一、转Bt基因棉的鉴定和纯度检测技术研究（论文文献综述）
马肖,赵世浩,王峰,贺文,陈金湘,张秋平,周仲华[1]（2020）在《Bt-Cry5Aa杀虫基因的原核表达、纯化及其在棉花中的鉴定》文中研究指明单一转苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）基因Cry1Ab/Cry1Ac抗虫棉（Gossypium）作为我国生产上大面积种植作物,随着种植时间及面积的增加导致害虫对Bt毒蛋白的抗性增强迫使新型Bt基因研究工作成为解决问题的关键。Cry5Aa是一种具有兼抗鳞翅目和线虫的新型Bt杀虫基因,由湖南农业大学棉花研究所成功转入棉花,并获得稳定遗传的’JX0010’、’JX0020’品系,本研究构建了Cry5Aa全长基因原核表达载体,优化了原核表达诱导条件,并且对其在转Bt-Cry5Aa基因棉花品系中的表达进行了鉴定。结果表明,在37℃220 r/min 1.0 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside, IPTG）条件下诱导4 h,其蛋白表达量最高。通过Western blot分析,发现蛋白分子量为79 kD,与理论值一致;同时,该蛋白以包涵体形式存在,通过谷胱甘肽-Sepharose4B小颗粒亲和层析纯化,蛋白纯度可达95%以上;转Bt-Cry5Aa基因棉花品系的鉴定实验表明:Cry5Aa基因能在转基因品系’JX0010’、’JX0020’中表达杀虫毒蛋白,且’JX0010’的Cry5Aa毒蛋白表达量在棉花不同时期及不同部位均高于’JX0020’,且在生长期以蕾期为最高表达,植株部位上以叶片为最高表达。本研究构建了Bt-Cry5Aa杀虫基因的原核表达载体,获得了Cry5Aa的纯化蛋白,初步对其在棉花中的表达进行了鉴定,为对BtCry5Aa杀虫基因的抗虫性、安全性等转基因检测及进一步在棉花中的应用提供了理论基础。
高越[2]（2020）在《转cry1Ab基因玉米对非靶标节肢动物多样性的影响及抗虫性的评价》文中进行了进一步梳理为了评价转cry1Ab基因玉米的生态安全性,本研究采用直接观察法和陷阱法对两个生长季转基因抗虫玉米田和非转基因玉米田的非靶标节肢动物种类和数量进行了调查和统计,分析了转基因抗虫玉米对田间非靶标节肢动物多样性的影响。为了评价转cry1Ab基因玉米的抗虫性,利用酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）测定了转基因抗虫玉米不同时期和不同组织的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）Cry1Ab蛋白含量,明确了转基因抗虫玉米的Bt Cry1Ab蛋白的时空表达规律;同时在田间和室内分别用亚洲玉米螟、棉铃虫和粘虫的初孵幼虫对转基因抗虫玉米的抗虫性进行了测定。主要结果如下:1.在2018年和2019年两个玉米生长季度,利用直接观察法与陷阱法对转基因抗虫玉米田和非转基因玉米田的非靶标节肢动物种类和数量进行了系统调查,结果表明两个生长季中,转基因抗虫玉米田非靶标节肢动物总数量、物种总数、生物多样性指数、均匀性指数和优势集中性指数与非转基因玉米田相比均无显着差异。2.转基因抗虫玉米的Cry1Ab蛋白测定结果表明,在玉米不同的生长时期,Cry1Ab蛋白在灌浆期的含量最高,其次为苗期、吐丝期、拔节期和喇叭口期。以功能叶为例,灌浆期的功能叶Cry1Ab蛋白含量为827.62 ng/g,苗期与吐丝期的Cry1Ab蛋白量基本相同,为580.00 ng/g左右,拔节期与喇叭口期的Cry1Ab蛋白含量为300.00 ng/g。在玉米同一时期的不同组织器官中,Cry1Ab蛋白在根部的含量最高,功能叶次之,茎部最低。以吐丝期为例,根部的Cry1Ab蛋白量为1528.27 ng/g,功能叶的Cry1Ab蛋白含量为578.40 ng/g,茎部的Cry1Ab蛋白含量为421.58 ng/g。玉米生长发育后期,由于生长中心的转变,籽粒的Cry1Ab蛋白含量相对较低,完熟期籽粒Cry1Ab 蛋白含量为 251.95 ng/g。3.利用田间接虫法与室内生测法测定了转基因抗虫玉米对于三种玉米害虫的抗性,结果表明,田间转基因抗虫玉米对亚洲玉米螟、粘虫和棉铃虫的抗性等级均为高抗,抗性显着高于其对应的非转基因玉米。室内生测结果表明,转基因抗虫玉米对亚洲玉米螟初孵幼虫具有较强的抗性,3d的死亡率均为70%以上。转基因抗虫玉米的叶片与籽粒对棉铃虫初孵幼虫抗性较高,3d的死亡率为80%以上。花丝对棉铃虫初孵幼虫只有中等抗性,3d死亡率只有50%。转基因抗虫玉米对于粘虫初孵幼虫致死作用虽然较小,但能较好地抑制其生长发育,出现明显体重抑制现象。取食转基因抗虫玉米的初孵粘虫7 d的平均重量为5.90±1.73 mg,而取食非转基因玉米的初孵粘虫7 d的平均重量为62.00±5.24 mg,体重抑制率为90.48%。
梁思佳[3]（2020）在《利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗盲蝽新种质》文中提出棉花害虫种类繁多,而且在整个生育时期均易遭受各种害虫危害。Bt抗虫棉的广泛种植有效的控制了棉铃虫的爆发,但由于杀虫剂使用量的大幅度减少,导致Bt非靶标害虫盲蝽象为害日益加重,并由次要害虫上升为主要害虫。盲蝽寄住范围广、飞行扩散能力强、爆发频率高,给盲蝽的防治带来了巨大的困难。目前喷洒化学杀虫剂是防治盲蝽的主要方法,但化学杀虫剂不但容易诱发盲蝽抗性的产生,而且给人类健康和环境安全带来威胁。因此迫切需要高效安全的盲蝽防治新策略。近年来,植物介导的RNAi技术由于其高效、特异,对环境无污染等特性被广泛应用于害虫的防治研究。本研究利用植物介导的RNAi技术创造了棉花抗盲蝽新种质,为盲蝽的防治提供了新的策略。主要研究内容如下:1.棉花抗中黑盲蝽新种质的创造本研究利用植物介导的RNAi技术,以影响中黑盲蝽（Adelphocoris suturalis）生殖能力的As FAR基因为靶标,创造了能够高量表达As FAR基因ds RNA的转基因棉花。当中黑盲蝽取食该转基因棉花后,可以成功诱发其体内的RNAi效应,导致其内源As FAR基因的表达水平显着下降。田间抗虫鉴定结果显示,As FAR转基因棉花受中黑盲蝽危害较轻,平均每株棉花仅捕获中黑盲蝽12-14头。然而对照组棉花受中黑盲蝽危害非常严重,平均每株棉花捕获中黑盲蝽数量大于20头。以上结果表明As FAR转基因棉花可以成功抑制中黑盲蝽的生殖能力,导致其种群数量显着下降,有效减少中黑盲蝽的危害。非靶标害虫的抗性鉴定结果显示As FAR转基因棉花只对中黑盲蝽有抗性效果,对棉铃虫（Helicoverpa armigera）的体重以及蚜虫（Aphis gossypii）的种群数量均无不良影响。连续两年的田间农艺性状调查结果显示,As FAR转基因棉花与野生型对照棉花之间的农艺性状没有显着差异（P>0.05）,且不同世代间农艺性状表现稳定。此外,外源基因的表达对棉花纤维品质没有不利影响。以上结果表明,As FAR转基因棉花对中黑盲蝽有较高的抗性,对非靶标害虫无不良影响,农艺性状良好且稳定,可以作为防治中黑盲蝽的理想种质资源。该研究为中黑盲蝽的防治提供了新的可替换策略策略。2.棉花抗绿盲蝽新种质的创造本研究选择绿盲蝽（Apolygus lucorum）Al LIM基因作为靶标基因,序列分析表明Al LIM基因具有高度特异性。随后将该基因转入棉花,成功创造了能够高量表达绿盲蝽Al LIM基因ds RNA的转基因棉花材料。室内饲喂结果显示,取食Al LIM转基因棉花后,绿盲蝽内源Al LIM基因的相对表达水平显着下降。在幼虫向成虫转化过程中蜕皮发生严重缺陷,最终因蜕皮失败,变态发育被阻断而死亡,死亡率高达33%-41%。此外有少量绿盲蝽可以羽化为成虫,但其翅膀、后腿出现畸形。对分别注射ds RNA-Al LIM（ds Al LIM）和ds RNA-GFP（ds GFP）的绿盲蝽样品进行转录组测序。数据分析结果显示,总共鉴定到4923个差异表达基因,其中有2484个基因在ds Al LIM处理后上调表达,2439个基因在ds Al LIM处理后下调表达。差异基因KEGG通路分析结果显示,与肌肉生长发育相关的信号通路被显着富集。根据KEGG通路分析结果鉴定到一些参与肌肉生长发育且在ds Al LIM处理后发生显着变化的差异基因。以上结果表明,Al LIM基因在绿盲蝽肌肉发育过程中发挥重要作用。肌肉结构和功能的完整性是昆虫变态发育的关键,因此推测绿盲蝽Al LIM基因的缺失会导致绿盲蝽羽化过程中蜕皮所需肌肉发育缺陷,最终导致蜕皮失败,羽化被阻断,死亡率增加。田间抗虫鉴定结果显示,转基因棉花受绿盲蝽危害较轻,每株转基因棉花平均捕获绿盲蝽8.1-10.1头。然而野生型对照组棉花受绿盲蝽危害却非常严重,每株平均捕获绿盲蝽高达21.5-24.1头。取食转基因棉花导致绿盲蝽死亡率增加,种群数量显着下降。此外,在田间依然观察到少量后腿及翅膀缺陷的绿盲蝽成虫。以上结果表明该转基因棉花对绿盲蝽具有较高的抗性水平。非靶标昆虫的生物测结果显示,Al LIM转基因棉对棉铃和蚜虫的生长发育没有负面影响,对有益昆虫瓢虫（Menochilus sexmaculatus）的生长发育没不良影响。连续两年的田间农艺性状调查结果显示,转基因棉花与野生型对照棉花之间的农艺性状没有显着差异（P>0.05）,且不同世代间农艺性状表现稳定。此外,外源基因的表达对棉花纤维品质没有不良影响。以上结果充分表明Al LIM转基因棉花目标抗虫性状效果良好,对非靶标害虫、有益昆虫以及人类安全,农艺性状以及纤维品质良好,可以作为防治绿盲蝽的理想种质资源。
王金涛[4]（2019）在《钙粘蛋白基因r17和r18突变介导的红铃虫对转Bt基因棉花的抗性机制》文中进行了进一步梳理转Bt基因抗虫棉花（Bt棉）自1997年在我国商业化以来,对红铃虫、棉铃虫等主要靶标害虫起到了很好的控制作用,但Bt棉的连续大规模种植对靶标害虫造成了持续的选择压,尤其是对食性单一的红铃虫。近年来,我国长江流域红铃虫田间种群曾出现对Bt棉的抗性倍数显着上升的情况,这将对长江流域Bt棉的使用寿命构成威胁。解决这个问题之前,长江流域红铃虫对Bt棉的抗性水平后续如何变化及对Bt棉的抗性机制等问题仍有待进一步研究。为此,本研究以红铃虫室内品系和田间种群个体为材料,对我国长江流域红铃虫田间种群进行了Cry1Ac敏感性测定和抗性基因频率分子检测,从田间种群中筛选、建立了两个红铃虫Cry1Ac抗性品系,对其携带的抗性等位基因进行克隆、鉴定和遗传分析,从基因、遗传、蛋白等水平揭示其抗性机制,并建立DNA检测的抗性监测方法。本文主要研究结论如下:1. Cry1Ac敏感性测定结果表明,与前人2008-2010年的抗性监测结果相比,长江流域红铃虫田间种群对Bt棉的敏感性有所恢复。2012-2015年该流域红铃虫各地方种群对Cry1Ac的年度平均LC50在0.23-0.27μg/m L之间。年度平均抗性倍数在3.2-4.5倍之间（平均值为3.8）,且呈现出先升高后降低的趋势。2. 抗性基因频率检测结果表明,长江流域红铃虫对Bt棉的抗性处于较低水平。对长江流域红铃虫7个钙粘蛋白抗性等位基因（r1,r2,r3,r13,r14,r15,r16）的检测结果显示,2012-2015年长江流域总的抗性等位基因频率分别为0.0105、0.0044、0.0023、0.0046,总体在10-3～10-2的数量级。与2012年相比,2013-2015年长江流域红铃虫的抗性基因频率显着下降。在检测到的175个抗性个体携带的194个抗性等位基因中,r1占所有抗性等位基因总数的71%,是长江流域红铃虫种群中的主导抗性等位基因;除r3未检测到外,其余抗性等位基因均有发现。3. 通过F1检测法和F2检测法建立单对系进行抗性筛选,从田间种群中筛选获得两个红铃虫Cry1Ac抗性品系——TM6和AQ17。二者对Cry1Ac分别有281.6倍和278.5倍的抗性,对Cry2Ab无交互抗性,对Vip3Aa不敏感。正反交实验结果表明TM6与AQ17对Cry1Ac的抗性遗传方式为常染色体偏隐性遗传,回交实验结果表明TM6、AQ17品系红铃虫与Cry1Ac抗性紧密连锁。4. 钙粘蛋白等位基因r17与r18的CR区缺失突变介导了红铃虫TM6与AQ17品系对Cry1Ac的抗性。r17与r18的c DNA全长分别为5206 bp和4051 bp,相比野生型分别缺失了2 bp和1157 bp。因非3倍数的缺失造成移码突变提前引入终止密码子,导致r17与r18分别只编码211 AA和1278 AA,二者均缺失部分钙粘蛋白重复区、近膜区、跨膜区和胞内区等结构。r17、r18的g DNA上的碱基缺失和替换造成各自m RNA的碱基缺失或外显子/内含子剪接识别错误。5. 采用昆虫细胞系Tn H5对抗性基因r17与r18进行了功能验证。亚细胞定位结果显示,细胞表达的对照组s Pg Cad1-EGFP融合蛋白均定位在细胞膜上;细胞表达的r17Pg Cad1-EGFP与r18Pg Cad1-EGFP融合蛋白均不能正确锚定在细胞膜上,而是定位在内质网上,定位错误导致蛋白丧失受体与Cry1Ac毒素结合的功能。细胞毒力测定实结果表明,r17、r18与Cry1Ac抗性相关。表达r17Pg Cad1-EGFP与r18Pg Cad1-EGFP融合蛋白的Tn H5细胞对40μg/m L的Cry1Ac处理不敏感,而表达s Pg Cad1-EGFP融合蛋白的细胞对10μg/m L的Cry1Ac处理表现出膨大、破裂的病变现象,表明前者对Cry1Ac产生抗性。6. 棉铃生物测定结果表明,红铃虫TM6与AQ17品系的Cry1Ac抗性与Bt棉的田间抗性相关。两个抗性品系的红铃虫在GK19、CV163和Simian3这三种棉铃上均可以存活,但敏感品系红铃虫AS只能在Simian3上存活。相对于在常规棉Simian3棉铃上的存活情况,TM6与AQ17品系在两种Bt棉上存活率降低、幼虫发育历期延长、蛹重降低、单雌产卵量降低。7. 建立了钙粘蛋白抗性等位基因r17与r18的分子检测方法。根据钙粘蛋白抗性等位基因r17、r18的g DNA突变位点与野生型基因序列的差异,设计了基因特异性引物,用于红铃虫田间种群抗性基因r17、r18的检测和基因型鉴定。以上结果阐明了我国长江流域红铃虫对Cry1Ac的敏感性及其抗性基因频率的年度变化,明确了钙粘蛋白抗性基因r17、r18突变介导了红铃虫对Cry1Ac的抗性机制,丰富了红铃虫对Bt棉田间抗性的监测手段。本研究为制定科学合理的红铃虫对Bt棉花抗性的治理决策提供了科学参考。
卜鹏佳[5]（2019）在《转基因抗虫棉遗传群体Bt蛋白含量与纤维品质研究》文中研究表明棉铃虫（Helicoverpa armigera）是棉花生长过程中的主要害虫,从苗期到吐絮期整个生育期均能造成危害。在过去的20多年中,转Bt基因抗虫棉的出现和应用有效限制了棉铃虫危害并减少了化学农药制剂的使用,为国家带来了显着的社会效益与经济效益,因此选育高抗、高产、优质抗虫棉逐渐成为棉花育种工作的重点。随着抗虫棉的应用,人们发现随着世代的增加抗虫棉存在着抗虫性减弱的现象,不利于抗虫棉应用的同时,也不利于转基因抗虫棉品种的选育。本研究用两种不同遗传背景的转Bt基因抗虫棉品种杂交构建遗传群体,并以F2和F2:3代材料调查了群体的抗虫表现并对结果进行分析,为Bt抗虫棉育种提供帮助。同时探究抗虫棉抗虫性与相关产量品质性状的关系,为选育高抗优质品种提供理论依据。主要研究结果如下:1.对所构建抗虫杂交棉遗传群体F2代进行Bt基因检测,结果发现Bt基因在遗传时出现缺失现象,卡那霉素检测与PCR检测结果并非完全相同,并经过综合筛选构建F2:3代群体。2.对所构建抗虫杂交棉遗传群体F2:3代进行室内生物抗虫测定,结果发现群体抗虫性出现分离现象,并根据棉铃虫幼虫死亡率评级,其中73份材料抗性级别为“高抗”,86份材料抗性级别为“抗”,8份材料抗性级别为“低抗”,6份材料抗性级别为“感”。3.在棉花苗期、蕾期、铃期对抗虫棉杂交F2:3代群体棉花叶片、棉蕾和棉铃的Bt蛋白表达量进行检测,结果表明不同材料的Bt蛋白表达量均无相关性并存在时空表达差异,总体上时间差异表达结果为:蕾期>苗期>铃期;空间差异表达结果为:营养器官>生殖器官。4.幼虫死亡率与蕾期叶片Bt蛋白呈现极显着正相关关系,结果显示Bt蛋白表达量越高,抗虫棉的杀虫性越高抗虫性越好。育种上可以根据Bt蛋白表达量水平来判断抗虫棉品种的抗虫性。5.分析了本试验遗传群体F2:3代Bt蛋白与纤维品质性状的相关性,结果表明Bt蛋白并不影响棉花纤维品质。同时结合抗虫性与品质性状对F2:3代群体进行筛选,得到L-76与L-78两份高抗、高产、优质性状材料。本实验对抗虫棉群体F2和F2:3代抗虫表现、Bt蛋白表达、相关产量性状及纤维品质和进行检测与分析研究,为抗虫棉品种选育,审定及推广提供帮助。
邓莉[6]（2017）在《农杆菌介导海岛棉Bt基因的遗传转化及鉴定》文中认为本研究是在海岛棉再生体系的基础上以新疆海岛棉33号棉种为材料,获得胚性愈伤后对其进行Bt基因的遗传转化研究。对获得的转基因植株进行分子检测以及室内生物测定,初步确定Bt基因已整合到海岛棉品种的基因组中,并对棉铃虫具有一定的抗性作用,结果如下:切取无菌苗下胚轴为外植体,采用0.1 mg·L-11 2,4-D和0.1 mg·L-11 KT激素组合诱导愈伤组织,20 d继代培养1次,至分化获得胚性愈伤组织。将携带Bt-Cry1A基因的表达载体pBI121通过农杆菌介导法转化到新疆海岛棉33号的胚性愈伤组织中。经含有Kan(50 mg·L-1)和Cef(500 mg·L-1)的培养基筛选后得到抗性胚性愈伤组织,在KNO3加倍、NH4NO3减为1/4的分化培养基中分化出体细胞胚,大量减为1/2的培养基中获得抗性苗,对获得的抗性苗采用嫁接的方法以提高成活率,共获得12棵抗性植株。对嫁接得到的12棵抗性植株进行分子检测,结果如下:PCR检测结果显示,Bt基因特异性引物、GUS基因特异性引物和35S Promoter特异性引物对12棵抗性植株均能扩增出大小相符的片段,检测结果呈阳性;Southern blot鉴定结果显示,随机挑选的7个PCR阳性植株均检测到目的基因的整合;RT-PCR检测结果显示,12棵转基因植株目的基因已经整合入基因组DNA,且能反转录出mRNA;Bt-Cry1Ab/Ac转基因试纸条检测结果中12棵转基因植株均出现了两条紫红色的条带,表明转基因植株叶片中含有目的蛋白。室内生物测定的结果如下:通过综合评价叶片平均受害等级、幼虫校正死亡率以及幼虫平均体重,结果表明,4号、10号和12号转基因植株的综合抗性级别为抗,其他转基因植株综合抗性级别为中抗。
周向阳[7]（2017）在《四个转Bt基因抗虫棉的抗性鉴定与染色体定位》文中指出棉花是我国农业生产中最重要的经济作物之一,既可作为纺织工业中的重要原料,又是重要的油料作物来源。在棉花的现代化生产中,虫害是影响棉花产量和品质的一个重要问题,我国每年由虫害所造成的损失约占棉花总产值的12%～15%。随着基因工程技术的不断发展,育种学家利用基因工程技术和传统育种相结合的方法,通过农杆菌介导法把外源Bt基因导入受体棉花植株,获得了抗虫能力80%以上的转Bt基因抗虫棉;从而有效地控制了棉铃虫等害虫对棉花生产的危害,大大减少了由虫害所造成的损失。自1994年中国成功研制出转Bt基因单价抗虫棉以来,到目前为止,转基因抗虫棉已占棉花总种植面积的93%以上。由于转基因抗虫棉对人类、牲畜和生态环境没有危害,因此带来了巨大的经济价值、生态效益和社会效益。本论文从以下几个方面开展研究,并取得研究结果如下:1.转基因抗虫棉的抗虫性鉴定（1）PCR鉴定。利用检测中美Bt基因的混合特异性引物,对四个转基因抗虫棉品种YL02-1、GK19、G-6、33B进行PCR鉴定。结果显示,四个品种中都含有Bt基因,且品种YL02-1、GK19符合国产单价Bt抗虫基因引物设计的特征片段长度456bp,即是国产单价Bt抗虫基因;品种G-6、33B符合国外产单价Bt抗虫基因引物设计的特征片段长度310bp,即是国外产单价Bt抗虫基因。（2）Bt毒蛋白含量鉴定。利用ELISA法测定四个海陆杂交组合及亲本种胚的Bt毒蛋白含量。结果表明,有三个组合中F1代的Bt毒蛋白含量超过了抗虫亲本,只有一个组合的Bt毒蛋白含量接近抗虫亲本,且都达到了高抗级别（高抗>450 ng/g）,可知Bt基因在F1代中呈显性表达。对比国内和国外抗虫亲本及其杂交F1代的Bt毒蛋白含量,显示国产抗虫棉品种的Bt毒蛋白表达量并不比国外品种逊色。（3）生物学抗虫性鉴定。以苏棉9号为对照品种,对四个品种YL02-1、GK19、G-6和33B的苗期和蕾铃期进行室内接虫抗虫性试验,得到不同指标的动态抗性信息与综合抗性信息。结果表明,四个品种的综合抗性值K均介于35～41之间,平均抗性值PK均处于3.00～3.5之间,综合抗性级别相同均为抗,不存在统计学上的显着差异,显示国产和国外抗虫棉品种在生物学抗虫能力没有明显差异。2.抗虫棉Bt基因的遗传方式以转基因抗虫陆地棉种质系为父本与非抗虫海岛棉种质系为母本来配置4个海陆杂交组合:YL02-1×海7124、GK19×胜利1号、G-6×海7124、33B×胜利1号。然后F1代自交获得四个组合的F2代分离群体。通过对F2代分离群体的Bt基因进行PCR特异性扩增,观察目的Bt基因条带,结果显示四个组合的F2代群体,其有Bt基因单株与无Bt基因单株均拟合3:1的理论分离比例,表明这4个抗虫棉皆由单显性质量基因控制,可以进行染色体定位。3.抗虫棉Bt基因的染色体定位采用4个抗虫亲本配置的海陆杂交F2群体为定位群体,以平均覆盖在棉花26条染色体的234对核心引物对近等基因混池进行PCR检测。检测后发现:（1）在[YL02-1×海7124]F2群体中,获得38对SSR多态性引物。将获得的引物对F2代群体进行标记基因型检测,而后分析结果发现,标记NAU2579与YL02-1中的Bt基因连锁,且已知标记NAU2579位于棉花第20染色体,合成该染色体位于引物NAU2912两侧约50cM之内的其它引物。然后通过双亲对标记进行多态性筛选,用得到多态性引物检测F2代群体标记基因型,并通过JoinMap4.0软件进行连锁遗传分析,共获得17对多态性引物与Bt基因连锁。构建连锁图谱,YL02-1中的Bt基因位于棉花第20染色体上,两侧分子标记为Gh564和NAU3813,其遗传距离分别为2.8cM 和 12.2cM。（2）在[GK19×胜利1号]F2群体中,获得22对SSR多态性引物。将获得的标记对F2代群体进行标记基因型检测,结果显示,标记NAU2579与GK19中的Bt基因连锁,且已知标记NAU2579位于棉花第20染色体,合成位于标记NAU2912所在染色体两侧约50cM之内的其它引物。然后通过双亲对引物进行多态性筛选,用得到的多态性引物检测F2代群体标记基因型,并通过JoinMap 4.0软件进行连锁遗传分析,显示16对多态性引物与GK19中的Bt基因连锁。构建连锁图谱,GK19中的Bt基因也位于棉花第20染色体上,两侧标记为NAU3907和NAU2579,其遗传距离分别为2.4cM 和 1.5cM。（3）在[G-6×海7124]F2群体中,获得32对SSR多态性引物。将获得的多态性引物对F2代群体进行标记基因型检测,结果发现,引物NAU2912与G-6中的Bt基因连锁,且已知标记NAU2912位于棉花第26染色体,合成标记NAU2912所在染色体两侧约50cM之内的其它引物。然后通过双亲对引物进行多态性筛选,用得到的多态性引物检测F2代群体标记基因型,并通过JoinMap 4.0软件进行连锁遗传分析。分析结果可知,20对多态性引物与G-6中的Bt基因连锁。构建连锁图谱,G-6中的Bt基因被定位在棉花第26染色体上,两侧分子标记为cgr6471和dc60240,其遗传距离分别为4.5cM和3.3Cm。（4）在[33B×胜利1号]F2群体中,获得37对SSR多态性标记。而后对F2代群体进行标记基因型检测,由结果显示,多态性引物NAU2912与33B中的Bt基因连锁。且已知标记NAU2912位于棉花第26染色体,合成位于标记NAU2912所在染色体两侧约50cM之内的其它引物。然后通过双亲对引物进行多态性筛选,用得到的多态性引物检测F2代群体标记基因型,并通过JoinMap 4.0软件进行连锁遗传分析。分析结果可知,20对多态性引物与33B中的Bt基因连锁。目标基因位于标记NAU460和dc60240之间,其遗传距离分别为3.6cM和2.0cM。
谷淇深,李志坤,王省芬,张艳,吴立强,柯会锋,张桂寅,马峙英[8]（2017）在《Bt抗虫棉新品系毒蛋白表达差异分析》文中研究表明【目的】本研究旨在探讨部分抗虫棉不抗虫的原因。【方法】通过室内生物测定、卡那霉素、Bt-Cry1Ab/Ac试纸条、PCR分析、Southern blot检测和Bt蛋白含量检测等方法分析了23个抗虫棉新品系的抗虫性。【结果】生测结果表明供试品系间幼虫死亡率差异显着。卡那霉素、Bt-Cry1Ab/Ac试纸条、PCR分析和Southern blot检测结果表明,Bt基因在供试材料中整合并稳定遗传且为单拷贝。RT-PCR结果表明,各试验品系Bt基因相对表达量差异较大,花期叶片Bt基因的相对表达量最高;Bt蛋白检测结果发现抗虫棉Bt蛋白表达量在生育前期大于后期,营养器官中的大于生殖器官,不同年份Bt蛋白含量差异显着。幼虫死亡率与Bt基因相对表达量的相关系数仅为0.1745,与Bt蛋白的相关系数为0.7130,表明Bt蛋白含量越高,抗虫性越好;各组织器官的Bt蛋白与Bt基因的相对表达量相关系数为-0.36590.2542,二者表达趋势不一致,表明遗传背景对抗虫棉Bt蛋白的表达具有一定影响。且Bt基因可能在转录后受到调控导致Bt蛋白含量发生变化,从而影响了抗虫棉的抗虫性。【结论】这些结果有望为抗虫棉育种提供参考。
张京飞[9]（2014）在《转Bt基因抗虫棉抗虫性研究与新品系筛选》文中研究说明转Bt基因抗虫棉品种的推广种植，具有显着的社会和经济效益，选育高抗、优质、高产的转Bt基因抗虫棉新品系是育种工作的重心。本研究以14个转Bt基因抗虫棉品系和对照品种中棉所8号，对各品系的抗虫性、抗病性、产量、品质、种子纯度等方面的表现综合分析，筛选出适宜参加棉花区试的转基因抗虫棉新品系，并初步探究转Bt基因抗虫棉抗虫性表现规律。主要研究结果如下：1.经多代选育，田间表型一致的转Bt基因抗虫棉新品系，田间卡那霉素检测其阳性率多数未达到100%，由卡那霉素检测为阳性的植株，用Bt基因PCR检测和Bt胶体金免疫试纸条检测，多数阳性率达到100%，还存在未达到100%的品系；14个转Bt基因抗虫棉的Bt蛋白表达都属于高表达，但不同品系间差异显着，最高表达量是最低表达量的约一倍，Bt蛋白表达量在800ng/g鲜重以上的有5个品系；转Bt基因抗虫棉不同时期其叶中Bt蛋白表达量存在差异，同一时期不同组织中Bt蛋白表达量存在差异，叶中含量高于铃中高于花中；NDP7三个时期叶中Bt蛋白表达量均高于其它品系，NDP14、NDP2等品系三种组织中的Bt蛋白量均较高。2.抗虫棉新品系的抗虫性室内鉴定结果表明，不同品系的抗虫性存在差异，一般Bt蛋白表达量高其抗虫性强，NDP7的Bt蛋白量表达最高，对棉铃虫幼虫的致死率达到了100%。筛选出了NDP7、NDP8等6个抗虫性表现良好的转Bt基因抗虫棉品系。3.使用24对核心引物，利用SSR分子标记技术测定14个转Bt基因抗虫棉的种子纯度，结果显示14个转Bt基因抗虫棉育种系为杂交棉，种子纯度均在85%以上。4.抗黄萎病性鉴定结果显示，无高抗品系，有两个抗病品系，多数品系属于耐病类型，NDP8品系属于感病。5.产量及其构成因素的数据分析结果显示NDP8、NDP11、NDP6、NDP4四个个品系在产量性状中表现良好。6.各转Bt基因抗虫棉品系的棉花纤维品质进行检测，由结果可知，由表可知，只有NDP6的棉纤维达到了品质优良，各指标均达到了普通优质型标准要求，其它品系综合品质较好，达到了三型标准。7.综合考虑14个转Bt基因抗虫棉在各方面的表现，筛选出NDP2、NDP8、NDP11三个表现优良的新品系。
王成鹏[10]（2012）在《转Bt和Bt+CpTI基因棉对土壤微生物群落影响的研究》文中提出本研究以两对转基因抗虫棉中棉41、GK-12及其亲本非转基因常规棉中棉23、泗棉3号为材料，选择了江苏、湖北、河南三个棉花种植区作为试验点，2010—2011年连续两年，分别于棉花生长的苗期、蕾期、花铃期、吐絮期、衰老期采集棉花根围表层土壤（0—20cm），研究了长期种植转基因抗虫棉对土壤微生物群落的影响。利用平板培养计数方法研究了转基因抗虫棉对土壤中可培养细菌、真菌、放线菌、需氧型固氮菌、反硝化细菌和亚硝化细菌数量的影响；利用Biolog Eco板培养方法研究了转基因抗虫棉对土壤微生物碳源代谢活性的影响；利用PCR-DGGE方法比较了转基因棉与常规棉棉田土壤细菌群落多样性及真菌群落多样性之间的差异；利用磷脂脂肪酸技术研究了转基因抗虫棉种植对土壤微生物群落结构多样性的影响。同时比较了不同转基因抗虫棉品种及同一品种转基因抗虫棉在不同棉花种植区对土壤微生物影响的差异。主要研究结果如下：1、种植转基因抗虫棉对土壤可培养微生物数量有一定影响，2种转基因棉花品种对土壤可培养微生物数量影响存在差异。在棉花整个生育期间，转Bt基因抗虫棉土壤可培养微生物数量略低于常规棉，吐絮期细菌数量显着低于常规棉；转Bt+CpTI基因抗虫棉土壤可培养微生物数量略高于常规棉，转Bt+CpTI基因抗虫棉对土壤真菌、放线菌数量影响较大，在苗期、花铃期、吐絮期土壤真菌数量显着高于常规棉，苗期放线菌数量显着高于常规棉；转基因抗虫棉对土壤固氮菌、反硝化细菌、亚硝化细菌数量没有显着影响。2、种植转基因抗虫棉对土壤微生物碳源代谢活性也有一定影响，并且与转基因棉花品种和棉花种植区有关。转Bt基因抗虫棉棉田土壤微生物碳源代谢活性略低于常规棉，在吐絮期有显着性差异；转Bt+CpTI基因抗虫棉棉田土壤微生物碳源代谢活性略要高于常规棉，但是仅在盐城实验地，蕾期出现显着性差异。3、PCR—DGGE结果表明，相同生育期，转基因棉与常规棉田土壤细菌、真菌群落都具有较高的相似性，转基因棉种植没有造成土壤细菌、真菌群落多样性产生显着性改变。4、利用PLFA方法研究表明，种植转基因棉对土壤微生物PLFA种类和含量没有显着影响，不会造成土壤微生物生物量及微生物群落种群结构发生显着性改变。5、棉田土壤微生物数量、群落多样性呈现显着性季节变化，不同生育期差异较大。
二、转Bt基因棉的鉴定和纯度检测技术研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转Bt基因棉的鉴定和纯度检测技术研究（论文提纲范文）
（1）Bt-Cry5Aa杀虫基因的原核表达、纯化及其在棉花中的鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试菌株及培养基 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 引物设计合成与PCR扩增 |
| 1.4 表达载体的构建及转化 |
| 1.4.1 连接及转化载体pGEX-4T-3与Cry5Aa目的片段 |
| 1.4.2 重组表达质粒的鉴定 |
| 1.5 诱导和表达重组pGEX-4T-3+Cry5Aa(+)融合蛋白 |
| 1.5.1 不同浓度IPTG的诱导与表达 |
| 1.5.2 最佳浓度下IPTG不同时间诱导表达 |
| 1.5.3 重组p GEX-4T-3+Cry5Aa(+)融合蛋白West-ern blot分析 |
| 1.6 纯化重组p GEX-4T-3+Cry5Aa(+)融合蛋白 |
| 1.7 Cry5Aa基因在棉花中的表达鉴定分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Cry5Aa基因目的片段的扩增 |
| 2.2 p GEX-4T-3+Cry5Aa (+)表达载体的构建及鉴定 |
| 2.3 表达、纯化与鉴定重组蛋白pGEX-4T-3+Cry5Aa (+) |
| 2.4 Cry5Aa基因在棉花中的表达验证 |
| 2.5 Cry5Aa基因在棉花中的时空表达 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（2）转cry1Ab基因玉米对非靶标节肢动物多样性的影响及抗虫性的评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 转基因技术 |
| 1.2 转基因作物发展概况 |
| 1.3 转基因生物安全评价 |
| 1.3.1 环境安全评价 |
| 1.3.2 对非靶标动物的影响 |
| 1.4 目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试植物 |
| 2.1.2 供试虫源 |
| 2.1.3 试验地点 |
| 2.1.4 试验试剂与仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 转cry1Ab基因抗虫玉米对非靶标节肢动物多样性的影响 |
| 2.2.2 转基因抗虫玉米植株Cry1Ab蛋白含量测定及表达规律研究 |
| 2.2.3 转cry1Ab基因玉米抗虫性评价 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 转cry1Ab基因玉米对非靶标节肢动物多样性的影响 |
| 3.1.1 2018年转cry1Ab基因玉米田非靶标节肢动物多样性分析 |
| 3.1.2 2019年转cry1Ab基因玉米田非靶标节肢动物多样性分析 |
| 3.2 转基因抗虫玉米植株Cry1Ab蛋白含量及表达规律 |
| 3.2.1 Bt蛋白标准曲线 |
| 3.2.2 转基因抗虫玉米不同生育期各组织Cry1Ab蛋白含量 |
| 3.2.3 转基因玉米各生育期不同组织器官Cry1Ab蛋白含量 |
| 3.3 转cry1Ab基因玉米抗虫性的评价 |
| 3.3.1 转cry1Ab基因玉米对亚洲玉米螟的抗性 |
| 3.3.2 转cry1Ab基因玉米对棉铃虫的抗性 |
| 3.3.3 转cry1Ab基因玉米对粘虫的抗性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 转基因抗虫玉米对非靶标节肢动物多样性的影响 |
| 4.2 转基因抗虫玉米Cry1Ab蛋白时空表达情况 |
| 4.3 转基因抗虫玉米对亚洲玉米螟、棉铃虫和粘虫的抗性评价 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 附件 |
（3）利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗盲蝽新种质（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 棉花抗虫育种研究进展 |
| 1.1.1 形态抗虫育种 |
| 1.1.2 生化抗虫育种 |
| 1.1.3 分子标记辅助选择抗虫育种 |
| 1.1.4 转外源抗虫基因抗虫育种 |
| 1.1.5 利用RNAi技术沉默昆虫靶标基因抗虫育种 |
| 1.2 盲蝽的危害特点及抗盲蝽研究的必要性 |
| 1.2.1 盲蝽的种类及形态特征 |
| 1.2.2 盲蝽的生活习性以及危害特点 |
| 1.2.3 开展棉花抗盲蝽研究的重要性和必要性 |
| 1.3 RNAi的研究进展及在作物抗虫育种中的应用 |
| 1.3.1 RNAi现象的发现及定义 |
| 1.3.2 RNAi的作用机理及特点 |
| 1.3.3 RNAi的种类 |
| 1.3.4 昆虫摄取dsRNA的方式 |
| 1.3.5 植物介导的RNAi技术在作物抗虫育种中的应用 |
| 1.4 FAR基因研究进展 |
| 1.5 LIM基因研究进展 |
| 1.6 本研究的目的意义与技术路线 |
| 1.6.1 本研究的目的与意义 |
| 1.6.2 本研究的技术路线 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料,载体和菌株 |
| 2.1.2 植物表达载体 |
| 2.1.3 基因的来源 |
| 2.1.4 供试的昆虫材料 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 载体构建 |
| 2.2.2 棉花遗传转化 |
| 2.2.3 棉花DNA提取与Southern杂交 |
| 2.2.4 棉花RNA提取,表达量分析以及Northern杂交 |
| 2.2.5 盲蝽RNA提取,反转录以及RT-qPCR基因表达量分析 |
| 2.2.6 盲蝽的田间抗虫鉴定 |
| 2.2.7 转基因棉花大田农艺性状评价 |
| 2.2.8 非靶标昆虫的室内抗性鉴定 |
| 2.2.9 绿盲蝽的室内抗性鉴定 |
| 2.2.10 dsAl LIM和 dsGFP处理后绿盲蝽的转录组分析 |
| 第三章 利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗中黑盲蝽新种质 |
| 3.1 结果与分析 |
| 3.1.1 AsFAR转基因棉花的获得与分子检测 |
| 3.1.2 AsFAR转基因棉花的表达量检测 |
| 3.1.3 AsFAR转基因棉花对中黑盲蝽种群数量的影响 |
| 3.1.4 AsFAR转基因棉花对中黑盲蝽内源靶标基因表达水平的影响 |
| 3.1.5 AsFAR转基因棉花对中黑盲蝽的抗性显着增强 |
| 3.1.6 AsFAR转基因棉花对非靶标害虫的影响 |
| 3.1.7 不同世代AsFAR转基因棉花大田农艺性状及纤维品质调查分析 |
| 3.2 讨论 |
| 第四章 利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗绿盲蝽新种质 |
| 4.1 结果与分析 |
| 4.1.1 基因序列分析及载体构建 |
| 4.1.2 AlLIM转基因棉花的获得 |
| 4.1.3 AlLIM转基因棉花的阳性检测及拷贝数分析 |
| 4.1.4 AlLIM转基因棉花的表达量检测 |
| 4.1.5 AlLIM转基因棉花对绿盲蝽内源靶标基因表达水平的影响 |
| 4.1.6 AlLIM转基因棉花的室内饲喂效果检测 |
| 4.1.7 ds Al LIM处理后绿盲蝽转录组分析 |
| 4.1.8 AlLIM转基因棉花的田间抗绿盲蝽效果检测 |
| 4.1.9 不同世代AlLIM转基因棉花大田农艺性状及纤维品质调查分析 |
| 4.1.10 AlLIM转基因棉花对非靶标昆虫的影响 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 AlLIM转基因棉花的抗虫性研究 |
| 4.2.2 绿盲蝽AlLIM基因的功能研究 |
| 4.2.3 AlLIM转基因棉花的环境安全性评价 |
| 4.2.4 RNAi转基因作物与Bt转基因作物的叠加是未来抗虫育种发展的新方向 |
| 4.2.5 植物介导的RNAi技术面临的挑战 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 载体构建 |
| 附录2 棉花的遗传转化 |
| 附录3 棉花DNA提取(天根试剂盒法DP305) |
| 附录4 Sourthern杂交(地高辛标记法) |
| 附录5 棉花RNA提取 |
| 附录6 Northern杂交(地高辛标记法) |
| 附录7 AsFARDNA序列 |
| 附录8 AlLIMDNA序列 |
| 附表 |
| 附表1 本研究所用的引物序列 |
| 已发表和待发表论文 |
| 已申请专利 |
| 致谢 |
（4）钙粘蛋白基因r17和r18突变介导的红铃虫对转Bt基因棉花的抗性机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 转基因作物的发展状况 |
| 1.2.1 全球转基因作物的种植情况 |
| 1.2.2 中国转基因棉花的种植情况 |
| 1.3 Bt蛋白的杀虫机理 |
| 1.3.1 成孔模型 |
| 1.3.2 信号转导模型 |
| 1.4 昆虫对Bt蛋白的抗性机制 |
| 1.4.1 昆虫中肠蛋白酶介导的Bt抗性 |
| 1.4.2 昆虫中肠受体改变介导的Bt抗性 |
| 1.4.3 其它因素介导的Bt抗性 |
| 1.5 昆虫对Bt作物的抗性治理策略 |
| 1.5.1 “高剂量/庇护所”策略 |
| 1.5.2 基因叠加策略 |
| 1.5.3 蛋白修饰策略 |
| 1.6 选题的目的与意义 |
| 1.7 本文技术路线 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 试剂和仪器 |
| 2.2 长江流域红铃虫对Bt棉的抗性监测 |
| 2.2.1 田间红铃虫对Cry1Ac蛋白的敏感性测定 |
| 2.2.2 田间红铃虫抗性等位基因频率分子检测 |
| 2.3 红铃虫Cry1Ac抗性品系的建立和纯化 |
| 2.3.1 F_1检测法建立和纯化抗性种群 |
| 2.3.2 F_2检测法建立和纯化抗性种群 |
| 2.4 红铃虫抗性品系对不同Bt蛋白的生物测定 |
| 2.4.1 对Cry1Ac蛋白的生物测定 |
| 2.4.2 对Cry2Ab蛋白的生物测定 |
| 2.4.3 对Vip3Aa蛋白的生物测定 |
| 2.5 抗性基因显隐性及抗性遗传方式的测定 |
| 2.5.1 抗性、敏感红铃虫正反交及回交测定 |
| 2.5.2 抗性遗传方式 |
| 2.6 抗性基因m RNA及 g DNA的克隆与鉴定 |
| 2.6.1 抗性红铃虫mRNA序列的克隆与分析 |
| 2.6.2 抗性红铃虫gDNA序列的克隆与分析 |
| 2.6.3 抗性基因检测引物的设计与验证 |
| 2.7 Pg Cad1-EGFP融合基因在昆虫细胞系中的表达与定位 |
| 2.7.1 限制酶切位点引物设计及重组质粒构建 |
| 2.7.2 重组质粒转染 |
| 2.7.3 重组蛋白的表达 |
| 2.7.4 细胞形态观察 |
| 2.7.5 TnH5 细胞对Cry1Ac的敏感性测定 |
| 2.8 不同棉花品种对抗性红铃虫生长发育的影响 |
| 2.9 数据统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 长江流域红铃虫的抗性监测 |
| 3.1.1 红铃虫田间种群对Cry1Ac的敏感性测定 |
| 3.1.2 田间红铃虫抗性基因频率检测 |
| 3.2 抗性品系TM6与AQ17的建立和纯化 |
| 3.3 TM6与AQ17 对不同Bt蛋白的生物测定 |
| 3.3.1 对Cry1Ac蛋白的生物测定 |
| 3.3.2 对Cry2Ab蛋白的生物测定 |
| 3.3.3 对Vip3Aa蛋白的生物测定 |
| 3.4 r17与r18的抗性遗传方式 |
| 3.4.1 抗性基因的显隐性 |
| 3.4.2 抗性遗传连锁 |
| 3.5 抗性等位基因的克隆与鉴定 |
| 3.5.1 TM6品系抗性等位基因的克隆与鉴定 |
| 3.5.2 r18的克隆与鉴定 |
| 3.6 rPgCad1-EGFP融合基因在昆虫细胞系中的表达与定位 |
| 3.6.1 重组质粒的构建 |
| 3.6.2 Pg Cad1-EGFP融合基因的表达 |
| 3.6.3 融合蛋白的亚细胞定位 |
| 3.7 Pg Cad-EGFP对 Cry1Ac的敏感性 |
| 3.7.1 Cry1Ac对转染不同质粒细胞的毒力测定 |
| 3.7.2 细胞病变观察 |
| 3.8 抗、感红铃虫在不同棉花品种上的生长发育 |
| 3.8.1 三个棉花品种阳性株鉴定 |
| 3.8.2 TM6品系在不同棉花品种棉铃上的生长发育 |
| 3.8.3 AQ17品系在不同棉花品种棉铃上的生长发育 |
| 4 讨论 |
| 4.1 长江流域红铃虫对Bt棉花的抗性演化 |
| 4.1.1 长江流域红铃虫种群对Bt棉的抗性监测 |
| 4.1.2 长江流域红铃虫抗性基因频率分子检测 |
| 4.2 TM6和AQ17 对不同Bt毒素的敏感性测定 |
| 4.3 TM6和AQ17的抗性遗传方式 |
| 4.4 r17、r18突变位点分析及基因功能验证 |
| 4.5 抗性品系红铃虫在不同棉花品种上的生长发育 |
| 5 总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 论文创新点 |
| 5.3 下一步工作 |
| 参考文献 |
| 攻博期间的论文成果 |
| 致谢 |
（5）转基因抗虫棉遗传群体Bt蛋白含量与纤维品质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 Bt基因的简介与分类 |
| 1.2 Bt抗虫棉的研究与应用 |
| 1.3 转基因抗虫棉Bt蛋白研究概况 |
| 1.3.1 Bt蛋白表达的时间变化规律 |
| 1.3.2 Bt蛋白表达的空间变化规律 |
| 1.3.3 Bt蛋白表达与环境等因素的影响 |
| 1.4 Bt基因的遗传稳定性研究 |
| 1.4.1 Bt基因在转基因作物中遗传规律研究 |
| 1.4.2 Bt基因对转基因作物农艺性状的影响 |
| 1.5 转基因抗虫棉抗性检测方法 |
| 1.5.1 室内生物测定及分级标准 |
| 1.5.2 Bt蛋白表达测定及分级标准 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 供试虫源 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 试验设计 |
| 2.2.2 转Bt基因抗虫棉鉴定 |
| 2.2.3 转Bt基因抗虫棉室内生物测定 |
| 2.2.4 抗虫棉Bt蛋白检测 |
| 2.2.5 铃重、衣分调查和纤维品质检测 |
| 2.2.6 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 转Bt基因抗虫棉群体鉴定 |
| 3.1.1 Bt基因的PCR检测结果 |
| 3.1.2 田间卡那霉素法检测结果 |
| 3.2 室内抗虫性生物测定结果 |
| 3.3 抗虫棉Bt蛋白含量测定 |
| 3.3.1 Bt蛋白在不同时期的表达差异 |
| 3.3.2 Bt蛋白在不同组织部位的表达差异 |
| 3.3.3 群体中的Bt蛋白表达规律 |
| 3.4 Bt蛋白表达量与幼虫死亡率的相关性分析 |
| 3.5 铃重衣分与纤维品质检测结果与分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于抗虫棉群体的抗虫性测定 |
| 4.2 抗虫棉Bt基因检测 |
| 4.3 抗虫棉群体中Bt蛋白的表达规律分析 |
| 4.4 抗虫棉中 Bt 蛋白与纤维品质性状的关系 |
| 4.5 抗虫棉新品种的选育方向 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（6）农杆菌介导海岛棉Bt基因的遗传转化及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 棉花转基因技术概述 |
| 1.2 棉花转基因研究现状 |
| 1.3 转基因棉花的分子检测 |
| 1.4 转Bt基因棉花的抗性检测 |
| 1.5 海岛棉 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 农杆菌介导海岛棉胚性愈伤组织的遗传转化 |
| 2.3 转基因植株的鉴定 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 转基因植株的获得 |
| 3.2 转基因植株的PCR检测 |
| 3.3 转基因植株的Southern blot鉴定 |
| 3.4 RT-PCR检测 |
| 3.5 Bt-Cry1Ab/Ac试纸条检测 |
| 3.6 室内抗虫性鉴定 |
| 第4章 讨论与结论 |
| 4.1 转基因植株的获得 |
| 4.2 转基因植株的分子检测 |
| 4.3 转基因植株的室内抗虫性鉴定 |
| 4.4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）四个转Bt基因抗虫棉的抗性鉴定与染色体定位（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词(ABBREVIATION) |
| 第一章 文献综述 |
| 1 转基因抗虫棉花研究进程 |
| 1.1 转Bt基因抗虫棉种植的起因 |
| 1.2 外源Bt抗虫基因的主要类型 |
| 1.3 其它外源抗虫基因类型 |
| 1.4 外源基因的遗传方式和整合特性 |
| 1.5 国内外转Bt基因抗虫棉研究进展 |
| 1.6 转Bt基因抗虫棉的抗性衰退问题 |
| 2 DNA分子标记概述 |
| 2.1 DNA分子标记技术的分类 |
| 2.2 DNA分子标记技术的应用 |
| 3 转BT基因棉花鉴定的主要方法 |
| 3.1 目的基因PCR检测法 |
| 3.2 Bt毒蛋白ELISA法检测法 |
| 3.3 生物学抗虫性检测法 |
| 4 本研究的目的意义及技术路线 |
| 第二章 转基因抗虫棉的抗性鉴定 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 PCR鉴定材料 |
| 1.2 Bt毒蛋白ELISA法鉴定材料 |
| 1.3 生物学抗虫性鉴定材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 Bt基因PCR鉴定 |
| 2.2 抗虫棉Bt毒蛋白含量检测 |
| 2.3 转基因棉的室内和田间综合抗性鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 转Bt抗虫基因的PCR检测结果 |
| 3.2 Bt毒蛋白的ELISA检测 |
| 3.3 抗虫棉生物抗虫性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第三章 四个转基因抗虫棉的BT基因染色体定位 |
| 1 试验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 试剂配制 |
| 2.2 DNA提取缓冲液的配置方法 |
| 2.3 DNA裂解缓冲液的配置方法 |
| 2.4 棉花叶片DNA的提取 |
| 2.5 SSR引物来源 |
| 2.6 PCR反应体系、扩增和电泳 |
| 2.7 基因的初步定位及遗传图谱的构建 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Bt基因在四个海陆杂交组合F_2代群体的分离规律 |
| 3.2 Bt基因的染色体定位 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Bt基因的单位点遗传方式与分子标记定位 |
| 4.2 基因定位与抗虫棉Bt基因系谱来源推测 |
| 4.3 外源Bt基因插入染色体的偏好性 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）Bt抗虫棉新品系毒蛋白表达差异分析（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 试验设计。 |
| 1.2.2 生物测定。 |
| 1.2.3 Bt基因纯度检测。 |
| 1.2.4 Southern blot检测。 |
| 1.2.5 Bt基因相对表达量测定。 |
| 1.2.6 抗虫毒蛋白检测。 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 生物测定结果与分析 |
| 2.2 抗虫棉品系Bt基因的遗传稳定性分析 |
| 2.3 Bt基因拷贝数分析 |
| 2.4 Bt基因的相对实时定量分析 |
| 2.5 Bt蛋白含量测定 |
| 2.6 Bt蛋白含量、幼虫死亡率及Bt基因的相关性分析 |
| 3 小结与讨论 |
（9）转Bt基因抗虫棉抗虫性研究与新品系筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 转 BT 基因棉花的发展 |
| 1.2 转 BT 基因抗虫棉的鉴定方法 |
| 1.2.1 外源 Bt 基因的检测 |
| 1.2.2 转 Bt 基因抗虫棉中 Bt 蛋白的检测 |
| 1.2.3 标记基因的检测 |
| 1.3 转 BT 基因抗虫棉研究现状 |
| 1.4 转 BT 基因抗虫棉的综合评价 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 基因组 DNA 的提取方法 |
| 2.2.2 转 Bt 基因抗虫棉纯度检测 |
| 2.2.3 转 Bt 基因抗虫棉的 Bt 蛋白含量检测 |
| 2.2.4 转 Bt 基因抗虫棉抗虫性室内鉴定 |
| 2.2.5 棉花品系的种子纯度检测 |
| 2.2.6 黄萎病抗性鉴定 |
| 2.2.7 田间调查和纤维品质检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 抗虫棉新品系纯度检测 |
| 3.1.1 转 Bt 基因抗虫棉标记基因的检测 |
| 3.1.2 抗虫棉 PCR 检测结果 |
| 3.1.3 金标 Bt 免疫试纸条检测结果分析 |
| 3.2 不同品系 BT 蛋白的表达差异 |
| 3.3 抗虫棉不同时期和组织 BT 蛋白表达量 |
| 3.3.1 抗虫棉新品系不同时期 Bt 蛋白表达量差异 |
| 3.3.2 抗虫棉新品系不同组织 Bt 蛋白表达量差异 |
| 3.4 转 BT 基因抗虫棉抗虫性室内检测 |
| 3.5 转 BT 基因抗虫棉品系抗虫性的综合评价 |
| 3.6 抗虫棉新品系遗传纯度检测 |
| 3.7 黄萎病抗性鉴定 |
| 3.8 抗虫棉新品系产量及产量构成因素 |
| 3.9 纤维品质的检测 |
| 3.10 抗虫棉新品系其它性状调查 |
| 3.11 抗虫棉新品系的综合评价和筛选 |
| 4 讨论 |
| 4.1 转 BT 基因抗虫棉抗虫株的检测方法 |
| 4.2 转 BT 基因抗虫棉抗虫性鉴定的意义 |
| 4.3 转 BT 基因抗虫棉的 BT 蛋白表达规律 |
| 4.4 棉花品种遗传纯度检测对育种的意义 |
| 4.5 BT 蛋白表达量与产量、品质的关系 |
| 4.6 抗黄萎病品系的筛选 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（10）转Bt和Bt+CpTI基因棉对土壤微生物群落影响的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 转基因抗虫棉的抗虫基因及其杀虫机理 |
| 1.2 转基因抗虫棉在我国商业化种植情况 |
| 1.3 转基因植物对土壤微生物的影响 |
| 1.3.1 转基因植物中外源基因表达产物的分布及其进入土壤的主要途径 |
| 1.3.2 转基因植物中外源基因表达产物在土壤中残留及降解情况 |
| 1.3.3 转基因植物对土壤理化性质的影响 |
| 1.3.4 转基因植物对土壤微生物群落的影响 |
| 1.4 土壤微生物群落多样性研究方法 |
| 1.4.1 平板培养计数方法 |
| 1.4.2 Biolog 微平板培养方法 |
| 1.4.3 生物标记物方法 |
| 1.4.4 分子生物学方法 |
| 1.4.5 DNA 测序技术 |
| 1.5 研究总体概述 |
| 1.5.1 研究目的意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 第二章 转基因抗虫棉对土壤微生物数量的影响 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.1.1 试验地概况及供试棉花品种 |
| 2.1.2 土壤样品采集 |
| 2.1.3 仪器设备及药品试剂 |
| 2.1.4 土壤含水量的测定 |
| 2.1.5 微生物的培养及计数 |
| 2.1.6 数据统计与分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 转基因抗虫棉的种植对土壤细菌数量的影响 |
| 2.2.2 转基因抗虫棉的种植对土壤真菌数量的影响 |
| 2.2.3 转基因抗虫棉的种植对土壤放线菌数量的影响 |
| 2.2.4 转基因抗虫棉的种植对土壤固氮菌数量的影响 |
| 2.2.5 转基因抗虫棉的种植对土壤反硝化细菌数量的影响 |
| 2.2.6 转基因抗虫棉的种植对土壤亚硝化细菌数量的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 转基因抗虫棉对土壤微生物群落代谢功能的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验地概况 |
| 3.1.2 土壤样品采集 |
| 3.1.3 仪器设备及药品试剂 |
| 3.1.4 土壤样品分析 |
| 3.1.5 数据处理 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 转基因抗虫棉的种植对土壤微生物群落碳源代谢活性的影响 |
| 3.2.2 转基因抗虫棉的种植对土壤微生物代谢功能多样性的影响 |
| 3.2.3 土壤微生物的主成分分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 转基因抗虫棉对土壤细菌、真菌群落多样性的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验地概况及供试棉花品种 |
| 4.1.2 土壤样品的采集 |
| 4.1.3 仪器设备及药品试剂 |
| 4.1.4 土壤样品微生物 DNA 的提取 |
| 4.1.5 土壤微生物总 DNA 纯度及含量的检测 |
| 4.1.6 土壤微生物总 DNA 的琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 4.1.7 土壤细菌 16S rDNA V3 区 PCR 扩增及真菌 18S rDNA PCR 扩增 |
| 4.1.8 细菌 16S rDNA V3 区及真菌 18S rDNA 的 DGGE 分析 |
| 4.1.9 变性梯度凝胶电泳试剂配置 |
| 4.1.10 结果处理及分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 土壤微生物总 DNA 纯度及含量 |
| 4.2.2 细菌 16S rDNAV3 区及真菌 18S rDNA 的 PCR-DGGE 分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 转基因抗虫棉对土壤微生物 PLFA 指纹图谱的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验地概况及供试棉花品种 |
| 5.1.2 土壤样品的采集 |
| 5.1.3 仪器设备及药品试剂 |
| 5.1.4 提取液的配置 |
| 5.1.5 土壤微生物 PLFA 提取 |
| 5.1.6 数据处理 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 苗期转 Bt+CpTI 基因抗虫棉的种植对土壤微生物 PLFA 含量的影响 |
| 5.2.2 蕾期转 Bt+CpTI 基因抗虫棉的种植对土壤微生物 PLFA 含量的影响 |
| 5.2.3 花铃期转 Bt+CpTI 基因抗虫棉的种植对土壤微生物 PLFA 含量的影响 |
| 5.2.4 吐絮期转 Bt+CpTI 基因抗虫棉的种植对土壤微生物 PLFA 含量的影响 |
| 5.2.5 不同时期土壤微生物群落结构的变化 |
| 5.2.6 不同棉田土壤微生物的主成分分析 |
| 5.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 研究展望 |
| 研究创新点 |
| 参考文献 |
四、转Bt基因棉的鉴定和纯度检测技术研究（论文参考文献）
- [1]Bt-Cry5Aa杀虫基因的原核表达、纯化及其在棉花中的鉴定[J]. 马肖,赵世浩,王峰,贺文,陈金湘,张秋平,周仲华. 农业生物技术学报, 2020(09)
- [2]转cry1Ab基因玉米对非靶标节肢动物多样性的影响及抗虫性的评价[D]. 高越. 河北农业大学, 2020(01)
- [3]利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗盲蝽新种质[D]. 梁思佳. 华中农业大学, 2020(01)
- [4]钙粘蛋白基因r17和r18突变介导的红铃虫对转Bt基因棉花的抗性机制[D]. 王金涛. 华中农业大学, 2019(01)
- [5]转基因抗虫棉遗传群体Bt蛋白含量与纤维品质研究[D]. 卜鹏佳. 河北农业大学, 2019(03)
- [6]农杆菌介导海岛棉Bt基因的遗传转化及鉴定[D]. 邓莉. 新疆农业大学, 2017(02)
- [7]四个转Bt基因抗虫棉的抗性鉴定与染色体定位[D]. 周向阳. 南京农业大学, 2017(07)
- [8]Bt抗虫棉新品系毒蛋白表达差异分析[J]. 谷淇深,李志坤,王省芬,张艳,吴立强,柯会锋,张桂寅,马峙英. 棉花学报, 2017(02)
- [9]转Bt基因抗虫棉抗虫性研究与新品系筛选[D]. 张京飞. 河北农业大学, 2014(03)
- [10]转Bt和Bt+CpTI基因棉对土壤微生物群落影响的研究[D]. 王成鹏. 南京林业大学, 2012(11)