一、ZNF191 mRNA在卵巢恶性肿瘤中的表达及临床意义（论文文献综述）
余江涛[1]（2021）在《NUPR1在卵巢癌发生发展中的作用及分子机制研究》文中提出研究背景在妇科恶性肿瘤中,卵巢癌（ovariancancer,OC）是死亡率较高的肿瘤之一。来自美国国家癌症研究所（National Cancer Institute,NCI）的统计报告推测,在2020年美国卵巢癌的新发病例为21750例,占所有新发癌症病例的1.2%,死亡病例为13940例,占所有癌症死亡病例的2.3%。卵巢癌经常发生在55～64岁的女性,确诊时中位年龄为63岁,在首诊或确诊时超过3/4的卵巢癌患者已属晚期（Ⅲ～Ⅳ期）。截至目前为止,卵巢癌的治疗主要是以手术联合铂类和（或）紫杉醇类化疗为主的综合治疗。尽管手术和化疗取得了许多进展,但是由于多数患者在诊断时已属于晚期加之后期的化疗耐药,自上世纪80年代以来,卵巢癌患者的5年总的生存率基本上没有大的变化。根据SEER最新公布的预测数据（2010～2016 年,https://seer.cancer.gov/statfacts/html/ovary.html）,目前在美国卵巢癌患者5年的生存率约为48.6%。因此,寻找潜在的生物标志物和治疗靶点对卵巢癌患者的早期筛查和改善卵巢癌患者的预后具有非常重要的意义。Iovanna等在20年前发现急性胰腺炎可以诱导过表达的NUPR1。人类NUPR1基因可以产生两种蛋白,分别是由100个氨基酸组成的NUPRla,对于此种蛋白目前尚无相关文献报道,另一种是NUPRlb,它是由82个氨基酸多肽组成的小分子核蛋白,其分子量为8872.7 Da,故又被称为P8。后来Ree等通过对裸鼠中乳腺癌细胞转移到脑组织的cDNA分析发现了com1（candidate of metastasis-1）,它是一种帮助癌细胞转移的候选分子,Coker随后发现com1与P8的蛋白完全一样,并通过基因测序发现com1和P8是一个分子,后来统一称为NUPR1。NUPR1与许多刺激相关,许多因素能够导致NUPR1分子的过表达,如内皮素、血管紧张素、肿瘤坏死因子α、脱髓鞘剂、脂多糖（LPS）、CCL4和大麻素等。NUPR1也参与了多种应急相关的功能,研究发现NUPR1在许多良、恶性疾病中异常表达,如急性胰腺炎、心衰、糖尿病系膜细胞肥大、乳腺癌、脑瘤和脑转移瘤、甲状腺肿瘤和垂体瘤等。然而有一项关于胰腺癌的研究发现,NUPR1在大多数胰腺癌标本中过度表达,而另一项研究认为NUPR1是胰腺癌细胞的细胞内生长的抑制因素,对于这两种看似矛盾的结论,一种合理的解释是,一项研究是在体内进行的,另一项研究是在体外进行的,不同的体内外肿瘤微环境导致了 NUPR1的不同生物学功能。NUPR1也在许多恶性肿瘤中表现出抑癌的功能,如在前列腺癌中的研究表明,NUPR1的表达与肿瘤的侵袭和进展负相关。所以NUPR1的复杂的功能可能依赖于不同的肿瘤微环境,在不同的肿瘤微环境中的作用可以完全不同甚至截然相反。总之,NUPR1是一个具有多种生理和生物学功能的复杂分子,它在各种良、恶性肿瘤中的作用不同。可能是一种新型的靶向药物基因,干预NUPR1可以阻止癌症的进展和转移,目前NUPR1在卵巢癌中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨NUPR1在卵巢癌发生发展中的作用及分子机制,为NUPR1的靶向治疗提供依据。具体研究内容包括以下三部分:第一部分:NUPR1蛋白在卵巢癌组织中的表达及其对患者生存率的影响研究目的:检测NUPR1蛋白在卵巢癌组织中的表达,以及其表达量与卵巢癌患者的临床病理因素、总的生存率和无复发生存期的相关性。材料与方法1.研究材料:卵巢癌组织芯片的资料:卵巢癌组织芯片总病例数为154例,其中转移灶13例,良性肿瘤或癌旁组织4例,其余137例为原发灶,剔除脱片、切片等原因引起的6例缺陷原发灶病例,后续共纳入分析的卵巢癌病例为131例,采集其临床病理资料,包括NUPR1蛋白的表达量、患者年龄,TNM分期,病理分级,病理类型,最大肿瘤大小,Ki67的表达等进行分析,第一种病理分型分组:非浆液性腺癌组和浆液性腺癌组;第二种病理分型分组:I型（低级别浆液性癌/子宫内膜样癌/透明细胞癌/黏液癌等）和I型（高级别浆液性癌/肉瘤/未分化癌等）;2.研究方法:2.1.免疫组织化学检测卵巢癌组织中NUPR1蛋白的表达应用免疫组织化学染色后染色强度和染色阳性率进行综合判断,分为NUPR1低表达组和NUPR1高表达组;2.2.NUPR1蛋白的表达量和卵巢癌患者临床病理特征的相关性分析应用卡方检验检测NUPR1蛋白的表达量和卵巢癌患者临床病理特征的相关性,应用t-test比较其在卵巢癌原发灶组织、癌转移灶组织、良性肿瘤或者癌旁组织中的差异性表达;2.3.NUPR1蛋白的表达量和卵巢癌患者生存率的相关性分析应用Kaplan-Meier法及Log-Rank统计方法分析,根据卵巢癌患者的随访资料及免疫组化染色结果来分析NUPR1蛋白的表达量与卵巢癌患者总的生存率和无复发生存期的相关性。根据单因素分析和COX多因素回归分析,分析卵巢癌患者总的生存率和无复发生存期相关的预后因素。研究结果:1.NUPR1蛋白在卵巢良性肿瘤或者癌旁组织、卵巢癌原发灶组织、卵巢癌转移灶组织中的表达及意义:应用t-test检测NUPR1蛋白在卵巢良性肿瘤或者癌旁组织、卵巢癌原发灶组织、卵巢癌转移灶组织中的表达,结果显示NUPR1蛋白在癌原发灶和转移灶中的表达高于良性肿瘤或者癌旁组织,差异有统计学意义（P值均<0.05）,表明NUPR1可能与卵巢癌的发生发展有关;2.NUPR1蛋白在卵巢癌组织中的表达量与卵巢癌患者临床病理特征的相关性:应用卡方检验检测NUPR1蛋白在卵巢癌患者组织中的的表达量和临床病理特征的相关性,结果显示NUPR1蛋白的表达量与患者年龄（P=0.167）、病理分级（P=0.163）无明显相关性,与TNM分期（P=0.031）、病理类型1（浆液性和非浆液性）（P<0.001）、病理类型2（Ⅰ型和Ⅱ型）（P=0.016）、Ki67的表达（P=0.001）及最大肿瘤大小（P=0.008）有明显的相关性,差异均具有统计学意义。表明NUPR1蛋白在TNM分期Ⅲ/Ⅳ期、浆液性腺癌、Ⅱ型卵巢癌、Ki67阳性表达、最大肿瘤大小>12cm的患者中的阳性表达占比分别高于TNM分期Ⅰ/Ⅱ期、非浆液性腺癌、Ⅰ型卵巢癌、Ki67阴性表达,最大肿瘤大小<12cm的患者;3.NUPR1蛋白的表达量与卵巢癌患者总的生存率和无复发生存期的相关性:应用Kaplan-Meier法及Log-Rank统计方法分析发现NUPR1蛋白在卵巢癌患者组织中的表达量与总的生存率和无复发生存期呈负相关,差异均有统计学意义（P值均<0.001）,NUPR1蛋白表达量越高,其总的生存率越低,无复发生存期越短,NUPR1蛋白表达量越低,其总的生存率越高,无复发生存期越长,表明高表达的NUPR1与卵巢癌的不良预后有关;4.NUPR1蛋白在卵巢癌组织中的表达量与卵巢癌患者的总的生存率和无复发生存期的相关预后因素分析:应用单因素及多因素回归分析发现,NUPR1蛋白在卵巢癌组织中的表达量、TNM分期和最大肿瘤大小是总的生存率的独立预后因素,差异有统计学意义（P值分别为<0.001,<0.001和=0.026）,NUPR1蛋白的表达量越高、TNM分期越晚（Ⅲ/Ⅳ期）、最大肿瘤大小越大（>12cm）的卵巢癌患者较NUPR1蛋白的表达量低、Ⅰ/Ⅱ期和最大肿瘤大小<12cm的卵巢癌患者的总的生存率低。卵巢癌TNM分期和最大肿瘤大小是无复发生存期的独立预后因素,差异有统计学意义（P值分别为<0.001和=0.028）,TNM分期越晚（Ⅲ/Ⅳ期）、最大肿瘤大小越大（>12cm）的卵巢癌患者较Ⅰ/Ⅱ期和最大肿瘤大小<12cm的卵巢癌患者的无复发生存期短。研究结论:NUPR1蛋白在卵巢癌原发灶组织和转移灶组织中呈高表达,与卵巢癌临床不良预后相关,NUPR1的检测有望成为卵巢癌的诊断和预后评估的新指标。第二部分:NUPR1在卵巢癌细胞中的分子生物学功能的研究研究目的:1.检测NUPR1在卵巢表面上皮（ovarian surface epithelium,OSE）细胞及卵巢癌细胞系（A2870和SKOV3细胞）中的表达;2.构建NUPR1低表达及过表达的卵巢癌细胞系,并探讨其对卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为的影响;3.利用体内成瘤实验来验证NUPR1对卵巢癌细胞成瘤的影响。材料与方法1.研究材料卵巢表面上皮细胞、A2780细胞、SKOV3细胞、293T细胞均购自中国上海中科院细胞库。siRNA委托上海吉玛生物有限公司完成,质粒的构建和慢病毒包装委托上海吉凯基因化学技术有限公司完成,转染部分由自己完成。2.研究方法:2.1.NUPR1在OSE细胞和卵巢癌细胞中的表达:用Western blot方法和逆转录-聚合酶链式反应法（RT-PCR）检测OSE细胞、A2780细胞和SKOV3细胞中NUPR1的表达,确定NUPR1在卵巢癌细胞和OSE细胞中的相对表达量;2.2.筛选出干扰效果最好的siRNA系列:用针对NUPR1的3条小干扰系列siRNA-NUPR1（siRNA-337,siRNA-414,siRNA-850）和 1 条 siRNA-NC 系列作用于A2780和SKOV3细胞,并通过Western blot实验和RT-PCR实验来验证siRNA对NUPR1的干扰效率,用MTT实验、平板克隆形成实验来检测小干扰对细胞增殖的影响,用Transwell实验来分析小干扰对细胞迁移和侵袭的影响,用流式细胞术来检测细胞的周期和凋亡,并综合以上因素选择其中1条siRNA来构建稳定低表达NUPR1的短发卡RNA（shRNA-NUPR1）;2.3.构建shRNA-NUPR1并验证NUPR1低表达对卵巢癌细胞系的影响:shRNA-NUPR1作用于A2780细胞,构建NUPR1低表达的稳转的A2780细胞系,用Western blot实验和RT-PCR实验来检测其相关蛋白和mRNA的相对表达量以验证转染效率,用MTT实验、平板克隆形成实验和EdU实验检测细胞的增殖,用Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力;2.4.构建NUPR1高表达的卵巢癌细胞系,并验证NUPR1高表达对卵巢癌细胞系的影响:构建NUPR1高表达的质粒,并转染A2780细胞和SKOV3细胞。通过Western blot实验和RT-PCR实验检测相关蛋白和mRNA的相对表达量以验证转染效率,细胞的增殖用EdU实验、平板克隆形成实验和MTT实验检测,Transwell实验被用来检测细胞的迁移和侵袭能力;2.5.裸鼠体内成瘤实验:用稳转NUPR1低表达的A2780细胞系行裸鼠体内成瘤实验,进一步验证NUPR1低表达的卵巢癌细胞对裸鼠体内成瘤的影响。研究结果:1.NUPR1在卵巢癌细胞系和OSE细胞中的表达:Western blot实验表明,NUPR1在卵巢癌细胞系A2780细胞和SKOV3细胞中的表达高于OSE细胞（P值分别为0.0139和0.011）,且在A2780细胞中的表达高于SKOV3细胞（P=0.0481）。RT-PCR实验表明NUPR1 mRNA在卵巢癌细胞系A2780细胞和SKOV3细胞中的表达高于OSE细胞（P值分别为0.0397和0.0372）,且在A2780细胞中的表达高于SKOV3细胞,但两者比较差异无统计学意义（P=0.1926）;2.使用siRNA干扰NUPR1对卵巢癌细胞系的生物学功能的影响:用针对NUPR1 的 3 条小干扰系列 siRNA-NUPR1（siRNA-337,siRNA-414,siRNA-850）和1条siRNA-NC系列作用于A2780细胞和SKOV3细胞。Western blot实验和RT-PCR实验的结果提示,与对照组相比,NUPR1干扰组的NUPR1表达量均显着下降。MTT实验和平板克隆形成实验均提示干扰NUPR1能够抑制卵巢癌细胞的增殖,在A2780细胞中,和siRNA-NC组相比较,siRNA-NUPR1均可以减少细胞克隆数,但是仅siRNA-414组和siRNA-NC组的细胞克隆数相比较差异有统计学意义（P=0.0266）。与对照组相比,NUPR1敲低组能够抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭。在A2780细胞中,和对照组相比,siRNA-414和siRNA-850能够抑制细胞的迁移能力（P<0.05）,而siRNA-337和siRNA-414能够抑制细胞的侵袭能力（P<0.05）。在SKOV3细胞中,和siRNA-NC组相比较,siRNA-NUPR1均能显着抑制细胞的迁移和侵袭（P值均<0.05）。流式细胞术实验结果表明,siRNA-NUPR1能够促进A2780细胞和SKOV3细胞的凋亡,但是仅siRNA-414和siRNA-850两个系列作用于A2780细胞后引起的细胞凋亡和siRNA-NC组相比较有统计学差异（P<0.01）。在A2780细胞中,与对照组相比,siRNA-NUPR1组的G0/G1期细胞比例减少,S期细胞比例增加,仅siRNA-414系列引起的细胞周期比例的变化与对照组相比有统计学意义（P<0.05）;根据以上研究结果综合判断,我们选择siRNA-414系列来构建稳定低表达NUPR1的shRNA-NUPR1,并将其应用于后续的实验中;3.使用shRNA沉默NUPR1对A2780细胞的生物学功能的影响:sh-NUPRl包埋的病毒转染A2780细胞后,Western blot实验和RT-PCR实验的结果显示,NUPR1沉默后NUPR1的表达水平下降,细胞凋亡相关分子caspase3、caspase9和Bax表达水平升高,抗凋亡分子Bc12、Bcl-xl表达下降,细胞周期相关蛋白CDK4、CDK6表达下降。MTT实验表明NUPR1低表达组的A2780细胞在72h和96小时显示出明显的细胞增殖抑制（P值分别为0.0009和0.0001）。平板克隆形成实验提示NUPR1低表达组的细胞克隆数明显低于对照组（P=0.0301）。EdU实验也提示NUPR1沉默组的A2780细胞的细胞增殖明显低于对照组（P=0.0173）。在Transwell实验中,NUPR1的沉默能够抑制A2780细胞的迁移和侵袭（P值分别为0.0297和0.0156）;4.卵巢癌细胞中NUPR1过表达对卵巢癌细胞的生物学功能的影响:在卵巢癌细胞中,Western blot实验和RT-PCR实验的结果显示,NUPR1过表达后的NUPR1的表达水平升高,细胞凋亡相关分子caspase3、caspase9和Bax表达水平下降,抗凋亡分子Bc12、Bcl-xl表达升高,细胞周期相关蛋白CDK4、CDK6表达升高。MTT实验、平板克隆形成实验和EdU实验显示过表达NUPR1能够促进卵巢癌细胞的增殖。Transwell实验提示过表达NUPR1可以促进卵巢癌细胞的迁移和侵袭;5.沉默NUPR1对裸鼠体内成瘤的影响:裸鼠成瘤实验结果表明,沉默NUPR1后,肿瘤的体积和重量均明显下降,与NC组比较,均有显着性差异（P值分别为0.0426和0.0443）。研究结论:NUPR1在卵巢癌细胞中呈高表达,高表达的NUPR1能显着促进卵巢癌细胞的生长,低表达的NUPR1能显着抑制卵巢癌细胞的生长,NUPR1可能与卵巢癌的发生发展有关。第三部分:NUPR1在卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移中的分子机制研究研究目的:分别检测NUPR1过表达的A2780细胞和SKOV3细胞经AKT通路抑制剂LY294002处理后,NUPR1蛋白,AKT蛋白和p-AKT蛋白的相对表达量,并比较各组细胞在细胞增殖、迁移和侵袭方面的变化。材料与方法1.研究材料1.1.细胞系:人卵巢癌细胞系同第二部分。培养基用RPMI-1640,加入10%的胎牛血清（FBS）,1%的青霉素和链霉素双抗,37℃下,在5%CO2的孵箱中无菌培养。1.2.实验分组:将本组实验的细胞分为四组,一组为pCMV-NC+DMSO组,即NC组加入DMSO,一组为pCMV-NC+LY294002组,即NC组加入10μM的AKT 抑制剂 LY294002,一组为 pCMV-NUPR1+DMSO 组,即 NUPR1 高表达组加入DMSO,另外一组为pCMV-NUPR1+LY294002组,即高表达NUPR1后加入 10μM 的 AKT 抑制剂 LY294002。2.研究方法:2.1.卵巢癌细胞NUPR1过表达后的相关通路蛋白的变化:用Western blot实验检测NUPR1过表达的A2780细胞和SKOV3细胞经LY294002（10μM）处理后,四组细胞中（pCMV-NC+DMSO 组,pCMV-NC+LY294002 组,pCMV-NUPR1+DMSO 组和 pCMV-NUPR1+LY294002 组）的 NUPR1 蛋白、AKT蛋白和p-AKT蛋白的相对表达量;2.2.卵巢癌细胞的增殖的变化:用MTT实验和平板克隆形成实验检测LY294002作用后细胞的增殖和生长情况;2.3.卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力的变化:用Transwell实验检测卵巢癌细胞的迁移和侵袭的变化。研究结果:1.卵巢癌细胞NUPR1过表达后相关通路蛋白的变化:用Western blot实验检测NUPR1过表达的A2780细胞和SKOV3细胞经AKT通路抑制剂LY294002处理后,NUPR1蛋白,AKT蛋白和p-AKT蛋白的相对表达量。在A2780细胞和 SKOV3 细胞中,NUPR1 蛋白在pCMV-NUPR1+DMSO 组和pCMV-NUPR1+LY294002 组明显高于 pCMV-NC+DMSO 组（P 值均<0.05）,NUPR1 蛋白在 pCMV-NUPR1+DMSO组和 pCMV-NUPR1+LY294002 组间比较,无显着性差异（P>0.05）。LY294002能明显抑制pCMV-NUPR1+LY294002组和pCMV-NC+LY294002组的p-AKT蛋白的表达。各组间的AKT蛋白的表达量无明显差异（P值均>0.05）;2.抑制AKT通路可以逆转NUPR1过表达对卵巢癌细胞的增殖的影响:用MTT实验和平板克隆形成实验检测LY294002作用后细胞的增殖和生长情况,提示在NUPR1高表达的A2780细胞中用LY294002（10μM）处理后72h,pCMV-NUPR1+DMSO 组比 pCMV-NUPR1+LY294002 组和 pCMV-NC+DMSO组有高的细胞增殖（P值分别为0.0179和0.0443）,pCMV-NC+DMSO组比pCMV-NC+LY294002 组有高的细胞增殖率（P<0.05）。pCMV-NUPR1+LY294002组和pCMV-NC+DMSO组有相似的细胞增殖,两组比较差异无统计学意义（P>0.05）。用LY294002处理后96h,pCMV-NUPR1+DMSO组比pCMV-NUPR1+LY294002组和pCMV-NC+DMSO组有高的细胞增殖（P值分别为 0.0008 和<0.0001）。和 pCMV-NC+DMSO 组相比较,pCMV-NC+LY294002组能够抑制细胞的增殖（P<0.05）。在NUPR1高表达的SKOV3细胞中,用LY294002处理后72h,pCMV-NUPR1+DMSO 组的细胞增殖明显比 pCMV-NUPR1+LY294002 组和pCMV-NC+DMSO组的细胞增殖要快,结果比较有统计学意义（P值均<0.0001）。和pCMV-NC+DMSO组相比较,pCMV-NC+LY294002组能够抑制细胞的增殖率（P=0.0013）,而 pCMV-NUPR1+LY294002 组和 pCMV-NC+DMSO 组有相似的细胞增殖率（P>0.05）,在LY294002作用于SKOV3细胞的96h时也观察到相似的结果。在LY294002作用于SKOV3细胞后72h和96h,我们对pCMV-NC+LY294002组和pCMV-NC+DMSO组的细胞的增殖率的比值及pCMV-NUPR1+LY294002组和pCMV-NUPR1+DMSO组的细胞增殖率的比值进行比较,发现两组比值在72h和96h均有统计学意义（P值分别为0.0013和0.0006）,说明LY294002在NUPR1高表达组对细胞增殖的抑制明显高于NC组,表明抑制AKT通路可以逆转NUPR1过表达对卵巢癌细胞的增殖的影响;平板克隆形成实验形成实验提示,在A2780细胞中,与pCMV-NC+DMSO组相比较,pCMV-NUPR1+DMSO组能够促进细胞的增殖,有显着性差异（P<0.001）,pCMV-NC+LY294002组能够抑制细胞的增殖,两者相比较差异有统计学意义（P<0.05）,pCMV-NUPR1+LY294002组有高的细胞克隆数（P<0.05）。和pCMV-NUPR1+LY294002组相比较,pCMV-NUPR1+DMSO组有更高的细胞克隆数（P<0.05）。对 pCMV-NC+LY294002 组和 pCMV-NC+DMSO 组的细胞的克隆数的比值及pCMV-NUPR1+LY294002组和pCMV-NUPR+DMSO组的细胞克隆数的比值进行比较,发现两组比值无统计学意义（P>0.05）。在NUPR1过表达的SKOV3细胞中,与pCMV-NC+DMSO组相比较,pCMV-NUPR1+DMSO组有更高的细胞克隆数,两者比较差异有统计学意义（P=0.0143）。pCMV-NUPR1+DMSO 组较 pCMV-NUPR1+LY294002 组有高的细胞克隆数（P=0.0008）。pCMV-NC+LY294002 组比 pCMV-NC+DMSO 组有更低的细胞克隆数,两者比较差异有统计学意义（P=0.0426）。而pCMV-NUPR1+LY294002组和pCMV-NC+DMSO组的细胞克隆数相比较,差异无统计学意义（P>0.05）。对 pCMV-NC+LY294002 组和 pCMV-NC+DMSO 组的细胞的克隆数的比值及pCMV-NUPR1+LY294002组和pCMV-NUPR+DMSO组的细胞克隆数的比值进行比较,发现两组比值有统计学意义（P=0.0347）,说明LY294002在NUPR1高表达组对细胞增殖的抑制明显高于NC组,这点也验证了抑制AKT通路可以逆转NUPR1过表达对卵巢癌细胞的增殖的影响;3.抑制AKT通路可以逆转NUPR1过表达对卵巢癌细胞的迁移和侵袭的影响:用Transwell实验检测卵巢癌细胞的迁移和侵袭的变化。pCMV-NUPR1+DMSO组的A2780细胞比pCMV-NC+DMSO组有更强的细胞迁移能力（P=0.0001）,和 pCMV-NUPR1+LY294002 组相比较,pCMV-NUPR1+DMSO组和pCMV-NC+DMSO组有更高的细胞迁移能力（P分别为<0.0001 和=0.0047）,pCMV-NC+DMSO 组比 pCMV-NC+LY294002 组有更高的细胞迁移能力（P=0.0014）,对pCMV-NC+LY294002组和pCMV-NC+DMSO组的细胞的迁移能力的比值及pCMV-NUPR1+LY294002组和pCMV-NUPR+DMSO组的迁移能力的比值进行比较,发现两组比值有统计学意义（P=0.0284）。在侵袭实验中,与pCMV-NC+DMSO组比较,pCMV-NUPR1+DMSO 组的侵袭能力增加（P=0.0158）,而pCMV-NUPR1+LY294002组和pCMV-NC+DMSO组有相似的细胞侵袭能力（P>0.05）。pCMV-NC+DMSO组比pCMV-NC+LY294002组有更高的细胞侵袭能力（P=0.0237）。pCMV-NUPR1+DMSO 组比 pCMV-NUPR1+LY294002 组有更强的细胞侵袭能力（P=0.0103）,对 pCMV-NC+LY294002 组和 pCMV-NC+DMSO组的细胞的侵袭能力的比值及pCMV-NUPR1+LY294002组和pCMV-NUPR+DMSO组的侵袭能力的的比值进行比较,发现两组比值有统计学意义（P=0.0359）。表明NUPR1过表达的A2780细胞显示出较强的细胞迁移和侵袭能力,而这种细胞迁移和侵袭的能力能够被LY294002逆转。研究结论:NUPR1能够通过AKT通路来促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭从而发挥致癌作用。
王鑫鑫[2]（2021）在《m6A阅读蛋白YTHDC2在卵巢癌中的表达及其临床意义》文中研究表明[目的]应用生物信息学技术及免疫组化检测m6 A修饰阅读蛋白YTHDC2在卵巢癌组织中的表达及其与临床病理学特征的关系,并探讨可能的作用机理,为进一步研究提供理论依据。[方法]通过GEPIA及Oncomine数据库分析YTHDC2基因在卵巢癌中的表达,利用Kaplan-Meier Plotter在线软件对YTHDC2基因进行生存分析;从UCSC xena网站下载TCGA数据库中卵巢癌样本的RNA-seq数据及对应的临床数据,利用64位“R”软件运行survival ROC包绘制时间依赖受试者工作曲线（Receiver Operating Characteristic curve,ROC曲线）,评估YTHDC2在卵巢癌预后判断中的准确性。通过转录后调控预测网站POSTAR挖掘YTHDC2的下游调控基因,利用m6A甲基化修饰数据库SRAMP预测YTHDC2下游靶基因FLNA甲基化位点信息,分析其作用机理。最后应用免疫组织化学方法（Immunohistochemistry,IHC）检测YTHDC2和FLNA在70例上皮性卵巢癌（Epithelial Ovarian Cancer,EOC）及25例正常卵巢组织中的表达情况,分析YTHDC2、FLNA表达与临床病理特征的关系以及二者之间的相关性,探讨YTHDC2基因在EOC中的临床意义及可能的作用机理。[结果]（1）Oncomine数据库筛选发现13项关于YTHDC2基因在卵巢癌中差异表达的研究,共包括3399例标本,对这13项研究结果进行统计分析,结果显示YTHDC2基因在卵巢癌中低表达,差异具有统计学意义（P<0.05）。GEPIA数据库筛选出426个卵巢癌组织样本,88个正常卵巢组织样本,统计分析显示,YTHDC2在卵巢癌中表达显着低于正常卵巢组织,差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）Kaplan-Meier Plotter生存分析结果显示,YTHDC2基因高表达组患者无进展生存期（Progression-free Survival,PFS）、总生存期（Overall Survival,OS）均显着高于低表达组患者（P<0.05）,YTHDC2高表达组卵巢癌患者的预后较好,差异有统计学意义（P<0.05）。（3）ROC曲线显示,1年、3年、5年及8年生存率AUC分别为0.634、0.579、0.535和0.518,均大于0.5,YTHDC2为有价值的独立预后因子,其中以1年生存率AUC值最高,预测价值最好。（4）POSTAR数据库共挖掘出YTHDC2的下游靶基因640个,选择FLNA为感兴趣的靶基因进行深入挖掘。（5）GEPIA数据库分析发现,FLNA在卵巢癌组织中表达显着低于正常卵巢组织,差异有统计学意义（P<0.05）。（6）m6A甲基化修饰位点预测数据库SRAMP（sequence-based RNA adenosine methylation site predictor）预测FLNA 甲基化位点信息,FLNA mRNA上有151个m6A修饰位点,评分最高的位点碱基序列为GGACU。（7）IHC方法检测EOC组织及正常卵巢组织中YTHDC2、FLNA蛋白水平,免疫组化阳性产物为淡黄色至棕褐色颗粒,YTHDC2主要定位于细胞核,FLNA主要定位于细胞核和细胞质。EOC组织中YTHDC2和FLNA的平均光密度值分别为0.701、1.76,正常卵巢组织中分别为1.46、3.01。与正常卵巢组织相比,EOC组织中YTHDC2和FLNA表达均显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。分析YTHDC2和FLNA表达与EOC临床病理特征的关系,发现YTHDC2、FLNA在不同组织病理学类型、国际妇产科联盟（Federation International of Gynecology and Obstetrics,FIGO）分期、淋巴结有无转移中的表达水平不同,差异具有统计学意义（P<0.05）。卵巢浆液性癌、FIGO Ⅰ-Ⅱ期、无淋巴结转移的EOC患者组织中YTHDC2和FLNA的阳性表达率均高于其他类型上皮性癌症、FIGO Ⅲ-Ⅳ期、有淋巴结转移的患者,差异有统计学意义（P<0.05）。而在不同组织分化程度、年龄<50岁与≥50岁的患者中的表达无显着差异（P>0.05）。Pearson分析EOC组织中YTHDC2、FLNA表达的相关性,结果发现YTHDC2、FLNA的表达呈正相关（R=0.438,P=0.001）。[结论]（1）m6A修饰阅读蛋白YTHDC2在卵巢癌中低表达,且与卵巢癌患者不良预后相关,该基因可能是卵巢癌诊断、预后评估及其靶向治疗的潜在生物标志物。（2）FLNA为YTHDC2下游靶RNA之一,其在卵巢癌中低表达。YTHDC2可能通过与FLNA结合,以m6A修饰方式调控FLNA表达,从而促进EOC进展,但需要进一步进行体内外实验验证其作用机理。
王爽[3]（2021）在《转录因子ZNF703影响卵巢癌恶性生物学行为的机制研究》文中研究指明目的:锌指蛋白703（ZNF703）作为一种转录因子,在多种肿瘤中表达升高,在卵巢癌中的功能尚不明确。本研究通过检测ZNF703在卵巢癌的表达及构建差异表达的细胞系,利用多种生物学方法结合ChIP-sequence高通量测序技术揭示ZNF703对卵巢癌生长和转移的影响及机制。方法:1、采用免疫组织化学的方法（即SP法）检查卵巢组织中ZNF703的表达情况,并分析评估ZNF703表达与临床病理参数的关系及对卵巢癌患者的总体存活率及预后的影响。检测四种卵巢癌细胞系中ZNF703的表达情况,分别构建ZNF703过表达和抑制表达的细胞模型,并通过Western Blot及qRT-PCR检测转染前后的ZNF703变化情况。MTT、细胞凋亡及细胞周期、侵袭实验及迁移实验用于评估ZNF703基因差异表达前后在体外对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响。GSEA方法用于对ZNF703进行GO和KEGG富集,并通过Western Blot检测pPI3K及p-AKT变化研究ZNF703对PI3K-AKT通路的作用。2、通过免疫共沉淀检测体外细胞中HE4与ZNF703结构上的相互作用关系,免疫荧光检测HE4与ZNF703在细胞中的共表达情况。从mRNA及蛋白角度分析ZNE703与HE4表达相关性（组化、WB、PCR）,细胞浆细胞核分离实验及免疫荧光检测HE4差异表达前后ZNF703的核易位情况,检测ZNF703促进的卵巢癌恶性生物学行为是否受到HE4影响。3、将卵巢癌细胞甲醛交联并片段化处理后,使用抗ZNF703一抗进行染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验,然后对富集得到的DNA进行定量、质检、测序,并将高通量测序结果定位到人类基因组（hg19）中进行分析。首先在ZNF703过表达或抑制表达的细胞中对潜在的靶基因进行qRT-PCR检测后,选取PEA15作为靶基因进行验证,根据PEA15对应的结合峰进行引物设计,ChIP-PCR检测ZNF703是否直接结合于PEA15的增强子区。构建双荧光素酶载体并转染293T细胞检测ZNF703对PEA15增强子区域的结合。Western Blot在蛋白水平检测ZNF703转染前后PEA15、p-PEA15（Ser 116）及pPEA15（Ser 104）的表达变化。临床标本检测PEA15的表达,分析PEA15和ZNF703的组化相关性,以及HE4与PEA15相关性,细胞实验分析HE4对PEA15mRNA、蛋白及磷酸化的影响。体内实验研究ZNF703过表达后对裸鼠皮下移植瘤增殖的影响,并利用HE染色及免疫组化检测移植瘤中ZNF703、Ki-67、PEA15及p-PEA15的水平。结果:1、ZNF703在卵巢癌组织中表达增加,其表达水平与卵巢癌患者临床病理参数无明显相关性,但ZNF703高表达的卵巢癌患者生存时间明显缩短、预后较差。CAOV3细胞中的ZNF703蛋白表达水平最高,依次为SKOV3和OVCAR3,在ES-2表达水平最低,分别进行siRNA的转染或过表达细胞系的构建,在蛋白和mRNA水平进行转染效率验证后实验。结果发现与对照组相比,过表达ZNF703后卵巢癌细胞增殖加快、细胞凋亡变少,细胞周期结果提示过表达后细胞向G2/S期转化。与此同时,过表达ZNF703后增强了卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力。不仅如此,我们发现过表达ZNF703后相关蛋白PCNA、Bcl2/Bax、cyclin D1、MMP2、MMP9增加。在siRNA转染的细胞中得到了相反的结果。GSEA富集分析发现ZNF703富集于很多通路,其中ZNF703过表达后PI3K和AKT的磷酸化程度显着升高,在抑制表达后降低。2、免疫共沉淀结果显示在两种细胞系中存在ZNF703和HE4的相互作用。免疫荧光共定位显示ZNF703主要表达于细胞核,HE4主要表达于细胞质,二者存在共定位。对免疫组化结果分析显示ZNF703与HE4的表达具有相关性,但是在细胞系中的表达并无相关性。HE4过表达或抑制表达前后ZNF703总蛋白表达没有明显差异,核浆分离实验结果显示HE4过表达后ZNF703的核内表达增多,胞浆内表达减少,在HE4抑制表达后观察到相反的结果。免疫荧光实验对HE4抑制前后ZNF703进行检测,发现在HE4抑制表达后,核内ZNF703的荧光表达减弱,细胞浆增加。同时,ZNF703可以逆转HE4对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响,而HE4对ZNF703促进的卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响并不显着。3、ChIP-Seq鉴定出多个ZNF703的调节靶点,这些靶点明显富集于很多通路。ChIP-PCR证实ZNF703可以直接与PEA15的增强子区结合,双荧光素酶报告基因也证明了这一结论。Western Blot结果说明过表达ZNF703后PEA15、p-PEA15、p-PEA15/PEA15均增加。在同样的临床标本中检测到PEA15在98例卵巢癌组织中高表达,PEA15高表达的患者预后更差。对组化结果进行相关性分析发现PEA15的表达与ZNF703、HE4均具有相关性。同时,PEA15 mRNA在siRNA抑制HE4表达时降低,在HE4过表达后增加。在蛋白水平HE4的差异表达会影响PEA15蛋白表达,但对PEA15磷酸化水平影响不明显。体内移植瘤实验结果显示相比于对照组,ZNF703过表达组瘤体的终体积更大、肿瘤质量更高、生长速度更快。且移植瘤组织中过表达组的Ki-67、PEA15、p-PEA15表达均增加。结论:1、ZNF703在卵巢癌组织及细胞中高表达,促使卵巢癌细胞增殖加快、细胞周期进展及侵袭转移能力增加、阻遏细胞凋亡。2、HE4和ZNF703的相互作用促进ZNF703核易位。3、ZNF703不仅通过直接结合PEA15的增强子促进PEA15的表达,还通过激活PI3K/AKT通路促进PEA15 Ser116位点的磷酸化,阻止卵巢癌细胞凋亡,进而促进卵巢癌进展。
张彦收[4]（2021）在《LRG1在乳腺癌中表达的临床意义及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响》文中研究指明乳腺癌是威胁女性健康最常见的恶性肿瘤之一,其发病率逐年上升。世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球最新癌症数据显示,乳腺癌新发病例高达226万例,并已超过肺癌成为全球第一大癌症。在我国,女性恶性肿瘤发病首位同样为乳腺癌,每年发病人数约为30.4万。因此,对于乳腺癌预防、诊断和治疗的研究是目前医学领域工作的重点。当前,随着乳腺癌治疗模式的进步和新型药物的不断涌现,乳腺癌的治疗效果已取得了巨大突破。然而,乳腺癌耐药后出现的复发、转移仍然是困扰临床的难题之一。因此,研究乳腺癌的增殖、侵袭、转移机制,探寻新的治疗途径和靶点对提高乳腺癌的生存率至关重要。富亮氨酸α2糖蛋白1（leucine-rich-alpha-2-glycoprotein1,LRG1）是富亮氨酸重复序列（leucine-rich repeat,LRR）家族蛋白成员,也是最早被发现的含有LRR结构的蛋白。人LRG1基因定位于染色体19p13.3,含有2810个碱基对,包括2个外显子和1个内含子。第一个外显子含43个碱基对,第二个外显子含1737个碱基对,共编码347个氨基酸残基。前35个氨基酸残基为信号肽,312个氨基酸残基构成单个肽链。因其定位的染色体区域同时存在数个编码中性粒细胞颗粒酶的基因,并且LRG1在人类MPD和HL-60细胞嗜中性分化过程中上调,而在HL-60细胞单核细胞分化过程中下调,早期研究认为LRG1可能是中性粒细胞早期分化的一种标志物。随着分子生物学技术的不断发展,LRG1的其它功能逐渐被发现:LRG1不仅参与细胞蛋白间的相互作用,同时在细胞信号转导、细胞黏附及发育过程中也发挥着重要作用。近些年研究显示LRG1在人类多种恶性肿瘤组织、血液、脑脊液、外泌体中异常表达,并且可以作为部分肿瘤早期诊断和预后判断的生物标记物。当前研究发现,LRG1在肿瘤的发生、发展、侵袭转移、上皮间质转化和异常血管生成过程中扮演重要角色,因此,LRG1在抗肿瘤治疗领域发挥的作用逐渐被大家重视。然而,LRG1在不同肿瘤中的表达存在明显差异,提示LRG1在不同肿瘤的发生、发展中可能发挥不同作用。如外泌体中LRG1与非小细胞肺癌发生发展有关;肝癌组织中LRG1表达较正常组织下调,体外实验显示LRG1对肝癌细胞增殖没有影响;卵巢癌患者血清和肿瘤组织中LRG1表达升高程度与肿瘤分期相关。LRG1在不同肿瘤中所发挥的作用正在积极探索之中。越来越多研究提示LRG1是抗肿瘤治疗的潜在靶点。但是,LRG1在乳腺浸润性癌中的表达、临床意义及作用机制有待进一步研究。本研究分三部分对LRG1在乳腺浸润性癌中的表达及临床意义进行了研究:第一部分:通过生物信息学方法分析不同肿瘤中LRG1mRNA及蛋白的表达情况,探索其与临床病理指标及预后的关系。第二部分:通过免疫组化Max Vision TM一步法检测了330例原发性乳腺癌组织中LRG1蛋白的表达,进一步分析LRG1蛋白的表达与乳腺癌临床病理指标及预后的相关性。第三部分:应用逆转录-多聚酶链式反应（RT-PCR）技术、Western-blot技术检测不同乳腺癌细胞系中LRG1的表达情况。采用RNA干扰技术抑制乳腺癌MD-MB-231细胞LRG1基因表达,通过CCK-8实验检测细胞增殖能力;划痕实验检测转染后细胞迁移能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力。探讨LRG1对乳腺癌细胞生物学行为的影响。第一部分LRG1在不同肿瘤中的表达及临床意义的生物信息学分析目的:通过生物信息学方法分析LRG1在不同肿瘤中的表达及其临床意义。方法:基于人类癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）数据库（http://www.tcga.org/）中肿瘤组织及正常组织中RNA-seq的测序结果,使用TIMER2.0在线工具（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）分析LRG1mRNA在肿瘤组织与正常组织中的表达情况。从人类蛋白质图谱图像（the human protein atlas）数据库中（https://www.proteinatlas.org）中获取LRG1蛋白在不同肿瘤组织和正常组织中表达的情况。基于Kaplan-Meier plotter数据库（http://kmplot.com/analysis）中患者的临床特征、生存资料,分析不同肿瘤中LRG1mRNA的表达与总生存期（overall survival,OS）和无复发生存期（recurrence free survival,RFS）之间的关系,并绘制Kaplan-Meier曲线。结果:1.LRG1mRNA在乳腺浸润癌（breast invasive carcinoma,BRCA）（1097例）、肾透明细胞癌（kidney renal clear cell carcinoma,KIRC）（533例）、肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）（515例）、子宫内膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma,UCEC）（545例）、甲状腺癌（thyroid carcinoma,THCA）（501例）中的表达量显着高于相对应的癌旁正常组织,差异具有统计学意义（P<0.001）。2.分析The Human Protein Atlas（https://www.proteinatlas.org）数据库中LRG1蛋白在BRCA、KIRC、LUAD、UCEC、THCA组织中的表达情况,结果显示LRG1蛋白在此五种癌组织中表达水平显着高于癌旁正常组织。3.分析LRG1mRNA在BRCA不同亚型中表达情况。566例Luminal型乳腺癌中LRG1表达量为37.462（9.930-74.197）,高于HER-2阳性型和三阴性乳腺癌（P<0.01）。根据淋巴结转移情况进一步分析显示,1646例淋巴结阳性患者组LRG1mRNA表达量高于2415例淋巴结阴性组,差异具有统计学意义（P<0.0001）。17例粘液腺癌中LRG1mRNA的表达量明显低于其它浸润性癌（浸润性导管癌、浸润性小叶癌及混合型癌）,差异具有统计学意义（P<0.0001）。利用Kaplan-Meier plotter在线工具,分析TCGA数据库中生存数据,LRG1mRNA的表达与Luminal A型、Luminal B型、HER-2阳性型乳腺癌的OS无明显关系（均P>0.05）,但在Basal-like亚型中,LRG1的表达与OS显着相关,LRG1表达低的乳腺癌患者OS较好（HR=3.12,95%CI=1.54-6.29,P<0.001）。4.在KIRC中,随着临床分期的升高,LRG1mRNA的表达呈上升趋势。Ⅳ期患者LRG1的表达量显着高于Ⅰ、Ⅱ期患者,差异具有显着性（P<0.01）。在不同组织学分级中,呈现同样趋势,组织学分化3级患者组LRG1表达量显着高于1、2级（P<0.01）。利用Kaplan-Meier plotter在线工具,分析TCGA数据库中530例KIRC患者的OS及RFS数据并绘制生存曲线,结果显示367例LRG1高表达组患者OS低于163例低表达组,LRG1mRNA的表达与OS显着相关（HR=1.71,95%CI=1.18-2.47,P=0.0042）。LRG1mRNA的表达与RFS关系与OS一致,LRG1高表达组患者RFS低于低表达组（HR=3.57,95%CI=1.26-9.87,P=0.0089）。在肾乳头状细胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma,KIRP）数据中,同样发现LRG1mRNA表达水平可以预测患者OS及RFS,高表达组患者OS及RFS均差于低表达组,差异具有显着性（OS:HR=2.19,95%CI=1.2-4.01,P=0.0091;RFS:HR=5.32,95%CI=1.2-22.54,P=0.011）。5.LUAD组织中LRG1mRNA的表达量显着高于正常组织。在正常肺组织中,LRG1mRNA中位表达量为25.277（20.394-30.683）,在LUAD组织中表达量为35.431（20.538-53.567）,差异具有统计学意义（P<0.001）。分析503例肺鳞状细胞癌（lung squamous cell carcinoma,LUSC）和52例正常组织的数据,发现LRG1mRNA在正常组织中表达水平显着高于LUSC（26.701 vs 11.612,P<0.001）。LRG1mRNA在LUAD和LUSC中的表达存在明显差异。在LUAD组,222例LRG1高表达组患者OS低于282例低表达组,LRG1mRNA表达与OS显着相关（HR=1.34,95%CI=1-1.8,P=0.045）。6.LRG1mRNA在UCEC组织中表达量为24.37（10.368-48.392）,高于正常子宫内膜组织表达（10.072,2.357-14.296）,差异具有显着性（P<0.001）,LRG1mRNA在UCEC中呈现高表达,但与年龄、临床分期、月经状态及预后无显着相关性。7.LRG1mRNA在THCA中的表达量随着淋巴结转移个数的增多而升高,具有统计学意义（P=0.027）,在预后方面,261例LRG1高表达组患者OS优于241例低表达组,且具有显着性差异（HR=0.11,95%CI=0.02-0.48,P=0.00035）。结论:1.LRG1mRNA及蛋白在BRCA、KIRC、LUAD、UCEC及THCA中表达显着上调,LRG1可能在肿瘤发生发展过程中发挥重要促进作用。2.Luminal型乳腺癌中LRG1mRNA表达量高于HER-2阳性型和三阴性,LRG1与Basal-like亚型乳腺癌的OS呈负相关。3.KIRC中LRG1mRNA的表达可以预测OS及RFS,LRG1表达与OS、RFS呈负相关。4.LRG1mRNA在LUAD中表达上调,LRG1高表达提示患者OS较差。5.LRG1mRNA在UCEC中表达上调,但与临床特征及预后无显着相关性。6.LRG1mRNA在THCA中表达与淋巴结转移个数呈正相关,与OS呈显着正相关。第二部分乳腺癌组织中LRG1蛋白表达与临床特征及生存预后的关系目的:探讨乳腺癌组织LRG1蛋白的表达与乳腺癌临床特征及生存预后的关系。方法:通过免疫组化Max Vision TM一步法检测330例原发性乳腺癌组织中LRG1蛋白的表达情况,探讨LRG1与乳腺癌患者年龄、月经、肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移状况、组织学分级、分子亚型及生存预后的相关性。结果:1.LRG1蛋白在原发性乳腺癌中表达情况。在330例原发性乳腺癌患者中,58.48%（193例）患者LRG1呈阳性表达。LRG1着色部位主要位于细胞质,阳性信号表现为褐色颗粒状外观。2.LRG1蛋白的表达与临床病理指标的关系。0-3个淋巴结转移组LRG1阳性表达128例,阴性表达121例,阳性表达率51.41%;3个以上淋巴结转移组LRG1阳性表达65例,阴性表达16例,阳性表达率80.25%,两组间LRG1阳性表达率存在显着性差异（χ2=20.939,P<0.001）。LRG1的表达与淋巴结转移负荷呈正相关,随着淋巴结转移数量的增多,LRG1的阳性表达率升高。Ⅰ-Ⅱ期患者组LRG1阳性表达124例,阴性表达125例,阳性表达率62.96%;Ⅲ期组LRG1阳性表达69例,阴性表达12例,阳性表达率85.19%。两组间LRG1阳性表达率的差异有统计学意义（χ2=31.520,P<0.001）。LRG1的表达与肿瘤负荷呈正相关,随着疾病的进展,LRG1的阳性表达率升高。3.LRG1蛋白的表达与乳腺癌DFS（disease-free survival,DFS）、OS的关系。330例患者中位随访时间72个月,92例患者出现局部复发或远处转移,80例患者死亡。LRG1阳性表达组72个月的DFS为61.14%（118/193）,阴性表达组DFS为87.59%（120/137）,两组间DFS存在显着差异（χ2=27.123,P<0.001）。72个月OS与DFS结果相似,共出现80例死亡事件,总体人群72个月OS为75.76%。LRG1阳性表达组72个月的OS为66.32%（128/193）;LRG1阴性组为89.05%（122/137）,两组间差异有显着性（χ2=22.864,P<0.001）。4.影响DFS及OS的COX回归模型多因素分析COX多因素分析显示LRG1表达、TNM病理分期和分子亚型是影响乳腺癌患者DFS和OS的独立危险因素（P<0.05）。肿瘤大小、组织学分级、年龄、月经状态与DFS、OS无显着相关性（P>0.05）。LRG1表达、TNM病理分期和分子亚型对DFS的风险比分别为2.090、3.214和1.796;对于OS的风险比分别是2.112、2.628和1.755。结论:1.乳腺癌LRG1蛋白的表达与年龄、月经状态、肿瘤大小、组织学分级、分子亚型无关。2.乳腺癌LRG1蛋白的表达与淋巴结转移个数呈正相关,随着淋巴结转移个数的增多,LRG1的阳性表达显着升高。3.乳腺癌LRG1蛋白的表达与病理TNM分期相关,分期越晚,LRG1的阳性表达越高。4.LRG1蛋白的表达、TNM病理分期和分子亚型是影响乳腺癌DFS、OS的独立危险因素。LRG1表达水平与DFS、OS呈负相关。第三部分LRG1在乳腺癌细胞中的表达及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响目的:验证乳腺癌细胞系中LRG1的表达是否与乳腺癌组织中表达一致,为LRG1在乳腺癌发生、发展及侵袭转移中的作用提供理论支持。方法:主要应用了RNA干扰技术、RT-PCR、Western-blot技术和细胞划痕实验等方法,观察不同乳腺癌细胞系中LRG1的表达情况,抑制LRG1表达后细胞的增殖、迁移、侵袭能力的变化。结果:1.RT-PCR方法检测乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7及SK-BR-3细胞中LRG1mRNA的表达。在三种不同乳腺癌细胞（MDA-MB-231、MCF-7及SK-BR-3）中,LRG1mRNA表达水平差别显着,具有统计学意义（P<0.05）。MCF-7细胞中LRG1mRNA的相对表达量（0.1260±0.0070）,较MDA-MB-231细胞（0.1103±0.0081）、SK-BR-3细胞（0.0703±0.0027）相对表达量显着增高。2.MDA-MB-231、MCF-7及SK-BR-3细胞中LRG1蛋白的表达。在三种不同乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7及SK-BR-3中,LRG1蛋白的表达存在显着差别,具有统计学意义（P<0.05）。MCF-7细胞中LRG1蛋白相对表达水平最高（10.9510±0.6721）,显着高于MDA-MB-231（7.8492±0.1327）、SK-BR-3细胞（4.3906±0.1914）。3.采用RNA干扰技术抑制乳腺癌MD-MB-231细胞LRG1基因表达。Western-blot技术检测检测转染成功后MDA-MB-231细胞中LRG1蛋白的表达,结果显示,转染组（MDA-MB-231-Si）中LRG1蛋白表达量（0.4105±0.1906）较对照组细胞（MDA-MB-231）中的表达量（0.8295±0.1295）明显降低,差异具有显着性（P<0.05）。4.CCK-8实验检测细胞增殖能力。转染成功后,CCK-8实验检测各组细胞在24h、48h、72h和96h后450 nm处OD值。结果显示:随着时间的延长,转染组（MDA-MB-231-Si）增殖率明显低于转染阴性对照组（MDA-MB-231-NC）及对照组（MDA-MB-231）,提示LRG1表达抑制后,细胞增殖能力下降。5.细胞划痕实验检测细胞迁移能力。划痕实验分别检测处于对数生长期的对照组、转染阴性对照组、转染组细胞（MDA-MB-231、MDA-MB-231-NC及MDA-MB-231-Si）细胞的迁移能力。划痕0小时测得的划痕区面积:对照组细胞（MDA-MB-231）、转染组细胞（MDA-MB-231-Si）、转染阴性对照组细胞（MDA-MB-231-NC）分别为:15.054±0.122,14.679±0.142,13.407±0.112。划痕24小时后测得的划痕区面积分别为:6.714±0.131,9.559±0.122,5.217±0.132。面积缩小的比值依次为:55.40%,34.88%,61.08%。乳腺癌MDA-MB-231-Si细胞在划痕24小时后的迁移率均明显低于对照组（MDA-MB-231）、转染阴性对照组（MDA-MB-231-NC）,差异有显着性（P<0.05）。6.Transwell实验检测细胞侵袭能力。Transwell侵袭实验显示转染组（MDA-MB-231-Si）穿膜细胞数少于转染阴性对照组（MDA-MB-231-NC）及对照组（MDA-MB-231）,提示LRG1表达抑制后,细胞侵袭能力下降。结论:1.MCF-7细胞中LRG1mRNA的相对表达量,较MDA-MB-231细胞、SK-BR-3细胞相对表达量显着增高。2.MCF-7细胞中LRG1蛋白的相对表达水平较MDA-MB-231细胞、SK-BR-3细胞显着增高。3.si-RNA干扰LRG1表达后可减弱MDA-MB-231细胞的增殖、迁移及侵袭能力。
吴建磊[5]（2021）在《TIM-3在上皮性卵巢癌发生及其临床预后中的意义》文中指出上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,其死亡率高居妇科恶性肿瘤之首,严重影响女性健康。由于缺乏特异性的肿瘤标志物及早期症状,超过70%的EOC患者在诊断时已经处于晚期。目前,EOC的主要治疗方法是手术+铂类为基础的化疗。近年来,虽然PARP抑制剂等辅助治疗策略也被应用于EOC,但晚期EOC患者的5年生存率仍然徘徊在30-40%之间,近40年来改善甚微。因此,迫切需要寻找能够揭示EOC发生、发展的深层次分子机制,为EOC的诊断及新的治疗方法的开发提供理论基础。随着肿瘤免疫学的发展,免疫治疗已成为与手术、化疗、放疗并列的第四种治疗方式。免疫疗法的应用已经彻底改变了一些肿瘤的治疗模式,其中针对免疫检查点分子的治疗,如CTLA-4和PD-1等,在黑色素瘤、肾癌、霍奇金病和肺癌中取得了令人兴奋的结果。但是,针对现有免疫检查点的免疫治疗的整体有效率较低。更为严重的是,包括卵巢癌、结直肠癌在内的多种肿瘤,在很大程度上对CTLA-4或PD-1阻断剂无效。因此,需要对其它的免疫检查点分子进行详细研究,以开发新的免疫检查点药物及筛选对免疫治疗有效的人群,提高免疫治疗的效果。TIM-3蛋白是T细胞免疫球蛋白-粘蛋白家族（T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein,TIM）的成员,最初发现在Th1细胞上特异表达,其编码基因位于人类chr5q33,全长23kb,由7个外显子组成。后续研究发现:TIM-3可在多种免疫细胞中表达,如单核细胞、DCs、NK细胞等天然免疫细胞,并参与免疫细胞功能的调控。大量的肿瘤免疫学的研究表明:TIM-3不仅可以通过调控T细胞耗竭和抑制骨髓细胞增殖在肿瘤免疫中发挥负性调节作用,而且可以通过促进肿瘤相关巨噬细胞表型的转化来调节抗肿瘤免疫反应。正如Romero博士在综述《Immunotherapy:PD-1 says goodbye,TIM-3says hello》所说的:TIM-3在肿瘤免疫中发挥重要的免疫检查点作用。因此,TIM-3作为一种潜在的肿瘤免疫治疗候选药物靶点,已经占据了突出的地位。近年来,多项研究也表明TIM-3在肿瘤细胞中过表达,如黑色素瘤、胃癌、B细胞淋巴瘤、宫颈癌、肾透明细胞癌、骨肉瘤等,并通过参与IL-6/STAT3通路、TGF-β/Smad通路和上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transformation,EMT）等过程促进肿瘤侵袭转移,而且TIM-3的异常表达与患者不良预后相关。先前有学者研究发现,在卵巢癌患者外周血CD4+和CD8+T细胞中TIM-3的表达水平较正常人相比显着升高,而TIM-3高表达的患者的临床分期和肿瘤分级显着高于低表达的患者。进一步研究显示,TIM-3在卵巢癌患者的肿瘤浸润性Tregs中高表达与患者预后不良有关。因此,TIM-3可能在EOC发生发展中起重要作用,可能成为EOC的潜在治疗靶点。但是,目前关于TIM-3在EOC肿瘤细胞中表达情况及在EOC肿瘤发生发展中的作用和机制及其与EOC预后的关系仍不明确。阐明TIM-3表达与EOC肿瘤发生发展的关系及可能的作用机制,有助于加深对EOC发病机制的了解及新的治疗靶点开发,同时可以为EOC高危人群的筛查和免疫治疗疗效的预测提供新的分子标志物。本研究中,我们首先探讨TIM-3蛋白及mRNA在EOC肿瘤组织中的表达情况,并分析其与EOC临床病理特征及预后的关系。其次通过体外实验在细胞水平研究TIM-3对EOC细胞生物学行为的影响及其可能的机制。另外,我们还通过病例-对照研究,探讨TIM-3基因上rs10053538、rs10515746及rs1036199三个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）位点与EOC发病风险及预后的关系,意义在于探讨TIM-3基因上的可能的功能性遗传变异是否通过改变其表达而改变人群EOC的发病风险和患者的临床预后,这也可能为EOC高危人群筛查和免疫治疗疗效的预测提供新的分子标志物。第一部分TIM-3在上皮性卵巢癌组织中的表达及其预后关系的研究目的:探讨TIM-3在EOC组织中的表达与EOC患者临床病理特征及其预后的关系。方法:1.采用免疫组化检测46例EOC组织及21例正常卵巢组织中TIM-3蛋白的表达差异。2.RT-qPCR法检测126例EOC组织及21例正常卵巢组织中TIM-3 mRNA的表达情况,分析TIM-3 mRNA表达与EOC临床病理特征及预后的关系;并通过在线网站GEPIA2（http://gepia2.cancer-pku.cn）查阅TCGA数据库中TIM-3 mRNA在卵巢癌与正常卵巢组织中的表达情况。3.采用多色免疫荧光技术检测135例EOC组织中TIM-3蛋白的表达情况,并分析TIM-3蛋白表达情况及在肿瘤区域TIM-3蛋白表达与EOC患者临床病理特征及预后的关系。结果:1.TIM-3蛋白在EOC组阳性率76.1%（35/46）明显高于正常卵巢组23.8%（5/21）,差异具有统计学意义（P<0.001）。2.EOC组织中TIM-3 mRNA的相对表达量明显高于正常卵巢组织,差异具有统计学意义（P<0.001）。TCGA数据库中卵巢癌组织中TIM-3 mRNA的表达也显着高于正常卵巢组织（P<0.05）;EOC组织中TIM-3 mRNA高表达患者肿瘤复发风险（HR=2.43,95%CI=1.47-4.04,P=0.001）和死亡风险（HR=1.84,95%CI=1.10-3.08,P=0.021）与低表达患者相比均明显增加。3.EOC组织中TIM-3蛋白的表达与EOC临床分期、分化及手术残留情况密切相关（P<0.05）;肿瘤区域（即CK+区域）TIM-3蛋白的表达与EOC临床分期、分化密切相关（P<0.05）。4.Cox多因素分析显示EOC组织中TIM-3蛋白高表达患者肿瘤复发风险（HR=1.99,95%CI=1.29-3.08,P=0.002）和死亡风险（HR=2.13,95%CI=1.37-3.30,P=0.001）与低表达患者相比均明显增加;CK+区域TIM-3蛋白高表达患者肿瘤复发风险（HR=1.64,95%CI=1.09-2.46,P=0.018）和死亡风险（HR=1.81,95%CI=1.19-2.75,P=0.006）与低表达患者相比均明显增加。结论:1.TIM-3蛋白及mRNA在EOC组织高表达。2.TIM-3表达与EOC临床分期、分化等临床病理因素相关。3.EOC组织中TIM-3 mRNA和蛋白高表达是患者肿瘤复发及死亡的独立危险因素。第二部分TIM-3对卵巢癌细胞生物学行为的影响及机制研究目的:探讨TIM-3对卵巢癌细胞生物学行为的影响及其可能的机制,明确TIM-3在EOC恶性化进程中的作用及机制,为EOC的靶向治疗奠定理论基础。方法:1.筛选TIM-3高表达细胞株:RT-qPCR及western-blot技术检测人卵巢癌细胞SKOV3、A2780、OVCAR3及人正常卵巢上皮细胞IOSE80中TIM-3的表达。2.采用脂质体转染法构建TIM-3低表达卵巢癌细胞系,CCK-8法及平板克隆形成实验检测细胞增殖活性的变化,流式细胞技术检测细胞凋亡情况的变化,划痕实验及transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力的变化。3.Western-blot技术检测转染后EMT及TGF-β/Smad信号通路的变化。结果:1.SKOV3、A2780、OVCAR3细胞中TIM-3 mRNA及蛋白均高于IOSE80细胞（P<0.001）,其中SKOV3细胞中TIM-3 mRNA及蛋白高于A2780、OVCAR3细胞（P<0.05）。2.LVRU6GP-TIM-3-sh RNA治疗转染SKOV3细胞后,TIM-3的mRNA及蛋白表达水平显着低于转染空质粒组（P<0.05）,CCK-8及平板克隆形成实验结果显示,敲低TIM-3表达后SKOV3细胞的增殖率显着降低（P<0.05）,流式细胞实验结果显示,敲低TIM-3表达后SKOV3细胞凋亡率显着增加（P<0.05）,划痕实验及transwell小室实验结果显示,敲低TIM-3表达后SKOV3细胞迁移及侵袭能力显着降低（P<0.05）。3.在SKOV3-sh组细胞中E-cadherin的表达明显高于SKOV3-NC组细胞（P=0.006）;而SKOV3-sh组细胞中N-cadherin和Vimentin的表达明显低于SKOV3-NC组细胞（P=0.014、P=0.002）。SKOV3-sh组细胞Smad7及磷酸化Smad2（p-Smad2）的表达明显高于SKOV3-NC组细胞（P<0.001、P=0.002）,而两组细胞中Smad2的表达无明显差异（P>0.05）。结论:1.敲低TIM-3的表达可抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迀移,并促进其凋亡。2.敲低TIM-3表达抑制卵巢癌细胞EMT过程,可能与TGF-β/Smad信号通路有关。第三部分TIM-3基因多态性与上皮性卵巢癌遗传易感性及临床预后的关联研究目的:探讨TIM-3基因多态性与EOC遗传易感性及其患者临床预后的关系。方法:1.采用我们课题组标本库的710例EOC患者和700例健康女性的外周血DNA标本,通过聚合酶链反应/连接酶检测反应（polymerase chain reaction/ligase detection reaction,PCR-LDR）方法对TIM-3基因上的3个SNPs位点（rs10053538、rs10515746和rs1036199）进行基因分型,分析不同基因型与EOC患者发病风险及预后的关系。2.采用RT-qPCR检测分别携带TIM-3两个位于启动子区的SNPs位点（rs10053538和rs10515746）不同基因型EOC肿瘤组织中TIM-3mRNA的表达水平,分析其对TIM-3 mRNA表达的影响。3.应用Kaplan-Meier plotter数据库分析TIM-3 mRNA对EOC患者的预后价值。结果:1.TIM-3基因rs10053538、rs10515746和rs1036199的的基因型和等位基因型频率分布在病例组和对照组无统计学差异（P>0.05）。2.预后分析显示携带rs10053538 CA+AA基因型患者的PFS和OS较CC基因型患者明显减少（HR=1.49,95%CI=1.05-2.09,P=0.024;HR=1.57;95%CI=1.09-2.26,P=0.017）;而携带rs10515746CC和rs1036199AA不同基因型的患者的PFS和OS均无统计学差异（P>0.05）。3.RT-qPCR结果显示携带rs10053538 CA+AA基因型的EOC患者癌组织中TIM-3 mRNA的表达量显着高CC基因型的患者（P=0.006）,而携带rs10515746不同基因型的EOC患者癌组织中TIM-3 mRNA的表达量则无明显差异（P>0.05）。4.应用Kaplan-Meier plotter数据库分析显示TIM-3 mRNA高表达与EOC患者差的PFS和OS相关（HR=1.57,95%CI=1.29-1.91,P<0.001;HR=1.31,95%CI=1.06-1.63,P=0.013）。结论:1.TIM-3基因rs10053538、rs10515746、rs1036199 SNPs与EOC发病风险无关。2.rs10053538 SNP与EOC患者的临床预后相关,携带rs10053538CA+AA基因型是EOC患者肿瘤复发及死亡的独立危险因素。3.rs10053538可能是一个功能性的多态性位点。4.TIM-3 mRNA高表达与EOC患者的不良临床预后相关。
张林[6]（2021）在《m6A机制调控子宫内膜癌转移与进展的分子机制研究》文中指出背景:N6-methyladenosine（m6A）是RNA上最常见的化学修饰,它调控了 RNA的多种代谢过程。m6A在细胞核内被以METTL3-METTL14为核心的酶催化形成,也可以被FTO或ALKBH5催化去除,这种动态平衡维持了 RNA上m6A的修饰。而细胞质中有一类蛋白质（YTHDFs,IGF2BPs等）可以特异识别m6A修饰发挥对RNA功能的调控。近年来,越来越多的研究发现了多种m6A调控的蛋白在肿瘤中存在异常表达,m6A调控机制在肿瘤进展的过程中发挥了关键作用,但其在子宫内膜癌进展中的调控机制尚不清楚。方法:通过定量PCR,免疫组织化学检测FTO与IGF2BP1在子宫内膜癌组织中表达;使用慢病毒转染技术增强/沉默FTO与IGF2BP1在细胞株中的表达,CCK-8,EdU,细胞周期实验分析肿瘤细胞的增殖,Transwell与划痕实验分析细胞侵袭与转移变化,裸鼠成瘤实验分析其对小鼠成瘤性的变化。通过RNA-seq,RIP-seq,MeRIP-seq等方法分析其下游靶基因的调控网络,以明确m6A调控子宫内膜癌进展的分子机制。结果:FTO与IGF2BP1在子宫内膜癌组织中表达增高,FTO与IGF2BP1的高表达可以分别促进子宫内膜癌细胞的转移与增殖。从机制上来说,FTO可以通过m6A机制调控HOXB13的表达,激活下游WNT信号通路促进肿瘤细胞的转移。此外,IGF2BP1通过识别PEG10 mRNA中的m6A修饰,促进PEG10 mRNA的稳定与蛋白的表达,通过抑制P16,P18的表达,加速细胞周期。结论:本研究证实了 FTO与IGF2BP1可以通过m6A机制调控子宫内膜癌的进展,这为理解子宫内膜癌转移与进展提供了新的分子调控机制。
李婷婷[7]（2020）在《TIPE1表达促凋亡机制对卵巢癌和颗粒细胞的影响》文中研究指明研究背景:多项研究表明TIPE1在各种癌症肿瘤中参与细胞凋亡,可预测病人的预后,是一种癌症的识别生物标志物。但在卵巢癌中,TIPE1的临床意义、生物学功能尚未阐明。而卵巢颗粒细胞的凋亡能影响卵泡发育,因此研究TIPE1在卵巢颗粒细胞中的作用,颗粒细胞是卵子周围的大细胞群,从而探讨TIPE1对卵子发育环境可能的影响。研究目的:探讨TIPE1在卵巢癌组织中表达的临床意义;TIPE1在卵巢癌和卵巢颗粒细胞中的作用,以及TIPE1促凋亡的机制。研究方法1.用组织芯片免疫组化、qRTPCR、免疫蛋白印迹等方法检测TIPE1在卵巢癌组织中的表达,分析90例卵巢癌临床样品中TIPE1的表达以及和生存预后的关系。2.通过感染慢病毒建立稳定的TIPE1高表达A2780、SKOV-3卵巢癌细胞株,构建卵巢癌细胞模型,用CCK-8、克隆形成实验、流式细胞凋亡实验,Balb/c裸鼠成瘤实验等方法,观察TIPE1对卵巢癌细胞活性和凋亡的影响。3.通过感染慢病毒建立稳定的TIPE1高表达卵巢颗粒细胞株,构建卵巢颗粒细胞模型,用CCK-8、克隆形成实验、流式细胞凋亡实验,电化学发光法等方法,观察TIPE1对颗粒细胞活性和凋亡的影响,以及对颗粒细胞合成和分泌雌激素的影响。4.通过用qRTPCR、免疫蛋白印迹、组织免疫荧光实验等方法分析卵巢癌细胞和颗粒细胞模型中,caspase 3、caspase 8和caspase 9的表达情况,探讨卵巢癌细胞和颗粒细胞中TIPE1对效应凋亡蛋白caspases表达的影响。在高表达了TIPE1的卵巢癌细胞和颗粒细胞中用z-VAD抑制caspases的表达,验证TIPE1通过促进caspases表达来发挥促凋亡作用。研究结果:1.TIPE1在卵巢癌组织和细胞系中低表达;TIPE1表达水平与卵巢癌患者预后不良之间存在负相关关系。2.体内及体外实验均证实,TIPE1高表达能够抑制卵巢癌细胞活性和增殖,以及诱导细胞凋亡。3.TIPE1高表达能够抑制颗粒细胞活性和增殖,诱导细胞凋亡。4.TIPE1高表达能促进卵巢癌细胞和颗粒细胞中caspases（3、8和9）的表达,促进细胞凋亡。研究结论:1.TIPE1可作为预测卵巢癌患者不良预后的潜在标记物。2.TIPE1通过促进caspases表达抑制卵巢癌细胞和颗粒细胞增殖。
郭丽[8]（2020）在《RECQL4在浆液性卵巢癌中的生物学功能及其机制研究》文中研究表明卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤,据国际癌症研究机构统计,2018年,全球有295414例卵巢癌新发病例,死亡病例数为184799例,居美国癌症死亡原因的第五位。即使对初始治疗反应良好,70%的患者将在3年内复发,5年生存率不足50%。晚期诊断、高复发率和耐药性是卵巢癌患者高死亡率的主要原因。根据组织学类型,上皮性卵巢癌分为四种常见的亚型:浆液性、子宫内膜样、粘液性和透明细胞性。浆液性卵巢癌是最常见的病理类型,标准治疗为肿瘤细胞减灭术加铂类为基础的联合化疗以及维持治疗。多数铂敏感患者最终会转变成铂耐药,研究表明,DNA修复途径参与了化疗耐药的形成。根据组织学分级,浆液性卵巢癌可分为低级别和高级别两种,不同亚型有不同的分子改变。高级别浆液性卵巢癌最常见的突变基因是TP53,约50%的患者存在同源重组缺陷,NOTCH、RAS/MEK、PI3K和FOXM1信号通路缺陷是其最常见的信号转导途径。低级别浆液性卵巢癌中BRAF和RAS突变频率增加,基因组相对稳定。美国癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）计划发表的卵巢癌全基因组分析结果显示,96%的高级别浆液性肿瘤中存在TP53突变,而其他基因的突变频率远远低于TP53,如BRCA1突变率约为12.5%,PTEN突变率仅有7%。与此相反,基因拷贝数变异反而更为频繁,占比23.1%（113/489）。最常见的卵巢癌驱动基因MYC,CCNE1和MECOM等的拷贝数扩增比例均在20%以上。RECQL4属于DNA解旋酶家族成员,参与调节DNA复制、转录、重组,维持端粒及基因组的稳定性,并广泛参与同源重组、非同源末端连接、碱基切除修复等多种DNA修复途径。研究表明,RECQL4参与多种肿瘤的发生发展,并发挥“双刃剑”功能。RECQL4缺乏导致骨肉瘤或淋巴瘤的发生率增加,相反,在前列腺癌、乳腺癌和肝细胞癌中观察到RECQL4的表达升高。但是,RECQL4在卵巢癌中的表达和生物学功能未见报道。本课题探讨了 RECQL4在浆液性卵巢癌中的表达,生物学功能和临床意义,并进一步分析了 RECQL4高表达的原因。通过阐述RECQL4发挥癌基因作用的关键下游靶基因及上游调控分子,提出了 miR-10a-5p/RECQL4/MAFB轴在浆液性卵巢癌的诊断、发生发展、治疗及预后中起至关重要的作用。具体研究内容包括以下四部分:1.RECQL4在浆液性卵巢癌中的表达、临床意义及生物学功能研究。2.RECQL4对浆液性卵巢癌细胞铂类及PARP抑制剂敏感性的影响。3.浆液性卵巢癌中RECQL4下游靶基因的筛选与功能研究。4.浆液性卵巢癌中RECQL4的上游分子调控机制研究。第一部分RECQL4在浆液性卵巢癌中的表达、临床意义及生物学功能研究研究目的解旋酶RECQL4除参与DNA复制、重组、转录及修复,维持基因组稳定性外,还参与多种恶性肿瘤如前列腺癌、乳腺癌及胃癌的发生发展,并与肿瘤的不良预后有关。本部分基于TCGA及GEO数据库的生物学信息分析结果,拟探讨RECQL4在浆液性卵巢癌及正常输卵管伞组织中的表达差异。通过对组织芯片进行免疫组织化学染色,结合芯片患者的临床数据,评价RECQL4对浆液性卵巢癌的预后及临床病理特征的影响。最后利用体内裸鼠成瘤实验及体外细胞学实验,评估RECQL4的表达对卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移、周期及凋亡等生物学行为的影响。研究内容及方法应用TCGA数据分析高级别浆液性卵巢癌及泛癌中的拷贝数变异情况,以及RECQL4在高级别浆液性卵巢癌中的拷贝数变异情况。进一步应用数据库分析RECQL4的拷贝数变异对其mRNA表达的影响。应用TCGA及GEO数据库,分析RECQL4在浆液性卵巢癌与正常卵巢、输卵管伞组织中的表达差异。使用qRT-PCR检测RECQL4 mRNA在浆液性卵巢癌和正常输卵管伞组织中的表达差异,使用Western Blot检测RECQL4蛋白在卵巢癌细胞系和正常输卵管伞上皮细胞中的表达差异。应用课题组构建的浆液性卵巢癌的组织芯片进行免疫组化染色,明确RECQL4蛋白在浆液性卵巢癌中的表达状况,分析其表达与临床预后的关系,及与临床病理特征的相关性。应用Kaplan-Meier Plotter网站分析RECQL4与浆液性卵巢癌PFS和OS的关系。构建RECQL4稳定过表达及抑制表达的卵巢癌细胞系,通过体外CCK8增殖实验、平板克隆形成实验及体内裸鼠皮下成瘤实验验证RECQL4对卵巢癌细胞增殖的影响,通过体外Transwell实验、划痕实验及体内裸鼠腹腔成瘤能力检测比较RECQL4对卵巢癌细胞侵袭、迁移的影响,通过流式细胞仪检测RECQL4对卵巢癌细胞周期、凋亡的影响。利用Western Blot检测RECQL4对卵巢癌细胞上皮间质转化、细胞周期和细胞凋亡相关蛋白分子的影响。研究结果TCGA数据分析显示100%的高级别浆液性卵巢癌及97.8%的泛癌中均存在基因拷贝数的变异,且两者拷贝数扩增比例前20位的基因,有19个是相同的。RECQL4在27%的高级别浆液性卵巢癌样本中存在异常的拷贝数扩增,RECQL4拷贝数扩增与其mRNA表达呈正相关。TCGA数据分析发现RECQL4在20余种恶性肿瘤中均呈现高表达。GSE26712数据库及TCGA数据库分析显示RECQL4在浆液性卵巢癌中的表达高于正常的卵巢及输卵管伞组织。qRT-PCR检测结果表明RECQL4在高级别浆液性卵巢癌中的表达高于正常的输卵管伞组织。Western Blot检测结果提示RECQL4蛋白在卵巢癌细胞系中的表达明显高于正常输卵管伞上皮细胞。对157例浆液性卵巢癌和54例正常输卵管组织组成的组织芯片进行免疫组化染色的结果显示,高表达RECQL4的患者的总生存期显着低于低表达RECQL4的患者。Kaplan-Meier Plotter网站分析发现RECQL4高表达患者的总生存期及无进展生存期均低于RECQL4低表达患者。RECQL4高表达与患者的血CA125水平、腹水量及网膜转移有关,而与年龄、FIGO分期、淋巴结转移无关。且在铂耐药的卵巢癌患者中,RECQL4表达水平明显高于铂敏感的卵巢癌患者。选择卵巢癌BRCA野生型细胞系A2780、HEY、SKOV3及BRCA缺失型细胞系UWB1.289,构建稳定干扰及过表达RECQL4的细胞系。体外CCK8增殖实验、克隆形成验、Transwell及划痕实验结果显示,过表达RECQL4后,细胞增殖、侵袭、迁移能力明显高于对照组,而干扰RECQL4表达后,细胞增殖、侵袭、迁移能力明显低于对照组。裸鼠皮下成瘤实验及腹腔成瘤能力检测表明,注射高表达RECQL4组细胞裸鼠的皮下成瘤的体积及重量,盆腹腔形成的癌灶转移结节的数目及大小均高于对照组。对上皮间质转化相关蛋白的Western Blot检测发现,干扰 RECQL4 表达后,间质表型标志物 N-cadherin、β-Catenin、Vimentin、Slug、Snail及MMP7的表达下调,而过表达RECQL4后,相应的间质表型标志物显着上调。流式细胞仪进行细胞周期检测显示,干扰RECQL4表达后,卵巢癌A2780、HEY细胞G1期所占比例明显升高,而S期所占比例明显下降。细胞凋亡分析显示,降低RECQL4表达可使早期凋亡及晚期凋亡的卵巢癌细胞数增多。Western Blot对细胞周期相关的蛋白进行检测,抑制RECQL4表达后,CCND1、CCNE1、CDK4、CDK6的表达下降,而可引起细胞周期阻滞的蛋白P21、P27、P53的表达上升,过表达RECQL4具有相反的结果。Western Blot检测细胞凋亡相关蛋白的表达显示,干扰RECQL4表达后,促进凋亡的相关蛋白Bax、Cleaved-caspase9及Cleaved-caspase3显着上调,而促进RECQL4表达后,上述蛋白的表达下调。研究结论RECQL4在浆液性卵巢癌中高表达,与其不良临床预后有关,有望成为浆液性卵巢癌的新型预后标志物。RECQL4促进浆液性卵巢癌的增殖、侵袭及迁移;干扰RECQL4可引起细胞周期G1/S期阻滞,并导致早期凋亡及晚期凋亡细胞数增多,有望成为卵巢癌治疗的新型药物靶点。第二部分RECQL4对浆液性卵巢癌细胞铂类及PARP抑制剂敏感性的影响研究目的上皮性卵巢癌的标准治疗方法为肿瘤细胞减灭术和辅助化疗以及维持治疗,辅助化疗方案首选铂类+紫杉类。尽管80%的卵巢癌患者对一线化疗有良好反应,仍有70%左右的患者将出现复发,且部分铂敏感复发最终会进展为铂耐药复发。PARP抑制剂的临床应用是近年来卵巢恶性肿瘤治疗领域的最大进展之一,已有多种PARP抑制剂获得卵巢癌NCCN指南推荐,但其耐药性问题也逐渐显现。已有证据表明,上皮性卵巢癌中的DNA修复异常参与对化疗的反应性及耐药性。鉴于RECQL4在多个DNA修复途径发挥重要作用,且前期组织芯片的免疫组化染色显示,铂耐药患者中RECQL4的表达明显高于铂敏感患者,本部分旨在通过体外细胞实验,研究RECQL4的表达对浆液性卵巢癌细胞顺铂及奥拉帕利敏感性的影响。研究内容及方法应用Western Blot检测卵巢癌A2780细胞及铂耐药型A2780/DDP细胞中RECQL4的蛋白表达。应用Western Blot检测,卵巢癌细胞中加入不同浓度的顺铂及奥拉帕利后,RECQL4蛋白水平的变化。选取低表达RECQL4的BRCA野生型卵巢癌A2780、HEY、SKOV3稳定转染细胞系及其对照组。并应用RECQL4小干扰RNA对铂耐药型A2780/DDP细胞、BRCA突变型UWB1.289细胞进行瞬时转染,降低RECQL4的表达。对上述获得的卵巢癌细胞,加入不同浓度梯度的顺铂及奥拉帕利。通过CCK8增殖实验检测加入不同浓度梯度顺铂及奥拉帕利后,卵巢癌细胞的生长活力变化;通过平板克隆形成实验检测加入不同浓度梯度顺铂及奥拉帕利后,卵巢癌细胞克隆形成能力的变化,验证RECQL4的表达对卵巢癌细胞顺铂及奥拉帕利的敏感性。研究结果Western Blot检测结果显示,RECQL4在铂耐药型A2780/DDP细胞中的表达显着高于A2780细胞,随着加入顺铂及奥拉帕利浓度的升高,卵巢癌细胞中RECQL4的蛋白表达水平逐渐升高。显微镜下观察细胞生长状态发现,加入顺铂及奥拉帕利后,细胞呈现不同程度的死亡,随着药物浓度升高,死亡细胞数逐渐增多。CCK8增殖实验结果显示,加入不同浓度顺铂及奥拉帕利后,低表达RECQL4的卵巢癌细胞的IC50,明显低于对照组细胞。克隆形成实验表明,随着顺铂及奥拉帕利浓度的升高,细胞形成克隆的数目逐渐减少。在同一药物浓度作用下,低表达RECQL4的细胞形成的克隆数目少于对照组。研究结论卵巢癌细胞中,RECQL4的表达下调对顺铂和奥拉帕利有增敏作用。RECQL4可作为预测浆液性卵巢癌化疗敏感性的生物标志物和潜在的分子治疗靶点。第三部分浆液性卵巢癌中RECQL4下游靶基因的筛选与功能研究研究目的RECQL4蛋白的结构与其他人类RECQ解旋酶不同,有其独特性。目前,尚不清楚RECQL4的哪些功能域影响其在肿瘤中的作用,了解RECQL4的相互作用蛋白对推断其在癌细胞中的功能、深入了解其作用机制、明确其对肿瘤早期诊断和治疗的影响起至关重要的作用。尽管目前已发现RECQL4在不同肿瘤中与TP53、MCM10、survivin等相互作用,但恶性肿瘤具有高度异质性,RECQL4在浆液性卵巢癌中的下游靶基因未完全阐明。本部分旨在通过高通量转录组测序技术,筛选RECQL4在浆液性卵巢癌中发挥癌基因作用的关键下游靶基因,并探讨靶基因在卵巢癌中的生物学功能。研究内容及方法应用RECQL4小干扰RNA瞬时转染卵巢癌A2780细胞,构建降低RECQL4表达的实验组及对照组细胞,提取RECQL4 mRNA,应用qRT-PCR验证转染效率后,进行高通量测序转录组分析（RNAseq）,获取RECQL4在浆液性卵巢癌中可能调控的下游靶基因。应用qRT-PCR验证测序获得的下游靶基因的mRNA水平变化。选取变化明显者,应用TCGA数据库及qRT-PCR分析下游靶基因在浆液性卵巢癌和正常输卵管伞组织中的表达差异。通过qRT-PCR验证浆液性卵巢癌中靶基因mRNA变化与RECQL4 mRNA变化的相关性。应用Western Blot检测RECQL4蛋白变化后,靶基因的蛋白表达情况,最终筛选出目标靶基因进行研究。应用靶基因的小干扰RNA瞬时转染卵巢癌细胞,构建干扰靶基因表达的细胞及对照组细胞,通过CCK8增殖实验及克隆形成实验检测靶基因对卵巢癌细胞的增殖能力的影响,应用Transwell实验对靶基因对卵巢癌细胞侵袭能力的影响进行检测。在稳定高表达RECQL4的卵巢癌细胞及对照组细胞中,应用siRNA干扰靶基因的表达,进行Rescue实验。通过CCK8增殖实验、平板克隆实验及Transwell实验,检测降低靶基因表达后,对RECQL4促进卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响。研究结果高通量测序转录组分析结果显示,差异表达基因共302个,其中表达上调基因179个,表达下调基因123个。选取候选靶基因应用qRT-PCR进行验证,发现干扰 RECQL4 表达后,CBLN2、MAFB、ITGB3、PGPEP1L、GPR78、SKAP2、AHRR、IGFBP3、AREGB的mRNA表达水平均下降。通过TCGA数据分析上述基因在浆液性卵巢癌中的mRNA表达,浆液性卵巢癌中MAFB mRNA的表达明显高于正常输卵管伞中mRNA的表达。qRT-PCR检测显示MAFB在40例浆液性卵巢癌中的表达高于12例正常输卵管伞组织,且MAFB的mRNA表达水平与RECQL4的mRNA表达水平呈现正相关。Western Blot检测表明,卵巢癌细胞中过表达RECQL4后,MAFB蛋白表达上调,而干扰RECQL4表达后,MAFB蛋白表达下调。对MAFB进行细胞学功能实验研究,CCK8增殖实验显示,降低MAFB表达后,卵巢癌细胞的生长速度明显低于对照组。平板克隆形成实验表明,降低MAFB表达后,卵巢癌细胞的克隆形成数目较对照组明显减少。Transwell侵袭实验表明,降低MAFB表达后,卵巢癌细胞的穿膜细胞数明显减少,侵袭能力下降。Rescue实验发现,CCK8增殖实验及平板克隆实验结果显示,降低MAFB的表达,能削弱RECQL4促进卵巢癌细胞的增殖能力。Transwell实验结果表明,干扰MAFB表达能逆转RECQL4过表达引起的卵巢癌细胞侵袭迁移能力增强。研究结论MAFB在浆液性卵巢癌中高表达,并能促进卵巢癌细胞的增殖及转移。干扰MAFB的表达能削弱RECQL4促进卵巢癌细胞的增殖及转移能力。RECQL4在浆液性卵巢癌中通过调控MAFB发挥促癌作用。第四部分浆液性卵巢癌中RECQL4的上游分子调控机制研究研究目的RECQL4通过调控下游靶基因发挥促癌作用的同时,其本身也受到多种因素的调控。本课题第一部分已证实,RECQL4的基因拷贝数扩增可导致其高表达,从而发挥一系列生物学功能。microRNA是一类庞大的非编码RNA家族,在转录后水平负性调控基因的表达。近年来,microRNA在卵巢癌发生发展中的作用越来越受到重视。为探讨RECQL4的上游调控分子,明确RECQL4在浆液性卵巢癌中高表达的原因,本部分通过miRNA预测数据库,筛选可能调控RECQL4表达的上游miRNA,从而为解释RECQL4在卵巢癌中发挥作用的机制提供进一步依据。研究内容及方法借助microRNA靶基因预测数据库TargetScan 7.1和miRDB的在线预测结果,初步选取可能调控RECQL4表达的上游miRNA。应用qRT-PCR检测上游调控分子的mRNA表达水平。Western Blot实验检测卵巢癌细胞中,过表达miRNA后,RECQL4的蛋白水平变化。qRT-PCR实验检测,过表达及抑制miRNA表达后,RECQL4 mRNA水平的变化。数据库TargetScan 7.1查找RECQL4与上游调控分子的可能结合位点,以pmirGLO质粒构建突变型以及野生型载体,实施双荧光素酶报告基因实验,验证选择的miRNA是否与RECQL4直接结合。在稳定高表达RECQL4的卵巢癌细胞及对照组中,瞬时转染mimics过表达上游miRNA,并应用Western Blot进行验证。CCK8增殖实验、平板克隆实验及Transwell实验检测过表达目的miRNA后,对卵巢癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响,同时检测过表达miRNA对RECQL4促进卵巢癌细胞增殖及转移能力的影响。研究结果借助microRNA靶基因预测数据库TargetScan 7.1和miRDB的在线预测结果,初步选取miR-10a-5p作为研究目的分子。qRT-PCR实验表明,浆液性卵巢癌中,miR-10a-5p的表达低于正常输卵管伞组织。Westen Blot 实验显示,卵巢癌细胞中,过表达miR-10a 5p后,RECQL4蛋白的表达水平明显下降。qRT-PCR实验发现,过表达miR-10a-5p后,RECQL4的mRNA表达水平下降,而抑制miR-10a-5p表达引起RECQL4 mRNA水平升高。TargetScan 7.1数据库发现RECQL4的3’ UTR区域存在能与miR-10a-5p直接结合的位点,双荧光素酶报告实验结果显示,转染含有RECQL4 3’ UTR野生型结合位点的pmirGLO载体后,miR-10a-5p过表达组的相对荧光素酶活性较对照组显着下降;将载体上的结合位点突变后,过表达miR-10a-5p组的相对荧光素酶活性较对照组无明显变化。在稳定高表达RECQL4的SKOV3细胞及对照组中,瞬时转染mimics过表达miR-10a-5p。CCK8增殖实验、平板克隆实验、Transwell实验结果显示,过表达miR-10a-5p后,卵巢癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力受到抑制;而且miR-10a-5p的过表达,可使RECQL4促进卵巢癌细胞增殖及转移的能力削弱。研究结论miR-10a-5p在浆液性卵巢癌中表达下调,并能抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移。miR-10a-5p能与RECQL4直接结合,负性调控其表达及生物学功能。本研究的创新性1.本研究系统分析了 RECQL4在浆液性卵巢癌中的表达、临床意义及生物学功能。2.首次研究证实RECQL4表达下调能增强卵巢癌细胞对顺铂和奥拉帕利的敏感性,可作为卵巢癌的潜在分子治疗靶点。3.首次发现在浆液性卵巢癌中RECQL4通过调控MAFB发挥促癌功能。4.首次发现在浆液性卵巢癌中miR-10a-5p可直接负向调控RECQL4的表达,阐明了 RECQL4的异常高表达与其拷贝数扩增及miR-10a-5p有关。本研究的局限性及不足1.本研究仅分析了浆液性卵巢癌中干扰RECQL4的表达,分别对顺铂和奥拉帕利敏感性的影响,未对顺铂和奥拉帕利联合用药的影响进行分析,也缺乏应用体内模型如PDX模型进行的相关验证研究。2.本研究发现RECQL4通过调控MAFB发挥促癌功能,但尚未证明RECQL4蛋白是否对MAFB蛋白有直接的作用。
左英[9]（2020）在《miR-34a-5p靶向PD-L1调控卵巢癌顺铂耐药的机制研究》文中认为卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,在导致女性死亡的所有肿瘤中排第四位。因发病隐匿,无有效的早期发现指标,发病时多为晚期,卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤[1-3]。据2018年统计,全球范围内,新增卵巢癌患者295414例,其中有184799例死亡[4],而我国过去十年卵巢癌发病率上升了 30%。值得注意的是,约75%的患者诊断时已处FIGO的Ⅲ期或Ⅳ期[5]。目前标准的治疗方案为卵巢肿瘤细胞减灭术+以铂类为基础的联合化疗,然而大多数患者会在12-24个月内复发,多死于对化疗药物耐药[6,7]。尽管随着PARP抑制剂的应用,在治疗铂类敏感复发的卵巢癌患者方面,带来了里程碑式的进步,使卵巢癌的治疗有了新的突破[8]。但对于耐药性卵巢癌的治疗仍是目前治疗的难点和研究的热点。因此,探究卵巢癌顺铂耐药的分子机制和克服铂类耐药的难题,对提高卵巢癌患者的生存率有着重要的意义。程序性细胞死亡蛋白受体1（PD-1）作为CD28超家族的主要细胞表面受体,是降低T细胞活化的主要抑制分子之一[9,10]。其主要配体分子PD-L1在抗原呈递细胞上表达,但也在肿瘤细胞上表达[11]。生理状况下,淋巴细胞表面的PD-1可以与其配体PD-L1相结合抑制淋巴细胞功能,从而防止自身免疫损伤[12]。在病理条件下,PD-1/PD-L1信号通路会被激活,肿瘤表面的PD-L1与T细胞表面的PD-1结合进而抑制T细胞的活性,从而逃避T细胞的杀伤,导致肿瘤免疫逃逸。临床研究发现PD-L1的高表达与恶性肿瘤的不良预后有关[13-15]。PD-L1高表达的患者预后明显差于低表达的患者[16]。铂处理可以在非小细胞肺癌细胞中上调PD-L1的表达,而敲低PD-L1可以明显增加非小细胞肺癌细胞对顺铂敏感性[17]。此外,已有文献报道PD-L1的过表达与卵巢癌患者的预后差相关[18]。然而,目前尚无文献报道研究PD-L1在卵巢癌顺铂耐药中的作用及具体机制。MicroRNA（miRNA）是一类大小为20-25个的非编码小RNA分子,可通过沉默或降解其靶点mRNA分子调控基因表达,在多种病理过程扮演重要角色,可与多种靶信使mRNAs的3’UTR相互作用,进而在转录后水平调控基因表达[19]。近年来,随着对肿瘤耐药研究的深入,miRNA参与肿瘤耐药的机制受到研究人员的广泛关注[20,21]。miR-34a-5p被报道在多种肿瘤组织异常表达,参与肿瘤进展,如在人上皮性卵巢癌中被下调[22];在成人神经管细胞瘤、膀胱癌、卵巢癌细胞中上调miR-34a-5p可以增加顺铂敏感性[23-25]。PD-L1在非小细胞肺癌和急性髓细胞白血病中被证明是miR-34a-5p的靶基因,过表达miR-34a-5p有效负性调控PD-L1的表达[26,27]。卵巢癌中miR-34a-5p是否通过影响PD-L1的表达参与调控卵巢癌对顺铂敏感性,目前尚无报道,有待进一步证实。本研究以此为切入点,从以下三个方面进行研究。第一部分通过临床组织标本及卵巢癌细胞实验检测PD-L1在化疗耐药卵巢组织和耐药细胞中高表达,得到其参与调控卵巢癌顺铂耐药。第二部分在顺铂耐药卵巢癌细胞中,检测发现miR-34a-5p表达降低,过表达miR-34a-5p能有效抑制PD-L1的表达,增加细胞对顺铂的敏感性,双荧光素酶报告基因实验证实两者存在靶向调控关系。第三部分通过裸鼠成瘤体内实验进一步验证,沉默miR-34a-5p能显着促进肿瘤体内生长,使PD-L1的表达升高,得出miR-34a-5p负性调控PD-L1的表达。第一部分PD-L1在卵巢癌组织表达及其在卵巢癌顺铂耐药细胞中的作用研究目的:检测PD-L1在卵巢良性肿瘤组织、化疗敏感卵巢癌组织及耐药卵巢癌组织中的表达差异,以及在卵巢癌细胞株SKOV3、A2780和顺铂耐药卵巢癌细胞（SKOV3/DDP、A2780/DDP）的表达差异;并探讨PD-L1的表达对细胞增殖、周期和凋亡及化疗敏感性的影响。研究方法:1.收集卵巢良性肿瘤组织、化疗敏感卵巢癌组织及化疗耐药卵巢癌的组织的病理切片及临床资料为研究对象,采用免疫组化检测PD-L1蛋白表达水平,RT-qPCR检测卵巢良性肿瘤组织、化疗敏感卵巢癌组织及化疗耐药卵巢癌的组织中PD-L1 mRNA表达水平,分析PD-L1在化疗敏感卵巢癌患者和化疗耐药卵巢癌患者中表达差异,并探讨其临床意义。2.选取卵巢癌细胞株SKOV3、A2780,通过连续梯度增加顺铂（DDP）浓度培养,构建卵巢癌DDP耐药细胞株（SKOV3/DDP、A2780/DDP）。使用不同浓度DDP处理,MTT实验检测卵巢癌细胞株SKOV3、A2780和DDP耐药细胞株（SKOV3/DDP、A2780/DDP）的增殖活力并计算IC50值。3.分别采用RT-qPCR和Western blot检测卵巢癌细胞株SKOV3、A2780和DDP耐药细胞株（SKOV3/DDP、A2780/DDP）中PD-L1表达水平。4.构建shRNA-PD-L1质粒并转染细胞,检测敲降PD-L1后DDP耐药细胞的生物学性能。使用含不同浓度DDP培养,MTT实验检测PD-L1敲降后细胞的增殖活力;流式细胞术测定细胞周期的变化和凋亡率的改变。5.Western blot检测PD-L1敲降后与细胞周期、凋亡和耐药等相关蛋白的表达变化。研究结果:1.PD-L1在卵巢肿瘤组织的表达水平:免疫组化结果显示,PD-L1在耐药卵巢癌组织中的表达量明显高于化疗敏感组和卵巢良性肿瘤组。RT-qPCR检测结果表明,与卵巢良性肿瘤组织相比,PD-L1 mRNA在化疗敏感卵巢癌组织和化疗耐药卵巢癌组织中均表达上调,其中化疗耐药卵巢癌组织中PD-L1的表达量高于化疗敏感卵巢癌组织。这提示,PD-L1在癌组织高表达可能参与卵巢癌耐药。2.本研究成功建立了顺铂（DDP）耐药卵巢癌细胞株（SKOV3/DDP、A2780/DDP）。MTT检测结果显示,顺铂耐药细胞株的增殖活力高于亲本株,且IC50值较亲本株也增高。3.RT-qPCR和Western blot检测结果均表明在DDP耐药卵巢癌细胞中PD-L1表达上调。4.敲降PD-L1对耐药细胞SKOV3/DDP、A2780/DDP的影响:转染shRNA-PD-L1显着抑制了耐药卵巢癌细胞对DDP的耐药,相同浓度的DDP作用下,降低了 DDP耐药细胞株的增殖活力,也降低了耐药细胞株的IC50值,促进了G1期细胞周期阻滞,提高了耐药细胞株的凋亡率。5.Western blot检测显示,在DDP存在的情况下,敲降PD-L1后降低了耐药细胞中多药耐药蛋白1（MDR1）和细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的表达水平,并显着增加了 cleaved-caspase-3和cleaved-PARP蛋白在耐药细胞中的表达。研究结论:PD-L1在卵巢癌耐药患者组织和SKOV3/DDP、A2780/DDP细胞中高表达,参与调控SKOV3/DDP、A2780/DDP对顺铂的耐药。第二部分miR-34a-5p通过靶向PD-L1调控卵巢癌细胞耐药作用研究目的:探讨miR-34a-5p与PD-L1的靶向关系,研究miR-34a-5p通过调控PD-L1表达影响SKOV3/DDP、A2780/DDP对DDP耐药的作用机制。研究方法:1.采用RT-qPCR检测卵巢癌细胞株SKOV3、A2780和顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP、A2780/DDP 中 miR-34a-5p 的表达水平。2.构建 miR-34a-5p mimic 和 miR-34a-5p inhibitor 表达质粒,分别转染到SKOV3/DDP、A2780/DDP 细胞和 SKOV3、A2780 细胞使 miR-34a-5p 过表达或沉默,RT-qPCR检测miR-34a-5p验证转染效率,分别采用RT-qPCR及Western blot检测PD-L1表达水平变化。3.构建PD-L1 mRNA3’-UTR双荧光素酶报告基因质粒及其点突变质粒,分别与miR-34a-5p mimc混合共转染293T细胞检测荧光素酶活性变化验证miR-34a-5p与PD-L1靶向调控关系。4.将miR-34a-5p mimic和PD-L1过表达载体分别转染或共转染SKOV3/DDP细胞形成不同处理的SKOV3/DDP细胞,使用DDP培养后,MTT实验检测各组细胞的增殖活力;PI染色后Flow cytometry测定细胞周期的变化和Annexin V-FITC/PI试剂盒染色后Flow cytometry测定凋亡率的改变。5.将miR-34a-5p mimic和PD-L1过表达载体分别转染或共转染SKOV3/DDP细胞形成不同处理的SKOV3/DDP细胞,使用DDP培养,Western blot检测PD-L1及耐药基因（MDR1）、细胞周期蛋白（Cyclin D1）和凋亡（cleaved-caspase-3和cleaved-PARP）蛋白的表达水平。研究结果:1.与 SKOV3、A2780 细胞相比,miR-34a-5p 在 SKOV3/DDP、A2780/DDP细胞中显着低表达。2.RT-qPCR及Western blot检测结果均显示,当在细胞中转染miR-34a-5p mimic时,PD-L1表达降低;当转染miR-34a-5p inhibitor时,PD-L1表达升高,差异均具有统计学意义。3.双荧光报告基因实验结果显示PD-L1是miR-34a-5p的靶基因,miR-34a-5p靶向负性调控PD-L1的表达。4.MTT检测结果显示,过表达miR-34a-5p mimic降低了 DDP培养的SKOV3/DDP细胞增殖活力,IC50值降低;同时过表达PD-L1逆转miR-34a-5p mimic对SKOV3/DDP细胞增殖的抑制作用,且IC50值也显着升高。5.流式细胞术检测细胞周期,结果显示过表达miR-34a-5p抑制DDP培养的SKOV3/DDP细胞周期,G1期细胞百分率增多,S期和G2期细胞百分率相应的减少;同时过表达PD-L1逆转miR-34a-5p mimic对细胞周期的抑制作用,使G1期细胞百分率降低,S期和G2期细胞百分率增加。6.流式细胞术检测细胞的凋亡,结果显示,过表达miR-34a-5p促进DDP培养的SKOV3/DDP细胞凋亡,同时过表达PD-L1逆转细胞的凋亡,使凋亡率下降。7.Western blot 检测结果表明 MDR1、Cyclin D1 表达降低,cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的表达升高;同时过表达PD-L1逆转了 miR-34a-5p mimic对细胞凋亡的诱导作用及对 MDR1、Cyclin D1、cleaved-caspase-3 和 cleaved-PARP的蛋白水平的调控作用。研究结论:miR-34a-5p通过靶向下调PD-L1逆转了 SKOV3/DDP对顺铂的耐药。第三部分miR-34a-5p靶向PD-L1调控卵巢癌顺铂耐药的体内实验研究研究目的:通过体内实验,探讨miR-34a-5p靶向下调PD-L1增强SKOV3/DDP对DDP敏感性作用机制。研究方法:1.构建miR-34a-5p稳定过表达或表达沉默质粒,转染SKOV3/DDP细胞,RT-qPCR检测miR-34a-5p表达验证转染效率,Western blot检测转染后SKOV3/DDP细胞中PD-L1的蛋白表达水平。2.选取4周龄健康的BALB/c裸鼠,将裸鼠分为5组,每组10只。将转染后的各组SKOV3/DDP细胞悬液注射到裸鼠右侧腋窝皮下组织,建立裸鼠移植瘤模型,测量肿瘤体积,注射细胞量为1×106个,观察并测量肿瘤生长情况。3.当肿瘤达到一定体积时（50 mm3）,以2.0 mg/kg顺铂腹腔内注射4周,每3天注射一次,从注射顺铂开始后,第6天开始测量肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线。实验裸鼠处死后,检测裸鼠成瘤体积大小、重量。4.提取每组裸鼠肿瘤组织,采用TUNEL法染色检测细胞凋亡水平,RT-qPCR法检测miR-34a-5p和PD-L1 mRNA的表达,Western blot法检测PD-L1以及与细胞周期、凋亡和耐药等相关蛋白的表达变化。研究结果:1.成功建立miR-34a-5p稳定过表达或表达沉默SKOV3/DDP细胞,Western blot检测转染后各组细胞,过表达miR-34a-5p后SKOV3/DDP细胞中PD-L1的蛋白表达下调,沉默miR-34a-5p后SKOV3/DDP细胞中PD-L1的蛋白表达上调。2.构建裸鼠卵巢癌移植瘤模型,裸鼠成瘤实验结果表明,与其他4组相比,过表达miR-34a-5p后增加移植瘤对DDP的敏感性,肿瘤生长速度降低,体积减少,质量减轻。miR-34a-5p表达沉默促进肿瘤体内生长,增强对DDP的耐药性。3.TUNEL染色结果也表明,过表达miR-34a-5p显着促进了移植瘤组织细胞的凋亡。但沉默miR-34a-5p的效果与此相反。4.过表达miR-34a-5p显着降低了裸鼠肿瘤组织中PD-L1、MDR1、CyclinD1和Bc12的表达,并促进了 Bax、cytochrome C的表达。而miR-34a-5p表达沉默移植瘤组织 PD-L1、MDR1、CyclinD1 和 Bcl2 的表达升高,Bax、cytochrome C的表达降低。研究结论:miR-34a-5p通过靶向沉默PD-L1增强裸鼠卵巢癌皮下移植肿瘤对顺铂的敏感性。本文的创新点1.本研究发现PD-L1在耐药卵巢癌患者组织标本中表达上调,与卵巢癌化疗耐药相关。2.通过卵巢癌耐药细胞和动物模型实验,证实miR-34a-5p可逆转卵巢癌耐药。3.miR-34a-5p靶向负性调控PD-L1,miR-34a-5p/PD-L1分子轴可作为卵巢癌顺铂耐药临床治疗的潜在靶标。
杨宏毅[10]（2020）在《TNKS1通过Wnt/β-catenin信号通路调控卵巢癌发生发展的作用与机制》文中认为研究背景卵巢癌作为妇科生殖系统三大恶性肿瘤之一,临床起病隐匿,缺乏有效早期诊断指标,容易复发和转移,化疗极易产生耐药性,而放疗大多不敏感,预后差。因此,深入研究卵巢癌发生发展的分子机理,对于寻找有效早期诊断指标、预后判断指标和基因靶向治疗具有重大指导意义。端锚聚合酶（tankyrase,TNKS）属于聚ADP-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase,PARP）蛋白家族,可与端粒酶重复绑定序列结合。人类TNKS1基因在第8号染色体p23.1上,作为调控端粒长度的关键因子在多种疾病中发挥重要作用,与多种恶性肿瘤的发生发展关系密切,与卵巢癌的关系尚不清楚。Wnt/β-catenin信号传导通路在恶性肿瘤的发生和发展中起重要作用,同时研究证实TNKS对Wnt信号通路进行正调控。本文率先系统地研究了 TNKS1通过调控Wnt/β-catenin信号传导通路来影响卵巢癌发生发展的相关机制。研究目的本研究从临床样本、细胞水平、动物模型以及分子机制层面,系统立体研究TNKS1在卵巢癌发生发展中的作用及机制,为卵巢癌诊疗提供理论依据。研究材料和方法1.采用q-PCR、免疫组化和Western blot技术研究TNKS1在卵巢癌组织中的表达。2.采用MTS法、细胞集落形成、裸鼠皮下移植瘤实验研究TNKS1对卵巢癌细胞增殖与成瘤的影响。3.采用MTS法和凋亡实验研究TNKS1表达改变对卵巢癌细胞药物敏感性的影响。4.采用细胞划痕实验和Transwell转移小室实验研究TNKS1在卵巢癌迁移与侵袭中的作用。5.采用葡萄糖摄取、乳酸分泌、ATP生成以及线粒体氧耗率研究TNKS1在卵巢癌细胞有氧糖酵解中的作用。6.采用Western blot技术及细胞转染法研究TNKS1参与卵巢癌发生发展的分子调控机制。7.应用SPSS 21.0进行统计分析,实验结果以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.TNKS1在卵巢癌组织中的表达高于癌旁组织及正常卵巢组织,且与卵巢癌患者的病理分级和肿瘤大小密切相关。2.敲低或抑制TNKS1显着抑制卵巢癌细胞增殖、细胞集落形成、体内成瘤及细胞周期进展,并有效提高卵巢癌细胞对常用化疗药物敏感性,显着抑制其迁移和侵袭能力;同时通过降低丙酮酸羧化酶表达降低卵巢癌细胞的糖代谢,提高线粒体耗氧率。3.敲低或抑制TNKS1通过抑制Wnt/β-catenin信号通路,进而下调Snail、PC、CyclinD、MDR、MMP-9 等 Wnt/β-catenin 信号通路靶蛋白的表达。TNKS1、Snail和PC在临床卵巢癌组织中表达两两之间呈正相关。结论TNKS1在卵巢癌组织中高表达,具有一定的临床意义。TNKS1可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路活性进而促进卵巢癌生长与成瘤、迁移与侵袭和降低药物敏感性;并通过β-catenin/Snail/PC信号轴促进卵巢癌细胞的有氧糖酵解。TNKS1在卵巢癌发生发展中发挥重要作用,可作为卵巢癌潜在的早期诊断指标、判断预后指标或靶向基因治疗靶点。
二、ZNF191 mRNA在卵巢恶性肿瘤中的表达及临床意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、ZNF191 mRNA在卵巢恶性肿瘤中的表达及临床意义（论文提纲范文）
（1）NUPR1在卵巢癌发生发展中的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明及缩略语表 |
| 前言 |
| 第一部分 :NUPR1蛋白在卵巢癌组织中的表达及其对患者生存率的影响 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 研究结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 第二部分 :NUPR1在卵巢癌细胞中的分子生物学功能的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 研究结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 第三部分 :NUPR1在卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移中的分子机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 研究结论 |
| 附图 |
| 创新性与不足之处 |
| 参考文献 |
| 中文综述 NUPR1的功能研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
（2）m6A阅读蛋白YTHDC2在卵巢癌中的表达及其临床意义（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 m6A修饰在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（3）转录因子ZNF703影响卵巢癌恶性生物学行为的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 ZNF703在卵巢癌中的表达对卵巢癌细胞侵袭和转移的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 标本来源 |
| 2.1.2 细胞系 |
| 2.1.3 主要材料 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 免疫组化 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 慢病毒转染 |
| 2.2.4 SiRNA转染 |
| 2.2.5 qRT-PCR |
| 2.2.6 Western Blot |
| 2.2.7 MTT实验 |
| 2.2.8 细胞凋亡实验 |
| 2.2.9 细胞周期实验 |
| 2.2.10 细胞迁移实验 |
| 2.2.11 细胞侵袭实验 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 卵巢癌组织中ZNF703的表达情况及临床意义 |
| 3.2 ZNF703过表达促进卵巢癌细胞的增殖、抑制细胞凋亡和细胞周期阻滞 |
| 3.3 ZNF703过表达促进卵巢癌细胞的侵袭和转移 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 HE4对ZNF703蛋白亚细胞定位及功能的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要材料 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.3 免疫共沉淀 |
| 2.2.4 细胞免疫荧光共聚焦 |
| 2.2.5 核浆蛋白分离实验 |
| 2.2.6 MTT实验 |
| 2.2.7 细胞侵袭实验 |
| 2.2.8 细胞迁移实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫共沉淀检测ZNF703与HE4的结构关系 |
| 3.2 ZNF703与HE4的表达相关性 |
| 3.3 HE4促进ZNF703核易位 |
| 3.4 HE4对ZNF703促进的恶性生物学行为的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 ZNF703转录调节PEA15促进卵巢癌增殖 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要材料 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 染色质免疫共沉淀测序 |
| 2.2.3 ChIP-PCR |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶水平电泳 |
| 2.2.5 荧光素酶报告基因 |
| 2.2.6 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 2.2.7 石蜡包埋、切片及染色 |
| 3 结果 |
| 3.1 ChIP-seq检测ZNF703 的调节靶点 |
| 3.2 ZNF703 直接结合PEA15 的启动子区促进PEA15 的转录 |
| 3.3 PEA15 在卵巢癌组织中的表达及预后意义 |
| 3.4 HE4 对PEA15 的表达及磷酸化的影响 |
| 3.5 体内实验证明ZNF703 通过调节PEA15 促进卵巢癌增殖 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 锌指蛋白703的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）LRG1在乳腺癌中表达的临床意义及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 LRG1 在不同肿瘤中的表达及临床意义的生物信息学分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 乳腺癌组织中LRG1 蛋白表达与临床特征及生存预后的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 LRG1 在乳腺癌细胞中的表达及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 LRG1在恶性肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）TIM-3在上皮性卵巢癌发生及其临床预后中的意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 TIM-3在上皮性卵巢癌组织中的表达及其预后关系的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 TIM-3对卵巢癌细胞侵袭转移的影响及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 TIM-3基因多态性与上皮性卵巢癌遗传易感性及临床预后的关联研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 TIM-3与肿瘤发生发展关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）m6A机制调控子宫内膜癌转移与进展的分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 FTO通过m6A-HOXB13-WNT机制促进子宫内膜癌转移 |
| 背景 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 1. 组织样本 |
| 2. 实验仪器与设备 |
| 3. 主要试剂与耗材 |
| 4. 科研服务 |
| 二、实验方法 |
| 1. 组织与细胞样本RNA提取 |
| 2. RNA逆转录 |
| 3. 实时荧光定量PCR |
| 4. 免疫组织化学 |
| 5. 细胞培养 |
| 6. 细胞核-质分离 |
| 7. Western blotting |
| 8. 慢病毒包装,感染与稳转株筛选 |
| 9. 质粒、siRNA合成与转染 |
| 10. WNT信号通路抑制 |
| 11. 划痕实验 |
| 12. Transwell小室实验 |
| 13. RNA结合蛋白免疫沉淀测序与定量PCR实验(RIP-seq/PCR) |
| 14. mRNA纯化(从肿瘤细胞中直接提取纯化) |
| 15. mRNA纯化(从总RNA样品中纯化提取) |
| 16. m6A水平检测 |
| 17. 甲基化RNA免疫沉淀测序与定量PCR实验(MeRIP-seq/PCR) |
| 18. 转录组测序(RNA-seq) |
| 19. RNA pull-down实验 |
| 20. 双荧光素酶报告基因实验 |
| 21. mRNA降解速率分析 |
| 22. 动物实验 |
| 23. 二代测序数据分析 |
| 24. 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 一、FTO在子宫内膜癌的转移病灶中表达增高 |
| 二、FTO促进子宫内膜癌细胞的转移与侵袭 |
| 三、FTO去除HOXB13 mRNA中3'UTR区的m6A修饰 |
| 四、YTHDF2识别HOXB13 mRNA中m6A修饰促进mRNA降解 |
| 五、HOXB13促进子宫内膜癌细胞的侵袭和转移 |
| 六、HOXB13通过激活WNT信号通路促进细胞的侵袭与转移 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: IGF2BP1通过m6A依赖的方式促进PEG10的表达,促进子宫内膜癌细胞周期进展 |
| 背景 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 1. 组织样本 |
| 2. 实验仪器与设备 |
| 3. 主要试剂与耗材 |
| 4. 科研服务 |
| 二、实验方法 |
| 1. 细胞增殖实验 |
| 2. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU)检测 |
| 3. 细胞周期检测 |
| 4. 免疫荧光 |
| 5. 蛋白质免疫沉淀 |
| 6. CUT&Tag测序 |
| 7. ChIP-PCR实验 |
| 8. 测序数据分析 |
| 9. 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 一、IGF2BP1的高表达与子宫内膜癌患者的临床预后不良有关 |
| 二、IGF2BP1促进子宫内膜癌细胞增殖,加速细胞周期进展 |
| 三、IGF2BP1通过m6A依赖方式识别PEG10 mRNA |
| 四、IGF2BP1促进PEG10 mRNA的稳定性及表达 |
| 五、PABPC1蛋白与IGF2BP1蛋白协同稳定PEG10 mRNA |
| 六、PEG10促进子宫内膜癌细胞增殖,并与患者不良预后有关 |
| 七、PEG10蛋白抑制肿瘤细胞周期相关基因的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 m6A修饰在妇科肿瘤中的研究进展 |
| 背景 |
| m6A写入,擦除与读取 |
| 妇科肿瘤研究的意义 |
| 妇科肿瘤中的整体m6A修饰水平 |
| 卵巢癌 |
| 子宫内膜癌 |
| 宫颈癌 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表论文 |
（7）TIPE1表达促凋亡机制对卵巢癌和颗粒细胞的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 TIPE1在卵巢癌组织和细胞中的表达 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 TIPE1对卵巢癌细胞功能的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结纶 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 TIPE1对卵巢颗粒细胞功能的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 TIPE 1促进caspases表达的促凋亡机制 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 在读期间发表文章 |
| 综述一 TIPE1在卵巢癌的研究进展及展望 |
| 5 参考文献 |
| 综述二 卵巢颗粒细胞与雌激素对女性生育力的影响 |
| 5 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
（8）RECQL4在浆液性卵巢癌中的生物学功能及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 RECQL4在浆液性卵巢癌中的表达、临床意义及生物学功能研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 第二部分 RECQL4对浆液性卵巢癌细胞铂类及PARP抑制剂敏感性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 第三部分 浆液性卵巢癌中RECQL4下游靶基因的筛选与功能研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 第四部分 浆液性卵巢癌中RECQL4的上游分子调控机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间科研成果 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1. RECQL4, Negatively Regulated by miR-10a-5p, Facilitates Cell proliferationand Invasion via MAFB in Ovarian Cancer |
| 外文论文2. Comparison of the Cook vaginal cervical ripening balloon with prostaglandin E2insert for induction of labor in late pregnancy |
（9）miR-34a-5p靶向PD-L1调控卵巢癌顺铂耐药的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 PD-L1在卵巢癌组织表达及其在卵巢癌顺铂耐药细胞中的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 miR-34a-5p通过PD-L1靶向调控卵巢癌细胞耐药作用 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 miR-34a-5p靶向PD-L1对裸鼠体内成瘤的作用研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表学术论文 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（10）TNKS1通过Wnt/β-catenin信号通路调控卵巢癌发生发展的作用与机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1. 卵巢癌临床研究概况 |
| 1.1 卵巢癌发病流行病学研究进展 |
| 1.2 卵巢癌诊断研究进展 |
| 1.3 卵巢癌治疗研究进展 |
| 2. TNKS研究背景 |
| 2.1 TNKS生物学特性 |
| 2.2 TNKS生物学功能 |
| 2.3 TNKS1介导Wnt通路与恶性肿瘤关系的研究进展 |
| 3. 研究内容和科学意义 |
| 3.1 研究内容 |
| 3.2 科学意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 临床标本 |
| 1.2 细胞系 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 试剂与配置 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 TNKS1敲低细胞模型建立 |
| 2.3 免疫组织化学染色 |
| 2.4 实时荧光定量 |
| 2.5 免疫印迹(Western blot)检测 |
| 2.6 细胞生长实验(MTS) |
| 2.7 细胞集落形成实验 |
| 2.8 细胞迁移与侵袭实验 |
| 2.9 流式细胞学 |
| 2.10 葡萄糖摄取实验 |
| 2.11 乳酸分泌实验 |
| 2.12 细胞ATP检测 |
| 2.13 双荧光素酶报告基因分析 |
| 2.14 裸鼠皮下移植瘤实验 |
| 2.15 统计分析 |
| 第三章 结果 |
| 1. TNKS1在卵巢癌组织的表达及其临床意义 |
| 1.1 网络数据库TNKS在卵巢癌中的表达 |
| 1.2 临床资料 |
| 1.3 TNKS1在卵巢癌组织中的表达 |
| 1.4 TNKS1在卵巢癌组织中高表达的临床意义 |
| 2. TNKS1促进卵巢癌细胞的体内外增殖 |
| 2.1 TNKS1敲低细胞模型建立 |
| 2.2 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞体外生长的影响 |
| 2.3 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞周期的影响 |
| 2.4 敲低TNKS1对卵巢癌细胞体内成瘤的影响 |
| 3. TNKS1与卵巢癌耐药性的关系 |
| 3.1 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞药物敏感性的影响 |
| 3.2 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞凋亡的影响 |
| 4. TNKS1促进卵巢癌细胞的迁移与侵袭 |
| 4.1 细胞划痕修复法检测TNKS1对卵巢癌细胞迁移的影响 |
| 4.2 转移小室法检测TNKS1对卵巢癌细胞迁移与侵袭的影响 |
| 5. TNKS1促进卵巢癌细胞的有氧糖酵解 |
| 5.1 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞葡萄糖摄取的影响 |
| 5.2 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞乳酸分泌的影响 |
| 5.3 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞ATP生成的影响 |
| 5.4 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞耗氧率的影响 |
| 6. TNKS1通过调控PC表达介导卵巢癌细胞有氧糖酵解 |
| 6.1 抑制或敲低TNKS1对卵巢癌细胞丙酮酸羧化酶表达的影响 |
| 6.2 TNKS1通过PC介导卵巢癌细胞有氧糖酵解 |
| 7. TNKS1通过激活Wnt/β-catenin/snail信号通路调控卵巢癌发生发展 |
| 7.1 敲低或抑制TNKS1显着抑制Wnt/β-catenin信号通路 |
| 7.2 TNKS1对Wnt/β-catenin信号通路多个靶基因的调控 |
| 7.3 TNKS1通过调控Snail表达而影响PC的表达 |
| 8. TNKS1与Snail、PC蛋白在临床组织表达的相关性分析 |
| 第四章 讨论 |
| 1. TNKSI在卵巢癌中高表达及其临床意义 |
| 2. TNKS1促进卵巢癌细胞快速增殖 |
| 3. TNKS1介导卵巢癌细胞耐药性产生 |
| 4. TNKS1促进卵巢癌细胞转移 |
| 5. TNKS1促进卵巢癌细胞有氧糖酵解 |
| 6. TNKS1调控卵巢癌发生发展的分子机制 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 主要缩略语表 |
| 博士期间科研成果 |
| 致谢 |
四、ZNF191 mRNA在卵巢恶性肿瘤中的表达及临床意义（论文参考文献）
- [1]NUPR1在卵巢癌发生发展中的作用及分子机制研究[D]. 余江涛. 山东大学, 2021(12)
- [2]m6A阅读蛋白YTHDC2在卵巢癌中的表达及其临床意义[D]. 王鑫鑫. 昆明医科大学, 2021
- [3]转录因子ZNF703影响卵巢癌恶性生物学行为的机制研究[D]. 王爽. 中国医科大学, 2021(02)
- [4]LRG1在乳腺癌中表达的临床意义及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响[D]. 张彦收. 河北医科大学, 2021(02)
- [5]TIM-3在上皮性卵巢癌发生及其临床预后中的意义[D]. 吴建磊. 河北医科大学, 2021(02)
- [6]m6A机制调控子宫内膜癌转移与进展的分子机制研究[D]. 张林. 北京协和医学院, 2021(02)
- [7]TIPE1表达促凋亡机制对卵巢癌和颗粒细胞的影响[D]. 李婷婷. 南方医科大学, 2020(06)
- [8]RECQL4在浆液性卵巢癌中的生物学功能及其机制研究[D]. 郭丽. 山东大学, 2020(04)
- [9]miR-34a-5p靶向PD-L1调控卵巢癌顺铂耐药的机制研究[D]. 左英. 山东大学, 2020(09)
- [10]TNKS1通过Wnt/β-catenin信号通路调控卵巢癌发生发展的作用与机制[D]. 杨宏毅. 南方医科大学, 2020(01)