一、老年性黄斑变性线粒体DNA3243点突变分析（论文文献综述）
胡艳滨,苏九妹,高军[1]（2021）在《线粒体损伤在眼科相关疾病中的研究进展》文中研究说明线粒体作为细胞能量的供给中心,在生物活动中发挥重要作用。一旦线粒体功能障碍、甚至基因突变,影响细胞的正常生理状态,导致疾病发生,可累及多器官发病。在眼科领域,可分为基因突变所致的遗传性眼病以及功能障碍所致的非遗传性眼病。本文将对线粒体损伤在眼科相关疾病中的研究进行综述。
牛红思[2]（2020）在《老年性耳聋患者毛干细胞色素c氧化酶亚基表达与酶活性研究》文中进行了进一步梳理[目 的]通过检测老年性耳聋患者毛干组织线粒体DNA的缺失突变情况及毛干组织中细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基因的转录情况,评估老年性耳聋患者毛干组织中细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的翻译表达水平,发现细胞色素c氧化酶的活性变化与老年性耳聋的关系,研究发现其可能的分子学机制。本研究对于老年性耳聋发病机制及相关药物的研发具有一定的科研价值。[方 法]1、临床病例收集,分为实验组与对照组,实验组为老年性耳聋患者,对照组为听力正常的老年人。2.1检测毛干组织线粒体DNA片段突变缺失情况2.2检测毛干组织细胞色素c氧化酶三个亚基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基因的转录水平3、统计分析方法:实验组与对照组线粒体DNA4977 bp缺失突变量采用Fisher确切概率法分析;线粒体DNA 4977 bp缺失突变情况与听力损失程度间的关系用Pearson相关性方法分析;实验组与对照组细胞色素c氧化酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亚基基因相对表达量用独立样本t检验分析;细胞色素c氧化酶三个亚基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基因的转录水平与听力损失程度间的关系用Pearson相关性方法分析。[结 果]1、实验组与对照组细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ相对表达量分别进行独立样本t检验分析,细胞色素c氧化酶Ⅰ亚基结果分析P值小于0.05,差异有统计学意义,可认为毛干细胞色素c氧化酶Ⅰ亚基基因相对表达量有下降。并且Pearson分析可以表明老年性耳聋患者听力损失情况与细胞色素c氧化酶Ⅰ相对表达量下降程度存在正相关关系（P值小于0.05）。2、实验组与对照组线粒体DNA 4977 bp缺失突变量经过Fisher确切概率法分析,P值小于0.05,差异有统计学意义,可认为老年性耳聋患者毛干中存在线粒体DNA4977bp突变缺失。实验组中线粒体DNA 4977片段缺失突变率为80%,对照组中线粒体DNA 4977片段缺失突变率为10%。并且Pearson分析可以表明老年性耳聋患者听力损失情况与DNA 4977片段突变缺失量存在正相关关系（P值小于0.05）。[结 论]1、老年性耳聋患者毛干组织中存在细胞色素c氧化酶活性下降。线粒体DNA突变缺失能引起细胞色素c氧化酶亚基缺失,主要是细胞色素c氧化酶Ⅰ亚基缺失。老年性耳聋患者听力下降程度与毛干细胞色素c氧化酶Ⅰ亚基表达下降程度有正相关性,COXⅠ亚基表达下降越多,听力损失越严重。2、老年性耳聋患者毛干组织中存在线粒体DNA突变缺失。线粒体DNA突变缺失是引起老年性耳聋的常见原因之一。老年性耳聋患者听力下降程度与毛干线粒体DNA突变缺失程度有正相关性,线粒体DNA突变缺失量越多,听力损失越严重。
刘怡陶,李永新[3]（2019）在《线粒体遗传糖尿病伴耳聋的研究进展》文中研究表明线粒体遗传的糖尿病伴耳聋（maternally inherited diabetes and deafness, MIDD）在糖尿病患者人群中约占1%,多数伴有感音神经性耳聋,其遗传学特点主要是由于线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）的突变。准确的遗传诊断对临床检查、诊断、管理和遗传咨询具有重要意义。本文概述了MIDD发病机制的研究进展,以及诊断方法和治疗手段,分析了MIDD的听力损失发生机制以及听力重建的效果。
李秀苗[4]（2018）在《NLGN3对H2O2诱导的视网膜细胞损伤的保护作用和机制研究》文中研究指明视网膜退行性病变是主要的致盲性眼病,主要有年龄相关性黄斑变性和糖尿病视网膜病变,其发病率高,严重影响了患者的生活质量,且临床上治疗各异,效果往往不明显。过度的氧化应激会引起人视网膜色素上皮细胞（Retina Pigment Epithelium,RPE）和视网膜神经节细胞（Retinal Ganglion Cells,RGCs）的严重损伤,进而导致视网膜神经退行性病变。因此,研究视网膜色素上皮细胞和视网膜神经节细胞对氧化应激损伤的病理生理过程显得尤为重要。神经连接蛋白3（Neuroligin 3,NLGN3）是一类细胞粘附分子,广泛分布于中枢神经系统和外周神经系统,在轴突的引导和突触的发生中起重要作用。研究报道,NLGN3作为关键的有丝分裂原可以有效的促进人肿瘤细胞增殖。进一步研究发现NLGN3可以通过激活酪氨酸激酶受体及下游的信号通路（比如PI3KAkt-m TOR）,进而促进肿瘤发生发展进程。然而,目前NLGN3对人视网膜细胞的潜在作用还不是很清楚。本研究采用视网膜两种主要细胞—视网膜色素上皮细胞和视网膜神经节细胞作为研究对象,首先观察NLGN3对过氧化氢（H2O2）诱导的人RPE细胞和RGCs细胞损伤是否有保护作用,进而探索并阐明NLGN3对视网膜细胞氧化损伤的保护作用的作用机制。结果显示预先给予NLGN3可以浓度依赖性抑制H2O2诱导的人RPE细胞和RGCs细胞的活力降低、死亡和凋亡。预先给予NLGN3还可以缓解H2O2导致的人RPE细胞和RGCs细胞ROS生成、脂质过氧化反应和DNA损伤。提示NLGN3对由H2O2诱导的人RPE细胞和RGCs细胞均有保护作用。进一步研究发现,NLGN3可激活视网膜细胞中核因子E2相关因子（nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2）信号,导致Nrf2从细胞浆转移到细胞核,在转录水平引起其下游基因转录增加,抗氧化因子（HO1,NQO1和GCLC）表达增多,产生其抗氧化效应。随后的实验发现:Akt-m TORC1抑制剂RAD001和LY294002可部分或完全取消NLGN3激活人RPE细胞和RGCs细胞Akt-m TORC1和Nrf2信号通路,此外,敲减Nrf2基因后可消除NLGN3对视网膜细胞氧化损伤的保护作用。这些结果均提示NLGN3对由H2O2诱导的人RPE细胞和RGCs细胞损伤的保护作用可能是通过其激活Akt-m TORC1-Nrf2信号通路。本研究为NLGN3可作为防治视网膜退行性疾病的潜在药物提供实验依据。本研究分为两部分进行研究阐述:第一部分:NLGN3对由H2O2诱导的人RPE细胞和RGCs细胞损伤的保护作用;第二部分:NLGN3对由H2O2诱导的人RPE细胞和RGCs细胞损伤的保护作用机制研究
阳洋[5]（2017）在《应用病人来源iPSC诱导的神经元细胞对神经变性疾病中线粒体变化机制的研究》文中研究表明背景遗传性痉挛性截瘫（hereditary spastic paraplegia,HSP）是在 1883 年由Strumpell作为一种带有遗传特征的痉挛性截瘫疾病进行首次报道,随后Lorrain对HSP展开了更加详细的分析讨论,因此HSP也称之为家族性痉挛性截瘫或Strumpell-Lorrain综合征。统计研究表明HSP的发病率约为2-10/100000。临床上症状表现多样化,不同病人不同表现,通常还伴有脑瘫,视神经损伤,智力障碍等一些神经系统症状。大多具有的共同特征包括出现下肢萎缩和痉挛性等临床表现,多数学者将其归于遗传性共济失调范畴,约占后者发病总数的1/4。遗传性痉挛性截瘫也是一种遗传上高度异质性的神经系统遗传病,目前已经有76个HSP致病基因位点被定位,确定的HSP致病基因也已达54个。其中最为常见的是Spastin基因突变所致的遗传性痉挛性截瘫4型（spastic paraplegia-4,SPG4）,约占常染色体显性遗传的40%。近年来,不断地有一些遗传研究报道新的致病基因突变,其中Tamar Harel.et al报道了一个多发性的线粒体内膜蛋白ATAD3A（ATPase family AAA-domain containing protein 3A）上的突变 c.1582C>T（p.Arg 528 Trp）。结果显示该位点可以导致神经性疾病综合征,症状包括发育迟缓,肌肉张力低下,痉挛,视神经萎缩,轴突神经病以及肥厚型心肌病等。通过全外显子测序,我们对一个HSP患病家系所有的候选致病突变进行检测,发现该家系的两个患者均携带有ATAD3A显性遗传杂合突变c.1064 G>A（p.G355D）,其中35岁的母系患者表现为伴随轴突神经病的HSP症状,3.5岁的子系患者表现为运动障碍的脑瘫,并且其发病均始于儿童时期。显性遗传突变ATAD3Ac.1064G>A（p.G355D）位于负责ATP结合的Walker A结构域。目前,关于线粒体内膜AAA（ATPase associated with diverse cellular activities）蛋白 ATAD3A 的功能尚不明确,已知AAA蛋白是通过形成六聚体环状结构发生作用,ATP酶的催化作用需要底物的配合。而后,体外重组蛋白实验也证明了这个突变蛋白的ATP酶活性较野生型表现出显着的降低。为进一步研究ATAD3A c.1064G>A（p.G355D）突变的功能特性,我们分别构建了野生型ATAD3A和突变型质粒,在过表达细胞模型中观察到过度分裂的线粒体形态以及溶酶体的聚集。同样,我们对病人来源的成纤维细胞模型以及多功能干细胞诱导的神经元进行研究分析,也观察到紊乱的线粒体动态平衡以及异常的更多溶酶体。在成纤维细胞模型中发现病人细胞处于一种通过抑制mTOR激活造成的类似饥饿状态,并证明上述这些变化与自噬的上调相关。综上所述,我们得出ATAD3A基因突变可以导致高度异质性的包括HSP在内的一系列显性遗传神经系统疾病,并且拓展了线粒体内膜蛋白ATAD3A与痉挛疾病之间的潜在关系。目的1.收集目标HSP病人临床症状,通过全外显子测序找到潜在的致病基因突变。2.在构建的ATAD3A过表达细胞模型中观察突变体的异常表型。3.在病人特异来源的成纤维细胞模型中观察病人细胞与正常细胞的差异。4.由成纤维细胞诱导的病人特异来源多功能干细胞分化的神经元细胞模型中观察病人细胞相对于正常细胞的异常表型。方法1.应用临床观察和核磁共振技术对目标HSP病人进行临床症状的诊断和判定。2.取病人静脉血液,提取病人全DNA序列,Illumina HiSeq 2500 sequencing进行全外显子测序,利用ANNOVAR程序对测序结果进行分析和筛选,找到潜在致病基因突变。3.生物信息学方法用软件Discovery studio 4.5 software（BIOVIA）对野生型和突变体ATAD3A蛋白结构进行了预测,为进一步的功能研究分析提供线索依据。4.通过体外重组和纯化得到野生型和突变体的ATAD3A蛋白,对其进行ATP酶活性检测（通过测量磷酸盐的释放量来计算ATP酶活性）。5.在体外构建过表达野生型和突变体的ATAD3A质粒,并在正常人的成纤维细胞系统中进行过表达试验,通过蛋白免疫印迹反应进行蛋白检测,通过活体的线粒体和溶酶体追踪以及免疫荧光进行线粒体标记染色形态功能分析。6.利用病人皮肤组织原代培养特异性的成纤维细胞,通过蛋白免疫印迹反应进行蛋白检测,通过活体的线粒体和溶酶体追踪以及免疫荧光进行线粒体标记染色形态功能分析。7.体外利用病人成纤维细胞构建特异多功能干细胞系,通过逆转录病毒将三种附加体质粒包括六种重要因子（OCT3/4,SOX2,KLF4,L-MYC,LIN28和T53 shRNA）整合到细胞进行重编程。8.通过在不同阶段提供营养因子的方法将多功能干细胞特异诱导分化为神经元。9.在病人特异性的神经元中通过蛋白免疫印迹反应进行蛋白检测,通过活体的线粒体和溶酶体追踪以及免疫荧光进行线粒体标记染色形态功能分析。结果1.临床观察目标病人出现明显的下肢萎缩畸形症状,且核磁共振显示脊髓有萎缩变性的形态特征。ATAD3A序列进化上高度保守,且我们研究的目的片段在不同的生物种属和同一蛋白家族之间也都高度保守。2.全外显子测序对潜在的致病基因突变进行筛查,虽然在已知的HSP致病基因中未发现突变,但是发现家系图谱显示第二代母亲患者与第三代孩子患者均携带有 ATAD3A c.1064G>A（p.G355D）突变。3.野生型和突变体ATAD3A蛋白结构预测结果显示了目标突变在距离底物结合部位的γ-磷酸盐小于4A的位置能够引入一个正在进入的ATP磷酸负电荷,这一结果将很可能导致其对ATP的亲和力下降。4.体外重组和纯化ATAD3A野生型和突变体目的蛋白,其ATP酶活性实验结果显示Walker A突变蛋白较野生型有显着的下降趋势。并且野生型与突变体的混合蛋白表现出同样程度的ATP酶活性下降,这一结果表现其负显性调控特性。5.正常人成纤维细胞中过表达野生型ATAD3A,以及K358R和G355D的突变体,同时共转染线粒体标记的绿色荧光蛋白（mitoGFP）,蛋白免疫印迹反应结果证实了过表达系统的有效性,进而对线粒体过度分裂的细胞在转染细胞的百分比进行计数,结果显示过表达突变体组相比于过表达野生型ATAD3A组存在更多的线粒体过度分裂细胞。6.在病人皮肤组织原代培养出的成纤维细胞模型中发现尽管ATAD3A蛋白的表达量与正常人无差异,但是在呼吸链复合物亚基II和IV的表达水平较正常组明显升高,而Drpl的表达明显降低,且观察到病人细胞中伴有超极化线粒体。7.对活细胞进行线粒体（Mito-tracker Red）和溶酶体（Lyso-tracker Green）的追踪以及电镜结果显示其形态学变化,发现在病人成纤维细胞中有异常的延长线粒体形态以及更多的溶酶体空洞。8.验证诱导多功能干细胞系,RT-PCR以及免疫荧光染色结果显示iPSC细胞系中均能够内源表达OCT4,SSEA4和TRA-1-60等干细胞表面标记物,且RT-PCR证实了 OriP和EBNA1在干细胞系中不见表达,表明转基因载体已被清除。9.在活细胞中进行线粒体（Mito-tracker Red）和溶酶体（Lyso-tracker Green）追踪以及电镜结果显示形态学变化,发现在病人特异性的神经元细胞中有类似成纤维细胞模型出现的异常线粒体过度分裂形态以及更多的溶酶体空洞。结论1.ATAD3A重组的突变体蛋白有表现出显着的ATP酶活性下降趋势。2.过表达细胞模型中,突变体ATAD3A过表达表现出明显的线粒体形态异常过度分裂,且伴随有溶酶体堆积及自噬水平的上调。3.同样类似的在病人来源的成纤维细胞和多功能干细胞特异诱导神经元的细胞模型中,观察到紊乱的线粒体动态平衡和更多的溶酶体空洞。4.病人细胞处于一种类似饥饿的状态,存在自噬活动增强。ATAD3A显性负突变进而能导致高度异质性的包括HSP在内的一系列多变化的显性遗传神经系统疾病,并且家系不同成员中可存在显着差异。
张瑄[6]（2014）在《携线粒体DNA A1555G突变的聋病患者特异性iPS细胞系的建立与鉴定》文中提出聋病是全球性公共卫生问题。目前全球有3.6亿聋病患者,其中我国有约3000多万聋病患者。耳聋是由遗传和环境因素引起的,其中50%的耳聋患者是由遗传因素造成的,线粒体基因编码的12S rRNAA15555G突变是氨基糖苷类抗生素诱导的非综合征耳聋的重要原因。由于线粒体的多拷贝性和双重膜结构,目前尚缺乏有效的技术手段对线粒体基因进行定点突变或改造或构建相应的细胞模型和动物模型,严重制约线粒体基因突变相关的疾病发生发展机制研究。诱导性多潜能干细胞（Induced pluripotent stem cells, iPS cells or iPSCs）是一类通过在体细胞中人为表达特定转录因子,诱导体细胞重编程而获得的类似胚胎干细胞的细胞类型。患者特异性iPS细胞则是将患者的体细胞诱导成iPS细胞。其原代细胞来源于患者本身,克服了动物模型存在的物种差异性；原代细胞来源广泛,克服了取材上的困难；更重要的是还保持患者基因组尤其是致病基因不变,为各种疾病的研究提供一个良好的细胞模型。本论文通过收集携线粒体DNA A1555G突变的聋病患者及与其相同线粒体基因组单体型的正常人尿液中的肾小管上皮脱落细胞,经离体培养扩增,建立携mtDNAA1555G突变的聋病患者尿液细胞系正常人尿液细胞系。然后利用逆转录病毒作为载体将四个转录因子（Oct-4, Sox-2, c-Myc, Klf4）导入尿液细胞,建立聋病特异性iPS细胞系和正常人iPS细胞系。光学显微镜观察,iPS细胞聚集形成类似ES细胞紧凑的多细胞集落,呈现克隆边缘明显,核质比高的特点。通过碱性磷酸酶染色（AP染色）、荧光定量PCR、甲基化分析、免疫荧光实验、插入鉴定、核型分析等方法鉴定,显示上述细胞具有较高的碱性磷酸酶活性；内源多能性基因的表达量显着高于原代尿液细胞,外源多能性基因沉默；Nanog和Oct-4基因启动子区为去甲基化状态,尿液细胞为高甲基化状态；细胞表达ES细胞特异性细胞表面标志物,包括SSEA3、SSEA4,肿瘤相关抗原TRA-1-60、TRA-1-81,以及核蛋白NANOG;四个外源性转录因子基因已经整合到iPS细胞的染色体基因组中；细胞核型正常,为46条染色体、XY型。体外拟胚体诱导和体内畸胎瘤形成实验表明上述iPS细胞具有分化为三胚层组织细胞的潜能。同时,对诱导出的iPS细胞系进行全序列线粒体DNA的PCR测序,显示患者iPS细胞仍然保留A1555G突变并且和原代尿液细胞相比未出现新的突变。综上所述,本论文成功建立了携线粒体DNAA1555G突变的聋病特异性iPS细胞系。为深入阐明聋病的致病机制及药物筛选提供可靠的细胞模型,为聋病的诊断和治疗开拓了新思路。
吴继红[7]（2013）在《慢性高眼压视网膜神经节细胞进行性死亡的线粒体机制》文中认为前言青光眼视神经病变是全球首位不可逆致盲眼病。主要表现为以视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell, RGCs）进行性丢失为病理基础的特征性视神经损害和视野缺损。目前认为高眼压是主要的危险因素和始动因素。然而,单纯降低眼压只能从一定程度上缓解病情的发展却不能遏制继发性RGCs死亡及其轴突的溃变。从而使得临床上有效控制视神经病变发展的手段有限。青光眼和线粒体视神经病变在病理特征和临床表现上的诸多相似性使线粒体在青光眼视神经病变中的作用受到越来越多的重视和关注。此外,现已证实线粒体功能障碍在阿尔茨海默病、帕金森病等神经变性疾病中起了重要作用。青光眼也属于神经变性类疾病,具有这些疾病的共同特点：年龄相关性、神经元选择性、进行性丢失。这些证据都提示线粒体在青光眼发展中扮演重要角色的可能性。那么：线粒体在RGCs进行性死亡过程中发生了哪些改变?是否可以解释临床上一些患者在眼压有效控制以后,视力损害仍然持续加重的现象?这些问题尚未见报道。线粒体被称为细胞内的能量工厂,对于细胞的存活和死亡起着至关重要的调控作用。线粒体DNA（mtDNA）是核外唯一的遗传物质,因其特殊的组成结构和细胞内定位使mtDNA较nDNA易受损伤、突变率高。同时,mtDNA几乎不存在非编码区,任何位点的突变都可能被转录,造成蛋白质表达改变,产生严重后果。RGCs作为一类代谢旺盛的神经元,包体和轴突中线粒体的含量非常高。这也就决定了RGC对线粒体功能异常的敏感性。最近有学者在青光眼患者外周血中发现mtDNA突变增加和ATP合成障碍,提示mtDNA损伤及线粒体功能下降是青光眼发病的危险因素之一。然而,这些研究仅局限于患者外周血,还无法解释青光眼视神经病变过程中RGCs和视神经进行性损伤,甚至在眼压有效控制后视力损害仍持续加重的原因。关于青光眼视神经病变发展过程中,RGCs mtDNA的突变、可能的突变机制、以及mtDNA突变在细胞进行性死亡中的作用等问题,未见报道。为此,本研究以慢性高眼压Wistar大鼠模型为对象,研究了mtDNA、mtDNA修复酶、线粒体复合物功能在高眼压和眼压恢复正常后的变化,并通过体外细胞培养实验探讨了高眼压mtDNA突变的可能机制及mtDNA突变与线粒体功能障碍的关系。此外,还深入探讨了mtDNA突变或损伤引起视网膜神经节细胞进行性死亡的可能机制。第一部分慢性高眼压视网膜神经节细胞mtDNA及线粒体功能变化目的：以大鼠慢性高眼压大鼠模型为研究对象,系统研究在高眼压期间和眼压恢复正常后RGCs的丢失特征,以及RGCs中mtDNA损伤与突变、mtDNA修复能力、线粒体功能的动态变化。初步揭示mtDNA异常在青光眼RGCs死亡中的重要性。方法：选用8周龄Wistar大鼠,通过巩膜上静脉烧灼（EVC）方法建立慢性高眼压模型。荧光金逆行标记RGCs后视网膜铺片观察、计数RGCs的存活数量。SMI32免疫荧光标记视神经观察其丢失情况。采用免疫吸附的方法分离纯化RGCs后抽提线粒体、mtDNA.nDNA.线粒体蛋白、细胞浆蛋白、总mRNA.以long-extensionPCR方法检测mtDNA损伤、DNA随即突变捕获的方法检测mtDNA突变率.western blot他realtime PCR方法检测mtDNA修复酶OGG1、MYH和POLG的表达、生化方法检测线粒体功能,包括线粒体复合物Ⅰ和Ⅲ的活性、ATP生成率和ROS含量。结果：80%术眼在EVC术后1天时眼压升高,平均值为25.3±1.6mmHg,在这些眼中高眼压能持续至6周者约占35%（18.7±1.1mmHg）.术后6-7周因血管再通导致眼压逐步降至正常,直至6个月实验结束。对侧假手术眼眼压稳定维持在12.16±0.89mmHg。RGCs计数发现不仅在高眼压期间其数量持续减少,眼压恢复正常后仍进行性下降,术后2、4、6个月RGCs丢失的比例依次为24.6±0.17%（p<0.05）、30.4±0.78%（p<0.01）和34.8±0.15%（p<0.01）。SMI32阳性染色定量分析也证实轴突在眼压恢复正常后的6周至6月期间继续丢失了12%。EVC术后2周检测到mtDNA损伤,并不断增加,但在高眼压期间与对照组相比无统计学意义。眼压恢复正常后继续呈进行性加重趋势,于2、4、6个月时检测mtDNA损伤分别是对照组的1.5倍（p<0.05）、2.8倍（p<0.01）和3.4倍（p<0.01）。mtDNA突变随机捕获实验进一步证实了这个结果：眼压增高后2-4周可检测到mtDNA突变增多,眼压恢复正常后,突变未见减少反而继续增加,术后2、4、6个月Taql1427位点的突变率分别是对照组的7.6倍（p<0.05）、10.3倍（p<0.01）和16.8倍（p<0.01）；Taql8335位点mtDNA突变率在术后6周和6月分别是对照组的9.9倍（p<0.01）和12.7倍（p<0.01）。高眼压后RGCs的mtDNA修复酶OGG1、MYH和POLG在线粒体内表达下降,即使眼压恢复正常仍未见缓解。而mRNA表达却表现出与蛋白表达的不一致,眼压升高后迅速增多,随后逐渐下降,但OGG1和MYH始终未降至正常水平以下。高眼压后RGCs中线粒体复合物Ⅰ和Ⅲ的活性与对照组相比下降,其中复合物Ⅰ在6周、2、4、6月时下降36%,（p<0.05）、39%（p<0.05）、41%（p<0.05）和43%（p<0.05）；复合物Ⅲ下降更明显,第2周下降35%（p<0.05）,4月和6月时分别下降了56%（p<0.01）和62%（p<0.01）。术后6月时复合物Ⅰ和Ⅲ中由mtDNA编码的亚基cyt B和ND5的蛋白含量仍显着减少。RGCs内线粒体ATP生成率在眼压升高后出现一过性增高,是对照组的5.2倍（p<0.01）,随即下降,眼压恢复正常后仍未改善,至6个月实验结束时下降了48%,差异出现显着性（p<0.05）,表现为不可逆性减少。ROS在眼压升高后1周迅速升高,1周时达到峰值（为对照组1.6倍,p<0.05）。随后ROS含量快速下降直至正常。术后4个月和6个月时检测到ROS含量再次升高。结论：高眼压持续6周后,即使眼压恢复正常,RGCs及其轴突仍呈进行性丢失；高眼压后,RGCs线粒体DNA损伤和突变增加,且在眼压恢复正常后仍进行性、累积性加重,伴随mtDNA修复能力持续低下和线粒体功能不可逆性障碍。第二部分压力对线粒体DNA损伤及功能影响的体外研究目的：明确压力是否可以引起mtDNA的损伤和突变,探讨mtDNA突变和损伤与线粒体功能障碍的关系。方法：为在体外模拟慢性高眼压状态,本实验采用加压培养大鼠脑星形胶质细胞,压力设定为30mmHg。于加压后12、24、48、72、96和120小时收集细胞,利用long-extension PCR口随机突变捕获实验检测mtDNA的损伤和突变。Real-time PCR和westeren blot方法测定mtDNA修复酶OGG1、MYH和POLG的表达。DCF-DA方法检测ROS含量。Lent i-shPOLG转染星形胶质细胞诱导mtDNA损伤和突变的细胞模型,western blot检测由mtDNA编码的线粒体复合物Ⅰ和Ⅲ的亚基ND4、ND5.ND6和cyt B的蛋白含量。进而采用生化方法检测复合物Ⅰ和Ⅲ的活性、ATP生成率,JC-1荧光探针测定线粒体膜电位的变化。结果：加压24小时即可检测到mtDNA损伤增加,72小时较对照组增加>40%（p<0.05）。加压48小时后Taq11427位点突变增加,是对照组的2.2倍（p<0.05）,120小时达到5.1倍（p<0.001）。Taq18335位点突变增加趋势与Taq11427一致,120小时达到对照组的4.9倍（p<0.001）。加压后细胞ROS含量未见显着改变。OGG1、MYH和POLG的mRNA表达在加压后迅速升高,12小时达到峰值,分别是对照组的11.2倍（p<0.01）、6.3倍（p<0.05）和1.8倍（p<0.05）。随后OGG1、MYH逐渐恢复正常直至120小时,而POLG则持续下降至正常水平以下。线粒体内OGG1、MYH和POLG蛋白表达在加压后48小时开始下降,于72小时和120小时分别下降了56%（p<0.05）、60%（p<0.01）；38%（p<0.05）、63%（p<0.01）和39%（p<0.05）、37%（p<0.05）。细胞转染Lenti-shPOLG后5天和10天,mtDNA损伤较对照组分别增加了16%（p>0.05）和46%（p<0.01）.mtDNA编码的线粒体复合物亚基ND5、ND6和cyt B的蛋白表达显着下降,与对照组相比分别下降43%（p<0.05）、32%（p<0.05）和34%（p<0.05）。复合物Ⅰ和Ⅲ的活性在转染后10天时分别下降22.6%（p<0.05）和40.8%（p<0.05）,线粒体膜电位下降了63%（p<0.001）。转染后第9天ATP生成率是对照组的67.9%（p<0.05）,显着减少。结论：异常升高的压力可以直接导致mtDNA损伤和突变,一方面直接导致了线粒体功能障碍；另一方面,mtDNA损伤和突变又可造成线粒体膜电位下降,从而引起mtDNA修复酶表达下降,三者可形成恶性循环,最终使mtDNA损伤和突变进行性、累积性加重。第三部分mtDNA损伤和突变加重视网膜神经节细胞的易损性目的：通过建立RGCs mtDNA损伤和突变的动物模型,研究mtDNA损伤和突变增多后RGCs的凋亡情况,以及对青光眼常见损伤因素如眼压升高和谷氨酸浓度增加的敏感性。方法：设计三条shPOLG模版DNA,以pSilencer1.0-U6为载体构建shPOLG和对照质粒,real-time PCR和westernblot方法检测POLG的表达,筛选出抑制效率最佳的质粒并将其克隆到pAAV-CMV-GFP载体中,构建AAV2-shPOLG载体、扩增、纯化。Wistar大鼠玻璃体腔注射AAV2-shPOLG建立RGCs mtDNA损伤和突变模型。注射后2、6、12个月western blot检测RGCs中POLG蛋白表达、LX-PCR和mt突变随机捕获实验检测mtDNA损伤和突变,DCF-DA法检测ROS含量,明确建模是否成功。取注射后12个月的大鼠视网膜下注射谷氨酸或行巩膜上静脉烧灼手术（EVC）,1周后处死大鼠,进行视网膜TUNEL原位检测,Di工逆行标记RGCs后视网膜铺片计数存活RGCs数量。Western blot检测RGCs中裂解的caspase-3的含量,以明确RGCs的死亡是否属于凋亡。结果：AAV2-shPOLG玻璃体腔注射后2、6、12个月,mtDNA损伤较对照组增加21%、31%（p<0.01）和63%（p<0.01）,Taql1427位点突变率分别是对照组的6.5倍（p<0.001）、9.3倍（p<0.001）和17.1倍（p<0.001）。RGCs中ROS含量未见显着改变。TUNEL结果显示：rAAV2-shPOLG组中RGCs凋亡数量是对照组的2.3倍（p<0.05）；rAAV2-shPOLG联合EVC组和rAAV2-shPOLG联合谷氨酸组中RGCs凋亡数量分别较相应的对照组增加了21%（p<0.05）和35%（p<0.01）。裂解的caspase-3含量在rAAV2-shPOLG.rAAV2-shPOLG联合EVC和rAAV2-shPOLG联合谷氨酸组中分别增高了43%（p<0.05）、41%（p<0.05）和48%（p<0.05）。结论：线粒体DNA损伤和突变可以不依赖压力直接引起活体内RGCs凋亡；也使RGCs在受到眼压、谷氨酸损伤后的凋亡数量增加。
杜政德[8]（2012）在《D-半乳糖诱导大鼠内耳氧化性应激、线粒体损伤和凋亡及长期高脂饮食对D-半乳糖诱导的老化大鼠内耳的影响》文中提出第一部分D-半乳糖诱导大鼠内耳氧化性应激、线粒体损伤和凋亡目的：线粒体DNA （mitochondrial DNA,mtDNA）的氧化性损伤和凋亡是老化的重要特征。我们之前利用连续8周注射D-半乳糖（D-galactose, D-gal）的方法建立了大鼠老化模型,并且发现在D-gal诱导的老化大鼠内耳中氧化性应激的增加和mtDNA常见缺失（common deletion, CD）的增加。但是,在D-gal诱导的老化大鼠内耳中,目前没有直接的证据表明mtDNA CD的累积是由氧化性损伤引起的；同时此模型内耳中活性氧（reactive oxygen species, ROS）的来源以及凋亡情况仍不清楚。方法：听力正常,无中耳疾患的40只5周龄雄性Spragua-Dawley大鼠随机分成2组（各20只）：①D-半乳糖组（D-gal group）:每日颈背部皮下注射D-gal （500mg/kg）,连续8周；②对照组（control group）:每日颈背部皮下注射同体积的生理盐水,连续8周。听性脑干反应（auditory brainstem response, ABR）检测每组大鼠听功能。比色法检测大鼠血清H202,总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase, T-SOD）活性以及丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量。实时定量PCR检测大鼠内耳mtDNA CD的累积以及NADPH氧化酶3（NOX3）和P22phox]mRNA水平的变化。透射电子显微镜检术（Transmission Electron Microscopy, TEM）观察大鼠内耳组织细胞中线粒体超微结构的改变。免疫组织化学法检测大鼠耳蜗8-羟基-2-脱氧鸟苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHdG）以及NOX3和P22phox蛋白水平的变化。免疫印迹法检测大鼠内耳组织中激活型caspase-3（cleaved caspase-3）的表达。原位末端转移酶标记(terminal deoxynucleotidyl transferase （TdT）-mediated deoxyuridine triphosphate （dUTP） nick-end-labelling, TUNEL染色检测大鼠耳蜗细胞凋亡发生的情况。结果：D-半乳糖组大鼠血清H202和MDA含量比对照组明显增加,T-SOD水平比对照组明显降低,差异有统计学意义（P<0.01）。D-半乳糖组大鼠内耳组织中mtDNACD累积比对照组明显增加,差异有统计学意义（P<0.01）。TEM发现D-半乳糖组大鼠耳蜗组织细胞中线粒体表现为基质密度降低,甚至发生严重变性。D-半乳糖组大鼠耳蜗组织中8-OHdG、NOX3、P22phox和cleaved caspase-3的表达比对照组明显升高,差异有统计学意义（P<0.01）。TUNEL染色发现少量凋亡细胞局限于D-半乳糖组大鼠耳蜗血管纹,而对照组大鼠耳蜗未发现凋亡细胞。两组大鼠ABR阈值差异无统计学意义（P>0.05）。结论：在内耳老化过程中mtDNACD的积累可能是NADPH氧化酶相关的氧化性应激造成的,并且caspase-3介导的细胞凋亡可能参与了内耳的老化过程。第二部分长期高脂饮食加重D-半乳糖诱导的老化大鼠内耳氧化性应激,线粒体损伤和凋亡目的：研究12个月的高脂饮食对Sprague-Dawley大鼠内耳及D-半乳糖诱导的老化大鼠内耳的老化过程的作用。方法：104只5周龄雄性Spragua-Dawley大鼠随机分成4组（各26只）：①对照组（control group）:饲喂基础饮食12个月,前8周每日颈背部皮下注射和D-半乳糖组同体积的生理盐水；②D-半乳糖组（D-gal group）:饲喂基础饮食12个月,前8周每日颈背部皮下注射D-gal （500mg/kg）;③高脂饮食组（HFD group）:饲喂高脂饮食12个月,前8周每日颈背部皮下注射和D-半乳糖组同体积的生理盐水；④D-半乳糖+高脂饮食组（D-gal+HFD group）:饲喂高脂饮食12个月,前8周每日颈背部皮下注射D-gal （500mg/kg）。造模结束后,听性脑干反应（auditory brainstem response, ABR）检测每组大鼠听功能；每组大鼠称重,比色法检测大鼠血清甘油三脂（triglycerides,TG）,总胆固醇（total cholesterol, TC）,游离脂肪酸（nonesterified fatty acids, NEFA）和H202含量；实时定量PCR检测大鼠内耳mtDNACD的累积以及NADPH氧化酶3（NOX3）, P22phox, uncoupling protein2（UCP2）和uncoupling protein3（UCP3） mRNA水平的变化；免疫组织化学法检测大鼠耳蜗NOX3蛋白水平的表达；免疫印迹法检测大鼠内耳组织中NOX3,P22phox,UCP2,UCP3和激活型caspase-3（cleaved caspase-3）的蛋白水平的表达；透射电子显微镜检术（Transmission Electron Microscopy, TEM）观察大鼠耳蜗血管纹边缘细胞线粒体超微结构的改变；原位末端转移酶标记(terminal deoxynucleotidyl transferase （TdT）-mediated deoxyuridine triphosphate （dUTP） nick-end-labelling, TUNEL染色检测大鼠耳蜗细胞凋亡情况。结果：D-半乳糖组和D-半乳糖+高脂饮食组大鼠ABR阈值在4,8,16和32kHz比对照组升高,差异有统计学意义（P<0.05）；高脂饮食组大鼠ABR阈值数值上在上述4个频率均比对照组升高,但仅在32kHz差异有统计学意义（P<0.05）；同时,D-半乳糖+高脂饮食组大鼠ABR阈值在16和32kHz比D-半乳糖组升高,差异有统计学意义（P<0.05）。高脂饮食组和D-半乳糖+高脂饮食组大鼠血清TG、TC和NEFA水平比对照组和D-半乳糖组升高,差异有统计学意义（P<0.01）；D-半乳糖组、高脂饮食组和D-半乳糖+高脂饮食组大鼠血清H202水平比对照组升高,差异有统计学意义（P<0.01）,其中D-半乳糖+高脂饮食组大鼠血清H202水平最高,差异有统计学意义（P<0.01）。D-半乳糖组、高脂饮食组和D-半乳糖+高脂饮食组大鼠内耳组织NOX3、P22phox、UCP2、UCP3和cleaved caspase-3的表达比对照组升高,其中D-半乳糖+高脂饮食组最高,差异有统计学意义（P<0.01）。D-半乳糖组、高脂饮食组和D-半乳糖+高脂饮食组大鼠内耳组织mtDNA CD的累积比对照组增加,差异有统计学意义（P<0.05）。D-半乳糖组、高脂饮食组和D-半乳糖+高脂饮食组大鼠耳蜗血管纹边缘细胞线粒体有不同程度的肿胀,伴有线粒体基质密度降低。TUNEL染色发现D-半乳糖组、高脂饮食组和D-半乳糖+高脂饮食组凋亡细胞比对照组明显增多,且凋亡细胞主要局限于血管纹；同时,在D-半乳糖+高脂饮食组大鼠耳蜗Corti器发现少量凋亡细胞。结论：长期高脂饮食可诱导内耳氧化性应激、线粒体损伤和凋亡。长期高脂饮食可加速年龄相关性听力损失的进展。
范姜砾[9]（2012）在《氧化应激在年龄相关性黄斑变性中的作用》文中研究指明年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）是一种严重损害老年人视力的进行性疾病，通常双眼先后发病，多发生于50岁以上老年人。主要表现为视物变形、中心暗点、对比度下降以及视野缩小等，早期眼底多表现为色素紊乱和玻璃膜疣生成，一般不引起视力变化；晚期眼底新生血管生成，引起视力下降。迄今为止，关于AMD发病机制进行了大量的基础以及临床研究，但发病机制并不十分清楚，多数情况下认为其是一种多因素疾病，受到环境、个体因素等多方面影响，同时与基因相关，因此也缺乏有效治疗方法。近年来，关于氧化应激在AMD发病过程中的作用日益研究深入。氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（reactive nitrogenspecies，RNS）产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。正常情况下机体内活性氧的产生和清除处于动态平衡状态，对机体无有害影响。而多种内源性及外源性有害刺激可以打破这种平衡，致活性氧大量生成，超过抗氧化系统的清除能力，机体即形成氧化应激状态，引起DNA氧化损伤和蛋白质的表达异常，产生细胞毒效应并最终对机体造成不可逆损害。细胞凋亡在机体生长发育和衰老等许多病理生理过程中起重要作用。触发凋亡的因素包括衰老、病毒感染和氧化性损伤等。研究发现，活性氧所致的氧化应激是造成细胞凋亡的重要环节。视网膜光感受器外节膜盘富含多不饱和脂肪酸，极易受到氧化损伤的攻击，而后启动细胞溶解链发生。AMD早期，视网膜色素上皮（retinal pigmentepithelium，RPE）细胞随年龄增长负担加重，RPE吞噬溶酶体过程中发生光感受器碎片酶的降解，降解物为未完全消化的不能溶解聚集物形式，称作脂质，脂质由不同分子混合而成，包括视网膜诱导复合物，其中一些具有光诱导性质，可增强氧化应激损伤，脂质堆积在细胞内，干扰RPE细胞的代谢，造成代谢产物堆积于Bruch膜上，导致氧弥散障碍，诱发新生血管；而脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）主要由RPE产生，参与RPE与脉络膜毛细血管之间的旁分泌信号转导。RPE位于神经视网膜和脉络膜之间，通过提供营养和代谢废物来滋养视网膜，成为血视网膜屏障的外层，控制着视网膜下间隙的化学成分，其顶面细胞膜与细胞外基质相连，在早期胚胎发育过程中，RPE自发转分化为神经视网膜组织，在其邻近的光感受器发育和维持中起重要作用，光照条件下RPE可产生大量活性氧。视网膜本身具有对抗氧化应激损伤机制，可有效中和ROS损伤。抗氧化酶在此过程中发挥重要作用，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH）和谷胱甘肽转硫酶（glutathione S-transferase, GST）等。基于以上研究，本实验收集AMD患者临床血液标本，进行体内抗氧化酶水平的检测，同时，在细胞水平利用H2O2模拟体内氧化应激状态，研究抗氧化酶水平的表达变化情况，观察H2O2对RPE细胞损伤程度的影响，分析RPE细胞相关保护作用，并对其可能机制进行了初步探讨。其主要结果如下：一AMD患者血浆内抗氧化酶变化：AMD患者组GST水平（76.96U/L）显着高于对照组（62.74U/L），而GSH水平（61.38mgGSH/L）低于对照组（81.33mgGSH/L）；SOD在AMD患者组和正常对照组水平分别为64.47U/L和62.53U/L。两组相比GST和GSH活力具有统计学意义（Z=﹣2.082，P=0.037；Z=﹣2.900，P=0.004），两组间SOD水平差异无统计学意义（Z=﹣0.090，P=0.725）。低水平的GSH是AMD患病危险因素。AMD患者血浆中GST水平升高，提示AMD患者处于氧化应激状态，GSH水平降低使AMD患者更易受到氧化应激损伤的攻击。二氧化应激状态下RPE形态学变化：荧光显微镜下正常RPE细胞核呈均匀弥散荧光。经过H2O2处理后，可观察到RPE细胞膜完整，细胞核浓聚深染，核内荧光致密，由匀质状态固缩成高凝集的点状结构，出现典型的凋亡形态。经过Vit C预处理的RPE细胞，再经H2O2刺激24h后，核固缩数目减少，染色质边聚和核碎片减少。三RPE细胞活力变化：不同浓度H2O2预处理RPE细胞24h后，细胞活性明显下降，其中，400μmol/L以上浓度H2O2刺激后细胞活力与对照组相比具有统计学意义（P＜0.05）；不同浓度Vit C处理RPE细胞后24h，细胞活力明显增加，各浓度组与对照组相比均具有统计学意义（P＜0.05）；不同浓度VitC预处理RPE细胞4h后，用单浓度H2O2继续处理RPE细胞24h，与对照组相比，经过150μmol/L以上浓度Vit C处理的细胞其活性较未处理细胞活性明显升高，具有统计学意义（P＜0.05）；经单浓度Vit C处理RPE细胞4h后，再对RPE细胞行不同浓度H2O2刺激24h，与对照组相比，经过不同浓度Vit C处理的RPE细胞活性升高明显。四氧化应激状态下RPE细胞内抗氧化酶水平变化：H2O2预处理RPE细胞24h后，胞内SOD、GST和GSH水平均下降；维生素C（vitamine C,Vit C）处理RPE细胞后胞内SOD、GST和GSH水平均升高；经Vit C预处理后再接受H2O2刺激的RPE细胞胞内SOD、GST和GSH水平相较单纯H2O2刺激后水平升高。五Vit C保护作用机制：Western blot结果显示，Vit C和H2O2处理细胞后显着增加了phospho-ERK1/ERK2水平，而PD98059（ERK1/ERK2抑制剂）则抑制phospho-ERK1/ERK2的上调。细胞活力检测结果显示PD98059明显抑制了Vit C保护RPE细胞免受H2O2刺激的能力，说明Vit C通过phospho-ERK1/ERK2通路对RPE细胞起保护作用。总之，通过本实验研究证明，AMD患者血浆中抗氧化酶GST水平升高，患者处于氧化应激状态，GSH水平降低，降低的GSH水平使AMD患者更易于受到氧化应激损伤攻击，低水平的GSH是AMD发病的危险因素；细胞水平证实氧化应激状态下胞内三种抗氧化酶活性均下降，经过氧化剂Vit C处理的细胞其胞内抗氧化酶活性升高，可有效保护RPE细胞免受氧化应激损伤引起的凋亡。同时，GSH活力在血浆中降低而在RPE细胞胞内升高，推测在氧化应激状态下，GSH仅在眼局部发挥作用，这一结果需要更多大量的研究来证实。在上述实验研究的基础上，进一步的研究重点在于更多样本量的观察研究，包括寻找其可能的保护机制及原因，为临床治疗AMD提供新的方法与方向。
陈霞[10]（2011）在《衰老机制的中西医研究进展及延缓衰老的途径》文中指出目的：本文通过对古今中外关于人体衰老相关学说和抗衰老的文献的研究,从理论上探讨、研究了衰老的机制和延缓衰老的方法,为衰老机理的进一步研究提供借鉴,为延缓衰老的临床和实验研究提供理论支持,旨在提高老年人群的生活质量,促进社会更健康、和谐的发展。方法：本研究在认真查阅和研读古籍《黄帝内经》的基础上,再利用中国知网CNKI,对衰老的机理和延缓衰老的方法进行检索,分别以“衰老”、“机理”、“抗衰老”为关键词,对数据库中近十年（2000-2010年）的文献进行检索,人工整理,将出现频率≥3次的纳入本文,进行总结、归纳,并从各个角度对中西医衰老学说之间的异同点进行对比和分析,对中医和西医延缓衰老的方法进行归纳和对比分析。结果：人体衰老过程是人体内部环境各因素间、人体与外环境各因素间在生命活动的过程中不断相互作用、相互影响的综合性结果。其普遍性、内因性、积累性、进行性及有害性是目前较为公认的特点。目前对于衰老机制的研究正处于百家争鸣、百花齐放的时期,且中西医各有所长。目前关于衰老的主要中医学说有几十种,本文列举了十种有代表性的中医学说。关于衰老的现代医学假说共有上百种,本文列举了二十一种具有代表性的现代医学假说,并将其分为四个层次：整体水平的衰老学说、器官水平的衰老学说、细胞水平的衰老学说、分子水平的衰老学说。在延缓衰老方面,中西医各有优势,中医优于西医,中医秉承了《内经》“治未病”的思想,从整体观念出发,讲究辨证论治,以其安全、经济、有效等优势在防治老年病、慢性疾病和延缓衰老方面有其独到之处,尤其是一些非药物疗法如针灸、气功、导引等,简单易行,安全经济,深受中老年人的喜爱。
二、老年性黄斑变性线粒体DNA3243点突变分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、老年性黄斑变性线粒体DNA3243点突变分析（论文提纲范文）
（1）线粒体损伤在眼科相关疾病中的研究进展（论文提纲范文）
| 1 遗传性眼病与线粒体基因突变 |
| 1.1 视神经病变 |
| 1.2 黄斑营养不良 |
| 1.3 慢性进行性眼外肌麻痹 |
| 2 非遗传性眼病与线粒体损伤 |
| 2.1 白内障 |
| 2.2 青光眼 |
| 2.3 老年性黄斑变性 |
| 2.4 糖尿病性视网膜病变 |
| 3 小结 |
（2）老年性耳聋患者毛干细胞色素c氧化酶亚基表达与酶活性研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 病例收集 |
| 1.2 主要试剂及仪器设备 |
| 1.3 部分引物序列 |
| 1.4 主要溶液的配置 |
| 2.方法及实验步骤 |
| 2.1 检测毛干组织线粒体DNA片段缺失 |
| 2.1.1 毛干线粒体DNA的提取及检测线粒体DNA浓度 |
| 2.1.2 普通PCR |
| 2.1.3 1%琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.1.4 PCR产物纯化回收 |
| 2.1.5 DNA测序鉴定线粒体DNA缺失片段 |
| 2.1.6 实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测毛干组织中线粒体DNA片段缺失程度 |
| 2.2 检测毛干组织细胞色素c氧化酶三个亚基(COⅪ、COⅫ、COⅩⅢ)mRNA转录水平 |
| 2.2.1 毛干组织线粒体RNA提取及检测线粒体DNA浓度 |
| 2.2.2 逆转录PCR |
| 2.2.3 实时荧光定量PCR (Q-PCR)检测毛干组织中细胞色素c氧化酶三个亚基基因表达水平 |
| 2.3 统计学处理方法 |
| 结果 |
| 3.1 毛干组织线粒体DNA片段缺失结果 |
| 3.1.1 毛干组织线粒体DNA浓度及纯度测定结果 |
| 3.1.2 PCR验证毛干组织中线粒体DNA提取是否成功 |
| 3.1.3 DNA测序鉴定线粒体DNA突变缺失片段 |
| 3.1.4 实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测毛干中线粒体DNA片段突变缺失程度 |
| 3.2 检测毛干组织细胞色素c氧化酶三个亚基(COⅪ、COⅫ、COⅩⅢ)mRNA转录水平结果 |
| 3.2.1 毛干组织总RNA浓度及纯度测定结果 |
| 3.2.2 实时荧光定量PCR (Q-PCR)检测毛干中细胞色素c氧化酶三个亚基基因表达水平 |
| 3.2.2.1 细胞色素c氧化酶三个亚基基因扩增曲线和溶解曲线 |
| 3.2.2.2 细胞色素c氧化酶三个亚基基因相对表达量 |
| 3.2.3 统计学结果分析 |
| 讨论 |
| 4.1 毛干线粒体突变与老年性耳聋 |
| 4.2. 毛干细胞色素C氧化酶COX与老年性耳聋 |
| 4.3 可能存在的问题 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（3）线粒体遗传糖尿病伴耳聋的研究进展（论文提纲范文）
| 1 线粒体糖尿病伴耳聋 |
| 2 基因突变位点 |
| 3 诊断 |
| 4 治疗 |
| 4.1 药物治疗 |
| 4.2 基因治疗 |
| 5 MIDD与感音神经性耳聋 |
| 5.1 发病机制 |
| 5.2 MIDD听力损失的表现 |
| 5.3 MIDD患者的听力重建 |
| 6 总结 |
（4）NLGN3对H2O2诱导的视网膜细胞损伤的保护作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 科学问题的提出和研究意义 |
| 第一部分 NLGN3对由H_2O_2诱导的人RPE细胞和RGCs细胞损伤的保护作用 |
| 实验材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 NLGN3对由H_2O_2诱导的人RPE细胞和RGCs细胞损伤的保护作用机制研究 |
| 实验材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本文的创新之处和不足之处 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述1 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 承担课题和发表文章情况 |
| 致谢 |
（5）应用病人来源iPSC诱导的神经元细胞对神经变性疾病中线粒体变化机制的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| A (p.G355D)突变导致的ATP酶活性变化'>第一部分 家系特征,突变鉴定以及致病基因c.1064G>A (p.G355D)突变导致的ATP酶活性变化 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第二部分 过表达质粒构建以及过表达突变型质粒对线粒体形态的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三部分 病人特异性成纤维细胞模型中线粒体异常及自噬调节 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四部分 病人特异性多功能干细胞诱导神经元细胞模型中线粒体异常及分子蛋白表达 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 全文讨论与总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（6）携线粒体DNA A1555G突变的聋病患者特异性iPS细胞系的建立与鉴定（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 线粒体疾病 |
| 3 线粒体聋病 |
| 3.1 聋病的致病因素 |
| 3.2 与非综合征性耳聋相关的线粒体12S rRNA基因突变 |
| 3.3 氨基糖苷类药物性耳聋与线粒体12S rRNA基因A1555G突变 |
| 3.4 线粒体单体型对mtDNA突变致聋的影响 |
| 4 患者特异性iPS细胞模型 |
| 4.1 iPS细胞 |
| 4.2 患者特异性iPS细胞 |
| 4.3 患者特异性iPS细胞作为疾病模型的优势 |
| 4.4 患者特异性iPS细胞在线粒体疾病研究中的应用 |
| 5 总结 |
| 第二章 实验研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 组织标本和细胞 |
| 2.2 质粒 |
| 2.3 实验试剂及配置 |
| 2.3.1 细胞培养液配置 |
| 2.3.2 实验试剂配制 |
| 2.3.3 实验试剂 |
| 2.4 试剂盒 |
| 2.5 实验仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 尿液细胞的收集和分离 |
| 3.1.1 尿液样本的采集 |
| 3.1.2 尿液细胞的分离 |
| 3.1.3 尿液细胞的传代 |
| 3.1.4 尿液细胞的冻存 |
| 3.2 CF-1孕鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备 |
| 3.2.1 CF-1孕鼠胚胎成纤维细胞的分离 |
| 3.2.2 细胞的冻存 |
| 3.2.3 饲养层细胞的制备 |
| 3.3 逆转录病毒的包装和感染 |
| 3.3.1 pMX逆转录病毒载体质粒的转化和抽提 |
| 3.3.2 逆转录病毒的包装 |
| 3.3.3 病毒的收集和感染 |
| 3.3.4 感染后细胞的接种 |
| 3.4 iPS细胞克隆的挑取、维护与培养 |
| 3.4.1 iPS单克隆的挑取 |
| 3.4.2 iPS细胞的有饲养层培养 |
| 3.4.2.1 iPS细胞的传代 |
| 3.4.2.2 iPS细胞的维护 |
| 3.4.2.3 iPS细胞的冻存 |
| 3.4.2.4 iPS细胞的复苏 |
| 3.4.3 iPS细胞的无饲养层培养 |
| 3.4.3.1 iPS细胞的传代 |
| 3.4.3.2 iPS细胞的维护 |
| 3.4.3.3 iPS细胞的冻存 |
| 3.4.3.4 iPS细胞的复苏 |
| 3.5 iPS细胞的生物学鉴定 |
| 3.5.1 碱性磷酸酶检测(AP染色) |
| 3.5.2 免疫荧光检测 |
| 3.5.3 内源多能性基因和外源编程基因相对表达量的检测 |
| 3.5.3.1 细胞收集 |
| 3.5.3.2 RNA提取 |
| 3.5.3.3 反转录 |
| 3.5.3.4 荧光定量PCR检测 |
| 3.5.4 外源编程基因的插入鉴定 |
| 3.5.4.1 DNA提取 |
| 3.5.4.2 PCR反应 |
| 3.5.4.3 1%琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.5.5 iPS细胞的核型分析 |
| 3.5.6 多能性基因(Oct4、Nanog)启动子的甲基化水平检测 |
| 3.5.6.1 DNA提取 |
| 3.5.6.2 DNA样品处理 |
| 3.5.6.3 启动子区域的PCR扩增 |
| 3.5.6.4 PCR产物的胶回收 |
| 3.5.6.5 T载体的连接与转化 |
| 3.5.6.6 挑菌与菌落PCR |
| 3.5.6.7 数据处理 |
| 3.5.7 体外分化拟胚体 |
| 3.5.7.1 拟胚体的培养 |
| 3.5.7.2 多能性基因的表达检测 |
| 3.5.8 体内分化畸胎瘤 |
| 3.5.9 线粒体DNA A1555G突变的鉴定 |
| 3.5.9.1 DNA提取(TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit) |
| 3.5.10 线粒体结构的透射电子显微镜观察 |
| 4 实验结果与分析 |
| 4.1 临床资料 |
| 4.2 尿液细胞的收集、分离及培养 |
| 4.3 CF-1小鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备 |
| 4.4 病毒的包装、收集和滴度测定 |
| 4.5 尿液细胞的逆转录病毒感染 |
| 4.6 iPS克隆的形成 |
| 4.7 iPS细胞的培养 |
| 4.8 碱性磷酸酶染色(AP染色) |
| 4.9 免疫荧光检测结果与分析 |
| 4.10 内源多能性基因的表达与分析 |
| 4.11 外源编程基因沉默的表达与分析 |
| 4.12 外源编程基因的插入鉴定 |
| 4.13 多能性基因(Oct-4,Nanog)启动子的甲基化水平检测 |
| 4.14 核型分析 |
| 4.15 体外分化拟胚体 |
| 4.16 拟胚体中三胚层标记基因的表达 |
| 4.17 体内分化畸胎瘤 |
| 4.18 畸胎瘤组织的切片观察 |
| 4.19 线粒体DNA A1555G突变的分析 |
| 4.20 线粒体结果的透射电子显微镜观察 |
| 5 讨论 |
| 5.1 建立mtDNA A1555G突变导致的耳聋患者特异性iPS细胞系的意义 |
| 5.2 利用尿液细胞作为原代细胞进行重编程的优势 |
| 5.3 患者特异性iPS细胞作为疾病模型面临的挑战 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（7）慢性高眼压视网膜神经节细胞进行性死亡的线粒体机制（论文提纲范文）
| 目录 |
| 缩略语及符号 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 慢性高眼压视网膜神经节细胞mtDNA及线粒体功能变化 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 压力对线粒体DNA损伤及功能影响的体外研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 mtDNA损伤和突变对视网膜神经节细胞易损性影响的研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 相关文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）D-半乳糖诱导大鼠内耳氧化性应激、线粒体损伤和凋亡及长期高脂饮食对D-半乳糖诱导的老化大鼠内耳的影响（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 D-半乳糖诱导大鼠内耳氧化性应激、线粒体损伤和凋亡 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 长期高脂饮食加重D-半乳糖诱导的老化大鼠内耳氧化性应激,线粒体损伤和凋亡 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 攻读博士期间参与课题 |
| 致谢 |
（9）氧化应激在年龄相关性黄斑变性中的作用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 年龄相关性黄斑变性 |
| 2.AMD 发病机制研究 |
| 3 氧化应激学说 |
| 4 AMD 和氧化应激 |
| 5 抗氧化酶与 AMD |
| 6 补充抗氧化剂治疗 |
| 实验一 湿性年龄相关性黄斑变性患者血浆中相关抗氧化酶水平测定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验二 氧化应激状态下RPE细胞中相关抗氧化酶表达变化及其作用机制初探 |
| 1. 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（10）衰老机制的中西医研究进展及延缓衰老的途径（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 祖国医学对衰老的研究 |
| 1.1 祖国医学对于影响衰老的主要因素的研究 |
| 1.2 祖国医学对于衰老机制的认识 |
| 1.3 祖国医学延缓衰老的原则 |
| 1.4 祖国医学延缓衰老的方法 |
| 1.5 小结与分析 |
| 2 现代医学对衰老的研究 |
| 2.1 现代医学对衰老机制的研究 |
| 2.2 衰老的生物学标志 |
| 2.3 衰老的实验模型 |
| 2.4 现代具有前景的延衰方法 |
| 2.5 小结与分析 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 中医衰老说之我见 |
| 3.2 现代医学衰老说之我见 |
| 3.3 中西医衰老学说的比较 |
| 3.4 中西医延缓衰老方法的比较 |
| 3.5 中医延缓衰老的优势 |
| 3.6 不足与展望 |
| 5 结论 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、老年性黄斑变性线粒体DNA3243点突变分析（论文参考文献）
- [1]线粒体损伤在眼科相关疾病中的研究进展[J]. 胡艳滨,苏九妹,高军. 医学理论与实践, 2021(06)
- [2]老年性耳聋患者毛干细胞色素c氧化酶亚基表达与酶活性研究[D]. 牛红思. 昆明医科大学, 2020(02)
- [3]线粒体遗传糖尿病伴耳聋的研究进展[J]. 刘怡陶,李永新. 中国听力语言康复科学杂志, 2019(06)
- [4]NLGN3对H2O2诱导的视网膜细胞损伤的保护作用和机制研究[D]. 李秀苗. 南京医科大学, 2018(11)
- [5]应用病人来源iPSC诱导的神经元细胞对神经变性疾病中线粒体变化机制的研究[D]. 阳洋. 浙江大学, 2017(08)
- [6]携线粒体DNA A1555G突变的聋病患者特异性iPS细胞系的建立与鉴定[D]. 张瑄. 浙江大学, 2014(02)
- [7]慢性高眼压视网膜神经节细胞进行性死亡的线粒体机制[D]. 吴继红. 复旦大学, 2013(03)
- [8]D-半乳糖诱导大鼠内耳氧化性应激、线粒体损伤和凋亡及长期高脂饮食对D-半乳糖诱导的老化大鼠内耳的影响[D]. 杜政德. 华中科技大学, 2012(05)
- [9]氧化应激在年龄相关性黄斑变性中的作用[D]. 范姜砾. 第四军医大学, 2012(02)
- [10]衰老机制的中西医研究进展及延缓衰老的途径[D]. 陈霞. 南京中医药大学, 2011(04)