体效价可达1:1.28×105;Dot-ELISA结果表明,原核表达的VP3重组蛋白能与BTV-1鼠源阳性血清反应,IFA试验结果显示,VP3重组蛋白免疫后所产生的抗体能与真核系统表达的VP3蛋白反应。本研究表明原核表达的VP3重组蛋白具有一定的免疫学反应活性,这为进一步研究BTV结构及蛋白的功能奠定了基础,为蓝舌病血清学诊断方法的建立打下了基础。
聂福平[3]（2020）在《牛结节性皮肤病检测新方法与ORF132基因表达及鉴定研究》文中提出牛结节性皮肤病（Lumpy skin disease,LSD）又称牛结节性皮炎或块状皮肤病或牛疙瘩皮肤病,是由羊痘病毒属（Capripoxvirus）的牛结节性皮肤病病毒（Lumpy skin disease virus,LSDV）引起牛的一种急性、亚急性接触性传染病。各种品种和年龄的牛均易感,发病率在2%～45%,死亡率达10%,甚至更高,给经济带来较大的损失。该病被世界动物卫生组织（OIE）列为必须通报的传染病,《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》I类传染病,因此,在该病流行的国家和地区,其易感动物及动物源性产品出口将受到世界各贸易国的严格限制,极大的影响畜牧业和国际贸易的发展。针对该病主要采用疫苗防治,尚无药物可治疗,且该病原现有的检测方法单一或不能较好的鉴别检测。本研究基于LSDV的ORF001、ORF101和ORF126基因,建立了羊痘病毒属病毒的LAMP检测方法,牛结节性皮肤病病毒通用型Taq Man MGB实时荧光定量PCR方法和牛结节性皮肤病病毒野毒株与疫苗株双重Taq Man MGB实时荧光定量PCR方法,并应用建立的方法,对重庆、新疆、黑龙江、云南等地区的牛、羊进行羊痘病毒流行病学调查研究,试验从LSDV核酸阳性的媒介生物中成功分离出1株牛结节性皮肤病病毒。研究针对LSDV ORF005和ORF132蛋白分别构建了真核表达载体和重组穿梭载体,以Cellfectin Reagent介导下,转染Sf9昆虫细胞,并在Sf9昆虫细胞中获得成功表达,为牛结节性皮肤病血清学方法的建立和疫苗研究奠定了基础。（1）建立了CaPV-LAMP检测方法,可特异、敏感的检测羊痘病毒属病毒。该方法对LSDV的最低检出限为14.7TCID50,比常规PCR高100倍,比荧光定量PCR法略低,CaPV-LAMP检测方法具有良好的稳定性和重复性,其可视法不需要特殊仪器,可肉眼直接判读结果,适用于临床上CaPV的现场快速筛查。（2）建立了牛结节性皮肤病病毒通用型Taq Man MGB实时荧光定量PCR方法,方法最低检出量为21.6拷贝/μL,可特异、敏感的鉴别检测羊痘病毒属病毒,重复性较好,扩增效率为95.3%。在临床样本中,最低可检出3.8 pg/m L的病毒DNA。研发的试剂盒稳定性好,储存于4℃可保存6个月,-20℃至少可保存14个月。应用于临床样本的检测,显示该方法可特异地检测牛羊血液、皮肤、淋巴结等样品中的LSDV核酸,适用于牛结节性皮肤病的诊断和流行病学调查。（3）建立了牛结节性皮肤病病毒野毒株与疫苗株的双重Taq Man MGB实时荧光定量PCR方法,可特异、敏感地鉴别LSDV野毒株与疫苗株,对山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛痘病毒、羊口疮病毒等均无特异扩增,方法对野毒株和疫苗株病毒核酸的最低检出量分别为22.6拷贝/μL和19.7拷贝/μL,扩增效率为99.5%,并研发了相应的标准化诊断试剂盒。对试验感染LSDV野毒株的牛EDTA抗凝血进行检测,最低检出限为9 DPI。方法特异、敏感、简便、快速,可为牛结节性皮肤病的疫情监测和弱毒疫苗免疫监控提供鉴别技术手段。（4）针对LSDV的ORF005和ORF132基因进行系统分析,密码子优化,设计引物,扩增目的基因,将目的基因回收、连接到p Fast Bac-HTB载体上,转化,构建真核表达载体p Fast Bac-HTB-ORF005和p Fast Bac-HTB-ORF132。分别将重组质粒p Fast Bac-HTB-ORF005、p Fast Bac-HTB-ORF132转入E.coli DH10Bac感受态细胞,构建重组穿梭质粒r Bacmid-ORF005和r Bacmid-ORF132,以Cellfectin Reagent介导,在Sf9昆虫细胞中进行了真核表达。经Western blot分析和IFA鉴定,ORF005和ORF132蛋白在Sf9昆虫细胞中均获得成功表达,为新型疫苗的研制和抗体诊断方法的建立奠定了基础。（5）应用本研究建立的实时荧光定量PCR方法、CaPV-LAMP方法及OIE推荐的常规PCR方法,分别对新疆、云南、黑龙江、重庆等地区牛、羊的羊痘病毒属病毒流行情况进行调查研究。从新疆伊犁边境地区牛结节性皮肤病病毒核酸检测阳性的媒介生物中进行病毒分离,接种MDBK细胞,盲传3代后,成功分离出1株牛结节性皮肤病病毒,命名为XJ1917株,经测序分析,本次分离的牛结节性皮肤病病毒与LSDV Neethling疫苗株同源性为99%,并在ORF126区域存在27个碱基缺少,3个位点的突变。经TCID50测定,XJ1917株第5代细胞病毒液的滴度为3.65×106TCID50/mL。
史卫军,黄超华,曹琛福,林彦星,王潇,花群义[4]（2020）在《蓝舌病病毒蛋白结构与检测方法研究进展》文中研究指明蓝舌病（Bluetongue, BT）是由蓝舌病病毒（Bluetongue virus, BTV）引起,经库蠓、伊蚊等媒介昆虫传播感染反刍动物的烈性非接触性传染病。1876年首次在南非被发现[1],1906年Theiler正式命名为"蓝舌病",将引起该病的病毒命名为蓝舌病病毒[2]。20世纪初,伴随国际贸易的发展,BT随后传入美洲、亚洲、欧洲等地,中国1979年首次发现该病的存在。BTV主要引起绵羊发病和死亡,牛和山羊常为隐性感染,反刍
张克龙[5]（2019）在《重组BTV 16型VP2基因痘苗病毒的构建与免疫原性研究》文中进行了进一步梳理蓝舌病（Bluetongue,BT）是经节肢动物如库蠓等吸食血液传播的可感染所有反刍动物的OIE规定的必须呈报的动物疫病。全国22个省份已检出BT,蓝舌病病毒（Bluetongue virus,BTV）是BT的病原体,通用的诊断BT的方法主要有临床诊断法和实验室诊断法如AGID、ELISA检测法等。有效预防BT的方法是疫苗接种,目前商品化的疫苗如灭活苗或减毒活疫苗均有其不足之处,而活载体疫苗可有效避免减毒活疫苗向自然环境中传播并导致核酸重组毒力返强的生物安全危险,也可有效避免灭活疫苗需要多次高剂量免疫的不足,是BT疫苗发展的一个重要方向。因此,研究并构建出一株能够稳定表达VP2蛋白并且具备良好的免疫原性和安全性的重组痘病毒疫苗具有重要意义。本研究通过PCR扩增的方法扩增质粒p SK-VP2上的BTV 16型VP2基因,并运用软件对其进行理化性质如疏水性、二级结构及遗传进化分析。在获得VP2基因的基础上,构建含有该基因的重组痘苗病毒载体候选疫苗。首先对VP2基因进行了优化和处理,突变了3个可被痘病毒识别的终止子,并在其起始密码子的上游添加Kozak序列以增强VP2基因表达,在ORF两端添加合适的酶切位点,通过人工合成的方法获得优化后的基因片段,以酶切连接的方式将VP2基因连接到痘苗病毒穿梭载体得pSTKE-VP2。然后将pSTKE-VP2与痘苗病毒VTT共转染2*106个单层BHK-21细胞,用报告基因EGFP筛选荧光病变噬斑获得重组痘苗病毒rVTT-VP2,用PCR、RT-PCR、Western blot方法对rVTT-VP2进行鉴定。将6周龄的BALB/C小鼠以随机分组的方式分为3组,每组10只,即rVTT-VP2疫苗组、VTT载体对照组和DMEM空白对照组。以肌肉注射的方式接种疫苗。每天称量小鼠体重,观察小鼠生活状态。按实验程序处死小鼠并取脾淋巴细胞,检测小鼠脾淋巴细胞亚型、增殖、IFN-γ的分泌水平,采取外周血分离血清后检测IL-2、IL-4、血清特异性抗体水平。结果:根据DNAstar分析BTV 16型VP2基因ORF全长2880bp、翻译蛋白约112k Da,PI为6.74,预测该基因具有良好的抗原结构。与NCBI上下载的27个血清型基因blast比对,验证了本研究所用VP2基因为BTV16型,本研究所用的BTV 16型VP2基因很可能来源于日本分离株,与中国流行型1型在核酸水平同源性为61.7%,氨基酸水平的同源性为58.8%。rVTT-VP2经10次噬斑纯化后通过PCR鉴定,结果显示目的基因VP2已成功整合到重组痘苗病毒基因组中,RT-PCR结果表明BTV-16 VP2在感染细胞内成功转录。将rVTT-VP2连续传代20次,经PCR、RT-PCR均能检测到外源基因的整合、转录,表明重组痘苗病毒rVTT-VP2已经挑纯且遗传稳定性良好。Western blot结果显示出有衣壳蛋白VP2目的条带,证明rVTT-VP2病毒能够表达且具有反应原性。对小鼠进行免疫后,称量小鼠体重,结果显示,rVTT-VP2组和VTT组小鼠体重相对DMEM空白对照组变化不显着,总体呈上升趋势,表明重组病毒rVTT-VP2对小鼠生长无明显影响,提示所构建的重组病毒一定安全性。T淋巴细胞亚群分析结果表明CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞的gated率相对于DMEM组显着增多,表明rVTT-VP2和VTT能有效刺激鼠T淋巴细胞的分化,免疫应答效果良好。淋巴细胞转化实验证明rVTT-VP2和VTT的特异性抗原相对于DMEM组的可显着性的活化脾淋巴细胞并呈现倍数上升,表明特异性抗原能有效刺激脾淋巴细胞增殖。rVTT-VP2特异性抗体水平检测结果表明rVTT-VP2诱导了BALB/C小鼠产生了特异性免疫应答。rVTT-VP2组血清中的IL-2显着高于DMEM组,且灭活rVTT-VP2抗原诱导的IFN-γ含量显着高于DMEM组而低于PHA组,而血清中IL-4的含量各组间并无明显差异结合三个实验结果表明rVTT-VP2诱导了BALB/C小鼠产生细胞免疫应答。结论:目的基因VP2与日本BTV16KSB-7/C/08 VP5与BTVINDG53/ABT/HSR同源性较高、并且VP2抗原性良好;成功构建重组病毒VP2穿梭载体pSTKE-VP2;成功获得重组BTV16型VP2痘苗病毒rVTT-VP2;重组痘苗病毒rVTT-VP2体内免疫效果良好,安全性高、有效刺激机体产生特异性应答。
冯杰[6]（2018）在《贵州省山羊主要疫病调查及防控对策》文中研究说明疫病是导致养羊业损失的重要因素,研究养羊业存在疫病隐患及威胁、找出其流行传播途径,为兽医防疫部门实施源头控制、精准有效免疫提供依据和措施,这对推动高原山地种草养羊产业的顺利发展具有重要的作用,并且对防止动物疫病所致公共卫生危害具有重要意义。该论文采用血清学和病原学调查方法,对贵州规模养羊场山羊小反刍兽疫、口蹄疫、蓝舌病、羔羊口疮、山羊传染性胸膜肺炎、山羊痘、弓形体等疫病进行抽样检测,血清学检测结果显示:小反刍兽疫血清抗体平均阳性率50.66%（115/227只份）、蓝舌病血清抗体平均阳性率38.69%（53/137只份）、O型口蹄疫血清抗体平均阳性率49.44%（133/269只份）、亚洲I型口蹄疫血清抗体平均阳性率17.47%（47/269只份）、A型口蹄疫血清抗体平均阳性率0%（0/77只份）、口蹄疫病毒非结构蛋白抗体平均阳性率0%（0/155只份）、绵羊肺炎支原体血清抗体平均阳性率15.91%（67/421只份）、丝状支原体山羊亚种血清抗体平均阳性率23.28%（98/421只份）、山羊痘血清抗体平均阳性率57.62%（189/328）、布鲁氏杆菌病血清抗体平均阳性率0%（0/4只份）、弓形体血清抗体阳性率75.00%（3/4只份）;病原学检测结果显示:羊小反刍兽疫病原平均阳性率50.00%（4/8只份）、传染性胸膜肺炎病原平均阳性率28.57%（2/7只份）、蓝舌病病原平均阳性率14.82%（4/27只份）、魏氏梭菌病原阳性率100.00%（1/1只份）、附红细胞体病原阳性率100.00%（2/2只份）。病原学检测结果说明贵州山羊存在小反刍兽疫病毒、魏氏梭菌、支原体、弓形体和附红细胞体感染。由血清学和病原学检测结果可判定贵州省山羊产业存在小反刍兽疫、蓝舌病、传染性胸膜肺炎、山羊痘、弓形体和附红细胞体等疫病威胁。因此,在深入做好口蹄疫、布鲁氏杆菌病、弓形体和附红细胞体防控基础上,将小反刍兽疫、蓝舌病、传染性胸膜肺炎和山羊痘作为贵州山羊重点防制疫病净化目标,制定免疫程序,在全省范围内进行推广应用,全面推进程序免疫和免疫效果监测;以规模养羊场或以乡镇为单位,推行疫病净化工作,逐只进行病原检测,清除带毒、带病羊只,进而减少养羊业的养殖风险。
丁梦玥[7]（2018）在《新疆牛蓝舌病病毒的分离及全基因组测序》文中研究表明蓝舌病（Bluetongue,BT）是由蓝舌病病毒（BTV）引起的一种经由库蠓、伊蚊等媒介昆虫叮咬传播的严重侵害反刍动物的急性病毒性虫媒病。世界动物卫生组织（OIE）规定蓝舌病为法定上报传染病,我国规定为一类传染病。该病的死亡率一般在10%左右,由于近年来该病的发病率逐渐上升,已严重影响了动物贸易。该项目根据蓝舌病在新疆的流行病学史和媒介昆虫的习性,结合地理位置、气候特点、牧区分布等因素,选择新疆巴州尉犁县墩阔坦乡某场作为建立监控群的监控点,于2016年对年龄小于1岁的家畜进行筛选后,选取BT检测结果为阴性的10头牛、10只山羊和10只绵羊作为哨兵动物建立监控群。每周采集监控动物群血样一次,每次采集普通采血管（分离血清）、肝素钠抗凝采血管和EDTA抗凝采血管共3管,从2016年6月28日开始到2016年12月6日共采样21次,采集血清492份。用BTV竞争ELISA试剂盒检测血清BTV抗体,将所有采集的监控动物群血样接种于BHK-21细胞、Vero细胞和C6/36细胞进行BTV分离,每日观察记录细胞是否病变。对出现细胞病变（CPE）的细胞液进行鉴定;群特异性鉴定采用BTV抗原捕获ELISA（AC-ELISA）、RT-PCR扩增BTV VP7片段以及免疫电镜观察方法;型特异性鉴定采用病毒中和试验;对分离到的BTV（4630号样品）进行全基因测序和初步分析。用BTV竞争性ELISA检测了血清492份,总阳性率为0.41%（2/492）,山羊的阳性率为1.29%（2/155）,转阳时间是10月10日和10月17日,监控动物群中的绵羊、牛未发生转阳。将492份血样接种细胞后,有18份样品出现CPE,其中有12份样品在盲传至第3代的第3天出现CPE,有6份样品在盲传至第4代的第3天出现CPE,出现CPE的18份样品有4份样品来源于牛。对18份CPE样品进行AC-ELISA检测,结果显示都为BTV阳性。对4份牛源样品进行BTV VP7 RT-PCR的扩增,在1100 bp处出现条带单一的目标条带。对4份牛源样品测定TCID50,TCID50在10-3.25/0.1m L至10-4.33/0.1 m L之间。对牛源4630号样品进行中和试验,结果显示,4630号样品与BTV-1～BTV-24型标准血清无中和反应,不属于BTV-1～BTV-24型,进行免疫电镜观察,可观察到具有环状病毒属病毒形态典型特征的病毒颗粒。对分离株BTV/XJYL/2016/01进行全基因组的测序,测序结果说明BTV/XJYL/2016/01毒株与新疆分离的BTV V196毒株和XJ1407毒株相似度最高,BTV/XJYL/2016/01毒株确实为蓝舌病病毒且为新的血清型,是新疆首次从牛上分离的蓝舌病毒。
韩明浩[8]（2016）在《内蒙古地区2015年牛羊蓝舌病流行病学调查及病毒的初步分离鉴定》文中提出蓝舌病（Bluetongue, BT）是由蓝舌病病毒引发的通过库蠓叮咬动物体传播的一种动物性传染病,对蓝舌病易感的反刍动物有绵羊、山羊、牛、鹿等,被病毒感染的家畜通常表现为高温稽留、口腔黏膜高度水肿和糜烂等症状。蓝舌病的致死率为25%～30%,在特殊情况下最高可达90%,给动物产品贸易以及农牧业生产造成了重大损失。本次流行病学调查,2015年分别从内蒙古自治区阿拉善地区、乌海地区、巴彦淖尔地区、鄂尔多斯地区、包头地区、呼和浩特地区、乌兰察布地区、赤峰地区、锡林郭勒地区、通辽地区、兴安地区11个盟市收集健康羊静脉血2740份,健康牛颈静脉血472份。其中,检测出血清阳性羊1017只,感染率为37.11%；检测出血清阳性牛60只,感染率为12.71%。不同的饲养方法也对BT的感染率有影响,其中舍饲动物的蓝舌病感染率为35.48%（532/1474）,散养动物的蓝舌病感染率为40.20%（509/1266）。将在监测点收集的反刍动物血液样品接种到10～11日龄鸡胚、C6/36细胞、BHK-21细胞通过传代培养方式进行病毒的分离,从病变细胞培养液中获取RNA,用NS1基因特异性寡核苷酸引物进行RT-PCR检测,通过形态学观察、遗传进化分析等试验证实,确定样本中含有蓝舌病病毒。流行病学调查结果显示：蓝舌病在内蒙古自治区家畜中广泛存在,牛羊都可以被感染,羊检测出的感染率高于牛的感染率,绵羊的蓝舌病感染率高于山羊；在6～9月份为库蠓繁殖活动的最佳季节,也是蓝舌病的高峰期；内蒙古自治区作为蓝舌病血清阳性率的高发地区,巴彦淖尔地区、包头地区、呼和浩特地区等内蒙古地区西部地区,蓝舌病阳性血清检出率要略高于通辽地区、兴安地区等内蒙古地区东部地区。就全区而言,蓝舌病的血清阳性率内蒙古低纬度地区高于高纬度地区。
申杜娟[9]（2016）在《山西省牛羊蓝舌病血清流行病学调查与分析》文中研究指明[目的]通过对山西省牛、羊蓝舌病的血清流行病学调查,了解蓝舌病在山西省的流行情况,为防控本病提供依据。[方法]采用竞争酶联免疫吸附试验（C-ELISA）,对采自2013年和2015年山西省11个市的规模化养殖场及养殖户的共1090份牛、羊血清样品进行了BTV抗体检测,分析了BTV阳性分布与地理、年平均气温和年平均降雨量的关系。[结果]2013年的334份血清中检测出47份BTV抗体阳性血清,平均阳性率为14.07%；2015年749份血清中检测出90份BTV抗体阳性血清,平均阳性率为11.70%。羊的阳性率高于牛,晋南地区高于晋北地区。统计分析表明：蓝舌病抗体阳性率的分布与年平均气温和年平均降雨量显着线性相关,与地理位置也有一定的联系。[结论]山西省部分地区存在牛、羊BTV感染,且血清中BTV抗体阳性率存在地域差异；纬度、年平均气温与年平均降雨量均影响山西省牛、羊BTV的分布。
冯瑜菲[10]（2015）在《蓝舌病病毒核酸栓测方法及16型蓝舌病病毒重组腺病毒疫苗的研究》文中认为蓝舌病（Bluetongue,BT）是热带和亚热带国家常见的一种感染反刍动物的虫媒传染病。该病由蓝舌病病毒（Bluetongue virus,BTV）引起,经媒介昆虫（库蠓）叮咬哺乳动物而传播,几乎可以感染所有的反刍动物,如山羊、绵羊、牛、鹿和骆驼等,其中绵羊最为易感,特别是羔羊。一般情况下,该病的致死率仅为2030%,但是对于某些易感品种的绵羊,致死率可高达90%。因此,BT成为了制约动物和动物制品国际间贸易活动的阻碍之一,给畜牧业造成了严重的经济损失,被世界动物卫生组织（OIE）列为法定上报类动物疫病。BTV属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）环状病毒属（Orbivirus）的代表成员,其基因组为10个分节段的双股RNA（ds RNA）,分别编码7种结构蛋白（VP1VP7）和4种非结构蛋白（NS1NS4）。其中编码NS1蛋白的M5基因、编码NSS3/3a的S10基因,是10个节段ds RNA中相对保守的基因片段,而编码VP2蛋白的L2基因,是10个节段dsRNA中变异性最大的片段。由于BTV的RNA片段容易出现变异与漂移,使得RNA片段经过重排组合后可能形成新的BTV毒株。截止至2014年,全世界共鉴定有26个不同的血清型BTV,我国主要流行其中的7个血清型（BTV-1、2、3、4、12、15和16型）,并且不同血清型之间缺乏交叉免疫保护,这就造成了疫苗免疫错综复杂。对于任何一种传染后的防控来说,快速而准确的病原诊断方法及有效的疫苗免疫手段都是最根本的策略。基于BTV血清型众多的特点,建立早期的检测与鉴别诊断方法,特别是针对每一个血清型病毒的快速的病原检测方法,对于进一步的防控至关重要。本研究通过网络数据库获取了不同血清型BTV的基因序列,并结合本实验室对现有BTV毒株基因序列测序的结果,分别利用One-step RT-PCR以及nested RT-PCR方法,建立了可以针对不同血清型BTV核酸都通用的群特异性核酸检测方法,同时通过特异性试验、敏感性试验、重复性试验以及临床血液样品的检测,对BTV群特异性核酸检测方法进行评价和验证。结果显示,One-step RT-PCR检测方法对BTV-124血清型的病毒核酸均有良好的扩增,而对其他对照毒株的核酸无交叉反应;该方法能够有效的检测出≥100TCID50/m L的病毒核酸,并能够从感染BTV的羊的抗凝血样品中成功检测到BTV核酸。此外,本研究建立的nested RT-PCR检测方法,同样对BTV-124和BTV-26血清型的病毒核酸均有良好的扩增,并得到了与预期结果大小一致的PCR扩增产物,而对其他对照毒株的核酸无交叉反应。同时将BTV-16型病毒进行10倍倍比稀释,按照已建立的nested RT-PCR反应条件和体系进行敏感性试验。敏感性试验结果表明,该方法能够有效的检测出≥10TCID50/mL的病毒核酸,并能够从感染BTV的羊的抗凝血样品中成功检测到BTV核酸。本研究首次针对中国国内流行的七种血清型BTV病毒核酸,建立了型特异性的RTPCR检测方法;同时也建立了22种不同血清型BTV的型特异性real-time RT-PCR检测方法。本研究以BTV基因组中变异性最大的L2基因为检测靶序列,并对本实验室保存的124血清型BTV的L2基因进行了测序,结合网络数据库中BTV各血清型的L2基因序列,对279条btv的l2基因序列进行了同源性比对及进化分析,寻找到各个不同血清型btv之间l2基因序列差异显着,而相同血清型btv之间l2基因序列相对保守的区域作为鉴别btv型特异性的rt-pcr引物结合位点以及real-timert-pcr引物和taqman-mgb探针的结合位点,尤其是要保证taqman-mgb探针结合位点的保守性,设计并合成针对各种不同血清型btv的型特异性检测引物和探针,并通过特异性试验、敏感性试验、模拟样品检测和重复性试验对btv分型鉴别的rt-pcr检测方法进行评价和验证;同样通过特异性试验、敏感性试验、标准曲线的建立、样品检测和重复性试验对btv分型鉴别的real-timert-pcr检测方法进行评价和验证。特异性试验结果表明,rt-pcr及real-timert-pcr分型鉴别检测方法均能够对其目标血清型的btv核酸呈阳性扩增,而对其他血清型btv核酸及亲缘关系较近的对照毒株核酸无交叉反应,具有良好的特异性;敏感性试验结果表明,各rt-pcr分型鉴别检测方法的敏感性分别为102104个拷贝不等,而real-timert-pcr分型检测方法的敏感性分别为10102个拷贝不等,是普通rt-pcr方法的10倍以上。同时利用所构建的不同浓度的标准品对real-timert-pcr各分型鉴别检测方法进行标准曲线的建立,试验结果表明,浓度为102108个拷贝的标准品呈现出良好的线性关系。利用统计学方法对real-timert-pcr分型检测方法所得到的扩增曲线的cp值进行分析,所建立的各real-timert-pcr分型检测方法cp值的批内的变异系数（cv%）均在1以下,而cp值的批间的cv%均在4以下,该结果表明所建立的各real-timert-pcr分型检测方法均具有很好的重复性;同时对常规的rt-pcr分型检测方法进行了特异性、敏感性和样品检测的重复性试验,试验结果表明,各rt-pcr分型检测方法同样具有很好的重复性。本研究所建立的核酸检测方法,能够快速的对btv核酸进行鉴别诊断,同时鉴定出病毒的血清型,使下一步的疫苗选择有的放矢,更具有针对性。本研究首次利用复制缺陷5型腺病毒载体表达btv-16vp2和vp5蛋白,由于此种病毒载体仅携带目的基因,而缺乏其他的亲本毒株的分子调控原件,所以大大降低了重组疫苗毒与野毒株之间发生基因重组的可能,从而提高了疫苗应用的安全性。但是之前的研究无法成功构建出重组腺病毒载体的btv疫苗,原因可能是btv基因序列中带有大量的大肠杆菌潜在的启动子序列,使得btv基因在大肠杆菌中极不稳定,最终导致构建的失败。因此,本研究利用生物预测软件,找到btv-16vp2和vp5基因中潜在的大肠杆菌启动子序列,在不改变氨基酸序列的前提下,经过多轮的基因突变筛选,对btv-16的vp2和vp5基因进行了优化,从而成功构建出了表达btv-16vp2和vp5基因的重组腺病毒,并对这两株重组腺病毒在模式动物小鼠及本体动物绵羊上进行免疫效果评价。重组腺病毒rad-vp2和rad-vp2-ires-vp5对balb/c小鼠免疫效果检测结果显示,经腹腔注射rad-vp2和rad-vp2-ires-vp5的实验组小鼠在2免后1周,在其血清中均可检测到抗vp2或vp5的igg和iga抗体;而经滴鼻免疫rad-vp2和rad-vp2-ires-vp5的实验组小鼠血清中,却检测不到抗vp2或vp5的igg抗体,但是从第2次免疫后1周开始,可以检测到针对vp2或vp5的iga抗体。与dmem和rad-Δ对照组相比,经腹腔注射或滴鼻免疫rad-vp2和rad-vp2-ires-vp5的小鼠脾细胞都具有更强的刺激增殖效果;对各组脾细胞培养上清液中的ifn-γ、il-2、il-4、il-10和il-12细胞因子进行检测,检测结果显示,与DMEM和r Ad-Δ对照组相比,腹腔注射r Ad-VP2和r Ad-VP2-IRES-VP5组的小鼠脾细胞上清中,IFN-γ、IL-2和IL-12显着增高,IL-4略有升高,IL-10无显着变化;滴鼻免疫r AdVP2和r Ad-VP2-IRES-VP5组的小鼠脾细胞上清中IFN-γ和IL-2显着增高、而IL-4、IL-10和IL-12的含量均无明显变化;该结果说明了本研究对小鼠的免疫,刺激了小鼠Th1类细胞的免疫应答。体外和体内中和试验结果表明,腹腔注射和滴鼻免疫重组腺病毒r Ad-VP2和r Ad-VP2-IRES-VP5组的小鼠血清对BTV-16具有明显的中和保护作用。重组腺病毒r Ad-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5对绵羊免疫效果检测结果显示,免疫r AdVP2和r Ad-VP2-IRES-VP5的实验组绵羊血清中,从第2次免疫后1周开始检测到抗VP2或VP5的Ig G和Ig A抗体。与DMEM和r Ad-Δ对照组相比,免疫rAd-VP2和r Ad-VP2-IRES-VP5的绵羊外周血淋巴细胞都具有更强的刺激增殖效果;且血清中IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-12的含量均有所升高,而IL-4和IL-10无显着变化;该结果表明,本研究对绵羊的免疫,刺激其Th1类细胞发生免疫应答。体外和体内中和试验结果表明,免疫重组腺病毒r Ad-VP2和r Ad-VP2-IRES-VP5组的绵羊血清对BTV-16具有明显的中和保护作用。本研究成功建立了适用于不同血清型BTV的One-step RT-PCR及nested RT-PCR群特异性核酸检测方法、成功建立了针对中国流行的七种血清型BTV（BTV-1、2、3、4、12、15和16型）的RT-PCR分型鉴别检测方法以及首次在我国成功的建立了BTV-119、2224型病毒核酸的real-time RT-PCR分型鉴别检测方法。这些方法为我国对BTV的早期诊断和流行病学监测提供了有利的技术手段,也为对BT的疫苗免疫提供了理论依据;同时,本研究成功构建了BTV-16的复制缺陷5型重组腺病毒r Ad-VP2和r Ad-VP2-IRES-VP5,此两种重组腺病毒可以有效的诱导小鼠和绵羊的体液免疫和细胞免疫应答,从而为BT的综合防控奠定了基础。
二、蓝舌病病毒人工感染绵羊抗体的监测及分型血清的制备（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、蓝舌病病毒人工感染绵羊抗体的监测及分型血清的制备（论文提纲范文）
（1）蓝舌病1型病毒VP2蛋白的可溶性表达纯化及免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 BTV的流行病学 |
| 1.1.1 BTV的历史及分布 |
| 1.1.2 BTV的传播途径 |
| 1.1.3 BTV的发病机制 |
| 1.1.4 BTV的临床病症及危害 |
| 1.2 BTV分子生物学特性 |
| 1.2.1 BTV基因组 |
| 1.2.2 BTV蛋白的种类及功能 |
| 1.2.3 BTV形态结构及理化性质 |
| 1.3 免疫反应 |
| 1.3.1 体液免疫 |
| 1.3.2 细胞免疫 |
| 1.4 BTV的诊断及防控 |
| 1.4.1 BTV的诊断 |
| 1.4.2 BTV的防控 |
| 1.5 BT疫苗研究进展 |
| 1.5.1 灭活疫苗 |
| 1.5.2 改良活疫苗 |
| 1.5.3 新一代疫苗 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 2 VP2蛋白的原核表达及纯化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 载体、菌株及血清 |
| 2.1.2 实验试剂及试剂盒 |
| 2.1.3 主要实验仪器与耗材 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 原核表达载体pET-28a-VP2 的构建 |
| 2.2.2 重组VP2 蛋白在BL21和Rosetta菌株中的表达鉴定及可溶性分析 |
| 2.2.3 重组VP2蛋白表达条件的确定 |
| 2.2.4 重组VP2蛋白的纯化及浓度的测定 |
| 2.2.5 Western-blot鉴定重组VP2 蛋白的免疫反应性 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 原核表达载体pET-28a-VP2 的构建 |
| 2.3.2 重组VP2蛋白在两种表达菌株中的表达鉴定及可溶性分析 |
| 2.3.3 重组VP2蛋白表达条件的确定 |
| 2.3.4 重组VP2蛋白的纯化及浓度测定 |
| 2.3.5 Western blot鉴定重组VP2 蛋白的免疫反应性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 动物实验及免疫原性分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验仪器及设备 |
| 3.1.2 实验耗材及试剂 |
| 3.1.3 实验所用溶液 |
| 3.1.4 实验用动物及病毒 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 免疫方案 |
| 3.2.2 免疫效果初步评价 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Dot-ELISA测定免疫血清与灭活BTV1 的反应性 |
| 3.3.2 间接ELISA测定免疫血清效价 |
| 3.3.3 IFA鉴定免疫血清与真核系统表达的VP2的反应性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩写词汇表 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与科研成果 |
| 致谢 |
（2）蓝舌病Ⅰ型病毒VP3蛋白的可溶性表达纯化及免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 BTV的流行病学概述 |
| 1.1.1 BTV的传播及分布 |
| 1.1.2 BTV的症状及易感动物 |
| 1.1.3 BTV的诊断和预防 |
| 1.2 BTV的分子生物学概述 |
| 1.2.1 基因组的构成 |
| 1.2.2 结构蛋白 |
| 1.2.3 非结构蛋白 |
| 1.3 BTV疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 减毒活疫苗 |
| 1.3.2 灭活疫苗 |
| 1.3.3 病毒样颗粒(VLPs) |
| 1.3.4 重组病毒载体疫苗 |
| 1.4 标签蛋白及分子伴侣的概述 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 2 VP3蛋白的表达与纯化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、载体、分子伴侣 |
| 2.1.2 主要实验试剂、试剂盒 |
| 2.1.3 主要实验仪器、耗材 |
| 2.1.4 实验试剂的配制方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 构建标签蛋白载体 |
| 2.2.2 构建VP3原核表达载体 |
| 2.2.3 重组VP3蛋白的表达、鉴定 |
| 2.2.4 重组VP3蛋白表达条件的优化 |
| 2.2.5 重组VP3蛋白的纯化 |
| 2.2.6 测定蛋白浓度 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 标签蛋白载体的构建 |
| 2.3.2 原核表达载体的构建 |
| 2.3.3 重组VP3蛋白的表达及鉴定 |
| 2.3.4 表达条件的优化 |
| 2.3.5 目的蛋白的纯化 |
| 2.3.6 目的蛋白浓度的测定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 动物实验及免疫原性分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要实验试剂、试剂盒 |
| 3.1.2 主要实验仪器、耗材 |
| 3.1.3 实验试剂的配制方法 |
| 3.1.4 动物实验及病毒 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 免疫方案 |
| 3.2.2 免疫效果初步评价 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 间接ELISA测定免疫血清效价 |
| 3.3.2 Dot-ELISA测定蛋白与BTV-1 灭活病毒免疫血清的反应性 |
| 3.3.3 IFA鉴定免疫血清与真核源VP3的反应性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩略表 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（3）牛结节性皮肤病检测新方法与ORF132基因表达及鉴定研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 问题的提出与研究意义 |
| 1.1.1 问题的提出 |
| 1.1.2 研究意义 |
| 1.2 国内外研究进展 |
| 1.2.1 羊痘病毒的病原学特性 |
| 1.2.2 羊痘病毒基因组学 |
| 1.2.3 牛结节性皮肤病病毒基因的组成及其功能 |
| 1.2.4 牛结节性皮肤病病毒的形态学和生物学特性 |
| 1.2.5 牛结节性皮肤病的流行病学 |
| 1.2.6 牛结节性皮肤病的临床症状 |
| 1.2.7 牛结节性皮肤病诊断方法研究进展 |
| 1.3 研究的目的和研究内容 |
| 1.3.1 研究目的 |
| 1.3.2 主要研究内容 |
| 2 CaPV-LAMP检测方法的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 准菌(毒)株 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 序列分析与引物设计 |
| 2.3.2 羊痘病毒的增殖 |
| 2.3.3 病毒DNA的提取 |
| 2.3.4 CaPV LAMP检测体系的优化 |
| 2.3.5 特异性试验 |
| 2.3.6 敏感性试验 |
| 2.3.7 重复性和稳定性试验 |
| 2.3.8 LAMP可视法的建立 |
| 2.3.10 CaPV-LAMP方法的应用 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 CaPV序列分析及LAMP引物设计 |
| 2.4.2 CaPV的增殖 |
| 2.4.3 CaPV-LAMP方法的建立 |
| 2.4.4 CaPV-LAMP特异性 |
| 2.4.5 CaPV-LAMP敏感性 |
| 2.4.6 重复性和稳定性试验 |
| 2.4.7 LAMP可视法的建立 |
| 2.4.8 可视法与仪器法检测敏感性比较分析 |
| 2.4.9 可视法特异性 |
| 2.4.10 CaPV-LAMP方法的应用 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 3 牛结节性皮肤病病毒通用型TaqMan MGB实时荧光定量PCR方法的建立及试剂盒研制 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 标准菌(毒)株 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.3 研究方法 |
| 3.3.1 引物探针设计 |
| 3.3.2 实时荧光定量PCR方法的建立 |
| 3.3.3 特异性试验 |
| 3.3.4 敏感性试验 |
| 3.3.5 重复性试验 |
| 3.3.6 稳定性试验 |
| 3.3.7 临床样品的检测 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 目的基因扩增及阳性质控的制备 |
| 3.4.2 反应条件的优化 |
| 3.4.3 特异性试验 |
| 3.4.4 敏感性试验 |
| 3.4.5 标准曲线 |
| 3.4.6 重复性试验 |
| 3.4.7 试剂盒稳定性试验 |
| 3.4.8 临床样品检测 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 4 LSDV野毒株与疫苗株双重TaqMan MGB实时荧光定量PCR方法的建立 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与试剂 |
| 4.2.1 标准菌(毒)株 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.3 研究方法 |
| 4.3.1 引物与探针的设计 |
| 4.3.2 重组质粒标准品的构建 |
| 4.3.3 反应条件的优化及标准曲线的建立 |
| 4.3.4 特异性试验 |
| 4.3.5 敏感性试验 |
| 4.3.6 重复性试验 |
| 4.3.7 临床样品的检测 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 目的基因扩增及阳性质控制备 |
| 4.4.2 反应条件的优化 |
| 4.4.3 标准曲线的建立 |
| 4.4.4 特异性试验 |
| 4.4.5 敏感性试验 |
| 4.4.6 重复性试验 |
| 4.4.7 临床样品检测 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 5 ORF005和ORF132蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与试剂 |
| 5.2.1 主要生物材料 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.2.4 主要试剂配制 |
| 5.3 研究方法 |
| 5.3.1 PCR引物设计 |
| 5.3.2 氨基酸理化性质分析 |
| 5.3.3 蛋白信号肽与跨膜结构分析 |
| 5.3.4 蛋白结构预测 |
| 5.3.5 B细胞表位预测 |
| 5.3.6 氨基酸同源性分析 |
| 5.3.7 基因的扩增及鉴定 |
| 5.3.8 重组质粒的构建 |
| 5.3.9 重组供体质粒的构建及鉴定 |
| 5.3.10 重组穿梭载体r Bacmid的构建与鉴定 |
| 5.3.11 重组杆状病毒的制备 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 ORF005氨基酸的理化性质 |
| 5.4.2 蛋白信号肽与跨膜结构分析 |
| 5.4.3 蛋白结构预测 |
| 5.4.4 抗原表位分析 |
| 5.4.5 氨基酸同源性分析 |
| 5.4.6 ORF132基因PCR扩增结果 |
| 5.4.7 克隆质粒双酶切鉴定 |
| 5.4.8 重组穿梭质粒rBacmid的鉴定 |
| 5.4.9 转染后的细胞病变 |
| 5.4.10 rBacmid-ORF132重组病毒感染后的CPE观察 |
| 5.4.11 重组杆状病毒感染后的IFA鉴定 |
| 5.4.12 不同代次重组病毒rBacmid-ORF132滴度测定 |
| 5.4.13 蛋白表达及鉴定 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 6 我国边境地区牛结节性皮肤病调查及XJ1917株的分离与鉴定 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与试剂 |
| 6.2.1 细胞株 |
| 6.2.2 主要试剂 |
| 6.2.3 主要仪器 |
| 6.2.4 样本来源 |
| 6.3 研究方法 |
| 6.3.1 样本前处理 |
| 6.3.2 抗体水平检测 |
| 6.3.3 病毒核酸检测 |
| 6.3.4 病毒分离 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 抗体水平检测结果 |
| 6.4.2 病毒核酸检测结果 |
| 6.4.3 LSDV新疆分离株(XJ1917株)CPE结果 |
| 6.4.4 LSDV新疆分离株(XJ1917株)PCR扩增结果 |
| 6.4.5 LSDV(XJ1917株)EEV基因测序结果分析 |
| 6.4.6 LSDV(XJ1917株)ORF132 基因测序结果分析 |
| 6.4.7 实时荧光定量PCR检测病毒增值情况 |
| 6.4.8 XJ1917分离株TCID_(50)滴度测定结果 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 本章小结 |
| 7 结论与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 本研究的创新点 |
| 7.3 后续研究工作的展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A.作者在攻读学位期间发表的论文目录 |
| B.作者在攻读学位期间承担的科研项目及成果目录 |
| C.学位论文数据集 |
| 致谢 |
（4）蓝舌病病毒蛋白结构与检测方法研究进展（论文提纲范文）
| 1 病毒结构 |
| 2 病毒蛋白 |
| 2.1 外衣壳蛋白VP2、VP5 |
| 2.2 内衣壳蛋白VP3和VP7 |
| 2.3 核芯蛋白VP1、VP4、VP6 |
| 2.4 非结构蛋白NS1、NS2、NS3、NS3A和NS4 |
| 3 检测方法 |
| 3.1 病原学检测 |
| 3.2 血清学检测 |
| 3.2.1 琼脂糖免疫扩散试验(AGID) |
| 3.2.2 血清中和试验(MTSN) |
| 3.2.3 过氧化物酶染色法(IPS) |
| 3.2.4 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 3.3 分子生物学检测 |
| 3.3.1 聚合酶链式反应检测技术(PCR) |
| 3.3.2 核酸分子杂交技术 |
| 4 小结 |
（5）重组BTV 16型VP2基因痘苗病毒的构建与免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写符号说明 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 蓝舌病流行与危害 |
| 1.2 蓝舌病病原学 |
| 1.3 蓝舌病疫苗研究进展 |
| 1.4 痘苗病毒载体在疫苗研究中的应用 |
| 1.5 研究目的意义 |
| 第二章 BTV16型VP2基因的克隆与序列分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 BTV16型VP2基因的克隆与鉴定 |
| 2.2.2 BTV16型VP2基因的序列分析 |
| 2.2.3 BTV16型VP2基因遗传进化分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 BTV16型VP2基因的获得 |
| 2.3.2 BTV16型VP2基因的序列分析 |
| 2.3.3 BTV16型VP2基因遗传进化分析 |
| 2.4 讨论与结论 |
| 第三章 表达BTV16型VP2基因重组痘苗病毒的构建与鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 BTV16型VP2基因的合成 |
| 3.2.2 含有BTV16型VP2基因表达质粒的构建 |
| 3.2.3 重组病毒的筛选 |
| 3.2.4 重组病毒的鉴定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 BTV16型VP2基因的合成 |
| 3.3.2 含有BTV16型VP2基因表达质粒的构建与鉴定 |
| 3.3.3 重组病毒的筛选 |
| 3.3.4 重组病毒的鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 重组BTV16型VP2基因重组痘苗病毒的免疫原性研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 重组病毒的培养与滴度测定 |
| 4.2.2 小鼠免疫方案与免疫过程 |
| 4.2.3 小鼠体重测量 |
| 4.2.4 小鼠脾淋巴细胞分离 |
| 4.2.5 小鼠脾T淋巴细胞增殖试验 |
| 4.2.6 小鼠脾CD4、CD8 T淋巴细胞及亚类检测 |
| 4.2.7 脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平检测 |
| 4.2.8 小鼠血清中IL2与IL4检测 |
| 4.2.9 特异性抗体水平检测 |
| 4.2.10 统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组病毒的培养与滴度测定 |
| 4.3.2 小鼠体重测量 |
| 4.3.3 小鼠T淋巴细胞增殖试验 |
| 4.3.4 小鼠CD4、CD8 T淋巴细胞及亚类检测 |
| 4.3.5 小鼠脾T淋巴细胞IFN分泌检测 |
| 4.3.6 小鼠血清中IL2与IL4检测 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表论文情况 |
（6）贵州省山羊主要疫病调查及防控对策（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词、符号中英文对照表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 贵州省山羊产业现状及其疫病防控研究进展 |
| 1.1.1 贵州省发展羊产业的自然资源 |
| 1.1.2 贵州省发展羊产业的山羊品种资源 |
| 1.2 贵州省发展羊产业的举措及成就 |
| 1.2.1 主要举措 |
| 1.2.2 主要成就 |
| 1.3 贵州省发展羊产业存在的问题 |
| 1.3.1 企业带动能力弱 |
| 1.3.2 肉羊育种目标尚未明确 |
| 1.3.3 草料供应不平衡,季节草料不足现象十分突出 |
| 1.3.4 日粮搭配不科学,营养不足现象十分普遍 |
| 1.3.5 产业链条不健全,产品销售难 |
| 1.3.6 产业服务方式单一,产业支撑力度不够 |
| 1.3.7 防疫能力不够,重大疫病威胁依然存在 |
| 1.4 当前威胁羊产业发展的主要传染病 |
| 1.4.1 小反刍兽疫 |
| 1.4.2 蓝舌病 |
| 1.4.3 口蹄疫 |
| 1.4.4 山羊传染性胸膜肺炎 |
| 1.4.5 羊痘 |
| 1.4.6 羊传染性脓疱病 |
| 1.4.7 梭菌性疾病 |
| 1.4.8 羊弓形虫病 |
| 1.4.9 羊附红细胞体病 |
| 第二章 贵州省山羊主要疫病血清学调查 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 羊血液样本的采集 |
| 2.1.1.2 检测试剂 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 试验结果 |
| 2.2.1 小反刍兽疫血清学检测结果 |
| 2.2.2 蓝舌病血清抗体检测结果 |
| 2.2.3 口蹄疫血清抗体检测结果 |
| 2.2.4 传染性胸膜肺炎血清抗体检测结果 |
| 2.2.5 山羊痘血清抗体检测结果 |
| 2.2.6 弓形体并血清抗体检测结果 |
| 2.2.7 布鲁氏杆菌病血清学调查结果 |
| 2.3 分析与讨论 |
| 2.3.1 小反刍兽疫风险分析与讨论 |
| 2.3.2 蓝舌病风险分析与讨论 |
| 2.3.3 口蹄疫风险分析与讨论 |
| 2.3.4 传染性胸膜肺炎风险分析与讨论 |
| 2.3.5 山羊痘风险分析与讨论 |
| 2.3.6 羊弓形虫病风险分析与讨论 |
| 2.3.7 布鲁氏杆菌风险分析与讨论 |
| 第三章 贵州省山羊主要疫病病原学调查 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 检测结果 |
| 3.2.1 小反刍兽疫病原学检测结果 |
| 3.2.2 传染性胸膜肺炎病原学检测结果 |
| 3.2.3 梭菌病病原学检测结果 |
| 3.2.4 羊口疮病原学检测结果 |
| 3.2.5 山羊蓝舌病病原检测结果 |
| 3.3 分析与讨论 |
| 3.3.1 小反刍兽疫病原学检测结果分析与讨论 |
| 3.3.2 传染性胸膜肺炎病原学检测结果分析与讨论 |
| 3.3.3 梭菌病病原学检测结果分析与讨论 |
| 3.3.4 羊口疮病原学检测结果分析与讨论 |
| 3.3.5 山羊蓝舌病病原学检测结果分析与讨论 |
| 3.4 病原学检测结论 |
| 第四章 贵州省山羊主要疫病防制措施及对策 |
| 4.1 整体防制措施及对策建议 |
| 4.1.1 加强组织领导 |
| 4.1.2 建立种羊和羊只准入制度 |
| 4.1.3 科学合理使用优质疫苗 |
| 4.1.4 全面推进程序免疫 |
| 4.1.5 全面推进免疫效果监测 |
| 4.1.6 建立动物疫病控制大数据信息平台 |
| 4.1.7 实施疫病净化行动计划 |
| 4.2 主要疫病防制技术措施 |
| 4.2.1 山羊小反刍兽疫的防治技术措施 |
| 4.2.2 山羊口蹄疫的防治技术措施 |
| 4.2.3 山羊痘防治措施 |
| 4.2.4 山羊传染性胸膜肺炎的防治措施 |
| 4.2.5 羔羊口疮的防治技术措施 |
| 4.2.6 山羊梭菌病的防治措施 |
| 4.2.7 养殖场户春季羔羊痢疾防治措施 |
| 4.2.8 母羊流产的综合防治措施 |
| 4.2.9 山羊弓形虫病的防治措施 |
| 4.2.10 山羊附红细胞体病的防治措施 |
| 全文小结 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（7）新疆牛蓝舌病病毒的分离及全基因组测序（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 病毒的结构 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 致病机理、临床症状和病理变化 |
| 1.5 检测方法 |
| 1.6 疫苗 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 第2章 新疆巴州尉犁县哨兵动物血清学检测 |
| 2.1 建立监控群 |
| 2.2 血清学检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 新疆巴州尉犁县哨兵动物BTV的分离 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 新疆巴州尉犁县哨兵动物牛源BTV分离株的鉴定 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 新疆巴州尉犁县哨兵动物牛源BTV分离株的全基因组测序 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）内蒙古地区2015年牛羊蓝舌病流行病学调查及病毒的初步分离鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 蓝舌病概述 |
| 1.2 BT流行情况 |
| 1.2.1 国外疫情 |
| 1.2.2 国内疫情 |
| 1.3 BT的传播以及流行特性 |
| 1.4 BTV病原学特性 |
| 1.5 BTV的致病机理 |
| 1.6 BT的临床症状和病理变化 |
| 1.7 疫苗的研究 |
| 1.8 预防措施 |
| 1.9 BTV的常用鉴定与分离方法 |
| 1.9.1 血清学检查方法 |
| 1.9.2 病毒分离方法 |
| 1.9.3 核酸探针技术 |
| 1.9.4 聚合酶链式反应(PCR技术) |
| 2 内蒙古地区BT清学调查 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 C-ELISA方法 |
| 2.2.2 提取全血RNA |
| 2.2.3 BTV-NS1基因的RT-PCR扩增 |
| 2.2.4 巢式PCR扩增 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 C-ELISA试验结果 |
| 2.3.2 血清学调查RT-PCR结果 |
| 2.3.3 内蒙古地区羊BT调查结果(见表5) |
| 2.3.4 不同饲养方式BT感染率调查结果(见表7) |
| 2.3.5 内蒙古地区牛BT感染率调查结果(见表9) |
| 2.4 讨论 |
| 3 内蒙古呼和浩特地区BTV的初步分离 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 生物材料 |
| 3.1.2 主要试剂(见表11) |
| 3.1.3 设备与耗材(见表12) |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 鸡胚接种 |
| 3.2.2 技术路线 |
| 3.2.3 鸡胚的收获 |
| 3.2.4 鸡胚肝脏的PCR检测 |
| 3.2.5 细胞接种 |
| 3.2.6 分离物的鉴定(同3.2.4) |
| 3.2.7 病毒分离物的保存 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 鸡胚的接种结果 |
| 3.3.2 细胞接种结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 BTV的鉴定 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂(见表13) |
| 4.1.2 设备和耗材(见表14) |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 提取BHK-21细胞培养物RNA(同2.4) |
| 4.2.2 PCR检测(同2.5) |
| 4.2.3 巢式PCR产物的回收 |
| 4.2.4 NS1基因片段的克隆 |
| 4.2.5 连接 |
| 4.2.6 转化 |
| 4.2.7 质粒的提取 |
| 4.2.8 NS1序列与分析 |
| 4.2.9 病毒形态学观察 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 RT-PCR结果 |
| 4.3.2 巢式PCR结果 |
| 4.3.3 NS1片段的基因克隆结果 |
| 4.3.4 NS1序列与分析结果 |
| 4.3.5 病毒形态学观察结果 |
| 4.4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（9）山西省牛羊蓝舌病血清流行病学调查与分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 蓝舌病的历史 |
| 2 蓝舌病的流行与分布 |
| 2.1 蓝舌病在国外的流行情况 |
| 2.1.1 蓝舌病在非洲的流行情况 |
| 2.1.2 蓝舌病在欧洲的流行情况 |
| 2.1.3 蓝舌病在美洲的流行情况 |
| 2.1.4 蓝舌病在大洋洲的流行情况 |
| 2.1.5 蓝舌病在亚洲的流行情况 |
| 2.2 蓝舌病在国内的流行情况 |
| 3 BTV的病原学 |
| 3.1 BTV的分类地位 |
| 3.2 BTV分子结构 |
| 3.2.1 基因组 |
| 3.2.2 结构蛋白 |
| 3.2.3 非结构蛋白 |
| 3.3 BTV理化特性 |
| 3.4 BTV培养特性 |
| 4 蓝舌病的流行病学 |
| 4.1 易感动物 |
| 4.2 传染源 |
| 4.3 传播方式 |
| 4.4 蓝舌病的季节性和周期性 |
| 5 蓝舌病实验室检测方法 |
| 5.1 病毒分离鉴定 |
| 5.2 清学检测方法 |
| 5.3 病毒核酸检测方法 |
| 6 研究目的及意义 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 血清来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 操作过程 |
| 2.2 结果判断标准 |
| 2.3 数据分析 |
| 结果与分析 |
| 1 山西省牛、羊BTV感染情况 |
| 2 山西省牛、羊BTV阳性率与纬度的关系 |
| 3 山西牛、羊BTV阳性率与年平均气温以及年平均降雨量的关系 |
| 3.1 牛、羊BTV阳性率与年平均气温的关系 |
| 3.2 牛、羊BTV阳性率与年平均降雨量的关系 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 致谢 |
（10）蓝舌病病毒核酸栓测方法及16型蓝舌病病毒重组腺病毒疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 蓝舌病概述 |
| 1.1.1 蓝舌病流行情况 |
| 1.1.2 蓝舌病流行特点 |
| 1.1.3 蓝舌病血清型分布 |
| 1.1.4 蓝舌病临床症状和病理变化 |
| 1.1.5 蓝舌病诊断 |
| 1.1.6 蓝舌病防控措施 |
| 1.2 蓝舌病病毒 |
| 1.2.1 BTV形态特征和基因结构 |
| 1.2.2 BTV理化特性 |
| 1.2.3 BTV基因产物及生物学功能 |
| 1.3 病毒核酸检测方法 |
| 1.4 腺病毒载体的概述 |
| 1.4.1 腺病毒的基本特征 |
| 1.4.2 腺病毒载体的优势 |
| 1.4.3 腺病毒载体的构建方法 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 病毒、细胞、基因和实验动物 |
| 2.1.4 PCR扩增引物与探针序列 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病毒的增殖 |
| 2.2.2 RNA及基因组DNA的提取 |
| 2.2.3 蓝舌病病毒核酸One-step RT-PCR群特异性检测方法的建立 |
| 2.2.4 蓝舌病病毒核酸nested RT-PCR群特异性检测方法的建立 |
| 2.2.5 BTV L2基因序列分析 |
| 2.2.6 蓝舌病病毒国内流行株RT-PCR型特异性检测方法的建立 |
| 2.2.7 蓝舌病病毒Real-time RT-PCR型特异性检测方法的建立 |
| 2.2.8 BTV-16重组腺病毒载体疫苗的构建 |
| 2.2.9 重组腺病毒疫苗对BALB/c小鼠的免疫效果评价 |
| 2.2.10重组腺病毒疫苗对绵羊的免疫效果评价 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒致细胞病变结果 |
| 3.2 BTV-1~24型病毒ds RNA的SDS-PAGE |
| 3.3 蓝舌病病毒核酸One-step RT-PCR群特异性检测体系评价 |
| 3.3.1 One-step RT-PCR特异性 |
| 3.3.2 BTV-16 TCID50测定 |
| 3.3.3 One-step RT-PCR敏感性 |
| 3.3.4 样品检测 |
| 3.3.5 One-step RT-PCR重复性 |
| 3.4 蓝舌病病毒核酸nested RT-PCR群特异性检测体系评价 |
| 3.4.1 重组质粒鉴定结果 |
| 3.4.2 nested RT-PCR特异性 |
| 3.4.3 nested RT-PCR敏感性 |
| 3.4.4 样品检测 |
| 3.4.5 nested RT-PCR重复性 |
| 3.5 BTV L2基因分析 |
| 3.5.1 BTV L2基因同源性分析结果 |
| 3.5.2 BTV L2基因系统进化树 |
| 3.6 蓝舌病病毒核酸国内流行株RT-PCR型特异性检测体系评价 |
| 3.6.1 重组质粒PCR鉴定结果 |
| 3.6.2 RT-PCR各分型检测方法的特异性 |
| 3.6.3 RT-PCR各型特异性检测方法的敏感性 |
| 3.6.4 模拟样品检测 |
| 3.6.5 RT-PCR重复性 |
| 3.7 蓝舌病病毒核酸Real-time RT-PCR分型检测体系的评价 |
| 3.7.1 Real-time RT-PCR特异性 |
| 3.7.2 Real-time RT-PCR标准曲线的建立 |
| 3.7.3 Real-time RT-PCR敏感性 |
| 3.7.4 Real-time RT-PCR重复性 |
| 3.7.5 样品检测 |
| 3.8 BTV-16重组腺病毒疫苗的构建结果 |
| 3.8.1 目的基因的克隆 |
| 3.8.2 重组腺病毒穿梭载体的鉴定结果 |
| 3.8.3 重组腺病毒载体的鉴定 |
| 3.8.4 重组腺病毒的鉴定 |
| 3.8.5 重组腺病毒生长曲线的测定 |
| 3.8.6 重组腺病毒稳定性分析 |
| 3.9 重组腺病毒疫苗对BALB/c小鼠的免疫效果评价 |
| 3.9.1 免疫小鼠血清中特异性抗体的测定 |
| 3.9.2 淋巴细胞增殖结果 |
| 3.9.3 细胞因子检测 |
| 3.9.4 体外中和试验 |
| 3.9.5 体内中和试验 |
| 3.10重组腺病毒疫苗对绵羊的免疫效果评价 |
| 3.10.1 免疫绵羊血清中特异性抗体的测定 |
| 3.10.2 淋巴细胞增殖结果 |
| 3.10.3 细胞因子检测 |
| 3.10.4 体外中和试验 |
| 3.10.5 体内中和试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 核酸诊断技术的优势 |
| 4.2 PCR技术操作重点 |
| 4.3 群特异性BTV核酸检测方法的选择 |
| 4.4 L2基因进化树的构建 |
| 4.5 型特异性BTV分型检测方法的建立 |
| 4.5.1 BTV RT-PCR分型检测方法的建立 |
| 4.5.2 BTV real-time RT-PCR型特异性检测方法的建立 |
| 4.5.3 型特异性检测方法改善的初步构想 |
| 4.6 蓝舌病疫苗研究情况 |
| 4.7 BTV-16重组腺病毒疫苗的构建 |
| 4.8 重组腺病毒疫苗对BALB/c小鼠免疫效果评价 |
| 4.9 重组腺病毒疫苗对绵羊免疫效果评价 |
| 4.10 BTV疫苗研究工作的展望 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
四、蓝舌病病毒人工感染绵羊抗体的监测及分型血清的制备（论文参考文献）
- [1]蓝舌病1型病毒VP2蛋白的可溶性表达纯化及免疫原性分析[D]. 殷佳佳. 郑州大学, 2020(02)
- [2]蓝舌病Ⅰ型病毒VP3蛋白的可溶性表达纯化及免疫原性分析[D]. 韩娇月. 郑州大学, 2020(02)
- [3]牛结节性皮肤病检测新方法与ORF132基因表达及鉴定研究[D]. 聂福平. 重庆大学, 2020
- [4]蓝舌病病毒蛋白结构与检测方法研究进展[J]. 史卫军,黄超华,曹琛福,林彦星,王潇,花群义. 中国兽医杂志, 2020(01)
- [5]重组BTV 16型VP2基因痘苗病毒的构建与免疫原性研究[D]. 张克龙. 广西大学, 2019(02)
- [6]贵州省山羊主要疫病调查及防控对策[D]. 冯杰. 甘肃农业大学, 2018
- [7]新疆牛蓝舌病病毒的分离及全基因组测序[D]. 丁梦玥. 新疆农业大学, 2018(05)
- [8]内蒙古地区2015年牛羊蓝舌病流行病学调查及病毒的初步分离鉴定[D]. 韩明浩. 内蒙古农业大学, 2016(02)
- [9]山西省牛羊蓝舌病血清流行病学调查与分析[D]. 申杜娟. 山西农业大学, 2016(04)
- [10]蓝舌病病毒核酸栓测方法及16型蓝舌病病毒重组腺病毒疫苗的研究[D]. 冯瑜菲. 东北农业大学, 2015(03)