一、人源抗HBs基因工程抗体在E.coli中的高效表达与折叠（论文文献综述）
周兵[1]（2018）在《快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究》文中研究指明感染性疾病是指由细菌、病毒等致病微生物侵袭人体,进而引起机体所发生的一系列具有感染性临床症状的疾病,严重威胁着人类的生命及健康。近年来,抗感染的抗体药物研究发展十分迅速,目前,已经有25种抗感染的抗体药物正在进行临床研究。HBV感染可以导致慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌等疾病,全世界每年约有88万人死于急性或慢性HBV感染。尽管现有预防性疫苗已显着减少了新发HBV感染,全球仍有3亿的慢性HBV感人者需要得到有效的治疗,以预防该病的并发症。当前FDA批准用于慢乙肝治疗的药物有两大类,干扰素和核苷类似物,分别通过调节宿主免疫和抑制病毒的复制从而起到抗病毒的效果。现有的药物虽有着很强的安全性和抗病毒活性,但治疗效果十分有限。这些药物HBsAg的阴转率都不足5%,无法实现临床治愈。因此,需要开发更有效的新药物,以改善HBV相关疾病的临床管理。尽管全人源抗体技术的发展极大增加了全人源抗体成为临床候选株的数量,但FDA批准的大部分治疗性抗体药物仍然以人源化抗体为主。抗体人源化技术主要包括CDR移植（常用噬菌体展示等抗体库技术）、表面重塑、链替换以及计算机辅助设计等,但是现有技术存在改造后人源化抗体亲和力降低、具有较大的免疫原性、工作量大、筛选不可视以及与转换成完整抗体活性不一致等问题,这些都延长了抗体人源化的时间,因此发展新的快速人源化方法势在必行。本研究旨在建立快速点突变抗体人源化新方法,实现快速获得人源化程度高、保持亲本鼠抗活性的人源化抗体。并利用该方法对HBV鼠抗E6F6进行人源化改造,获得有临床治疗潜力的人源化抗体。本研究分为两部分,第一部分是快速点突变抗体人源化平台的建立。通过对CDR划分方法、人源化模板选择方法的比较和分析,确定结合采用Kabat和Contact定义CDR区域,并选择同源性最高的人胚系基因作为模板。通过对现有大量上市或者临床试验中抗体序列和结构的分析以及一些前期人源化改造工作经验总结,抗体序列中每个氨基酸的位置和功能是有一定的规律可寻的。总结规律包括:（1）FR中有些氨基酸存在于CDR接触面上,直接或间接参与抗体与抗原的结合或者对维持抗体CDR构象具有重要的作用,突变时通常选择保留;（2）有些FR残基存在于VH-VK的交界面上,突变时通常选择保留;（3）还有些FR残基属于抗体序列中内部包埋的氨基酸,突变时选择性保留;（4）最后剩下的FR残基就是对抗体活性影响很小的氨基酸,可以直接突变。不管是属于哪一种功能的FR残基,它的位置是相对固定的。12G6是本实验室筛选获得的一株能高效中和乙型流感病毒（Flu-B）的具有广谱性的鼠源单克隆抗体,我们首先分别对它的轻重链可变区进行Kabat编号,然后按照Kabat和Contact定义的CDR区域划分CDR。再利用IMGT网站搜索比对,找出同源性最高的2-3条人胚系基因,进行序列比对。最后根据上述总结的氨基酸规律,对和胚系基因FR中存在的差异氨基酸进行选择性突变,共设计4条重链和4条轻链,分别将其两两互搭进行真核表达,以亲本鼠抗为对照,检测16株人源化抗体的表达情况、结合活性、中和活性等生物学功能。最终,针对12G6,我们挑选出7株优势的人源化抗体。发现在2个不同亚系的乙型流感病毒HA蛋白的结合实验、中和实验和HI实验中,7株人源化抗体保留了 12G6的生物学活性。5B11和7G5是本实验室筛选获得的两株能同时高效中和A/B型呼吸道合胞病毒（RSV）的鼠源单克隆抗体。根据12G6的实验结果,分别对5B11和7G5各设计一种人源化方案,获得N-5B11和N-7G5两株人源化抗体。两株人源化抗体均显示出良好的反应活性和中和活性,且活性与亲本相当。至此我们针对12G6、5B11和7G5三株鼠抗的人源化改造初步完成,验证了改造方案的可行性,完成快速点突变抗体人源化平台的构建。本研究第二部分是利用第一部分建立的新的人源化平台对乙型肝炎病毒鼠抗E6F6人源化,并对获得的人源化抗体进行性质验证及成药性评估。E6F6是本实验室筛选获得的一株针对HBV外膜蛋白（HBsAg）上一个特定表位的鼠源单克隆抗体;它能够有效并持久地清除转基因小鼠体内的HBV和HBsAg,具有发展成为HBV治疗性抗体的潜力。在前期研究中,我们利用噬菌体展示技术对其进行了人源化及亲和力成熟,成功获得了人源化程度为89%,体内外活性与鼠抗相当的人源化抗体162。本研究利用BIAcoreT200对162进行了亲和力测定,其亲和力为4.18×10-10M。通过对162 Fab的晶体培养及结构解析,获得了 162晶体三维结构。将162与HBsAg表位短肽进行对接,得到抗原-抗体相互作用的重要氨基酸。为了验证第一部分所建立的人源化平台的可行性及提高抗体的人源化程度,本研究第二部分利用第一部分中建立的快速点突变抗体人源化平台,结合162氨基酸序列、162晶体结构、与HBsAg短肽对接数据及Discovery Studio模拟平台,对E6F6进行人源化改造,获得3株人源化抗体,huAb1、huAb2和huAb3。在CHO-S细胞中瞬时表达和纯化,并从抗体的均一性、与抗原反应性、中和活性、体内病毒清除效果、成药性评估等方面进行综合分析。huAb1、huAb2和huAb3的人源化程度高达97%,体外结合及中和活性与162相当,但是在HBV转基因小鼠体内持续清除HBsAg的能力有所下降。C57b1/6小鼠体内发现人源化程度为97%的huAb1清除速率较快。说明人源化程度高的抗体在异源小鼠动物模型中免疫原性增加,被较快的清除,但是人源化程度高的抗体在人体内可能具有更高的优势。同时,huAb1、huAb2和huAb3的反嵌合抗体的体外结合、中和以及体内活性均与鼠抗E6F6相当。162、huAb1、huAb2和huAb3的溶解度高达140mg/mL以上,粘度小于14,等电点在8-9之间,达到了抗体药物的标准,TM值大于80℃,具有较好的热稳定性。在人体内环境和药物储存环境的模拟条件下同样具有较好的稳定性。食蟹猴体内药代动力学实验评估162、huAb1、huAb2和huAb3的半衰期符合标准,均能持续有效的清除食蟹猴体内的HBsAg,其中意外发现huAb3的半衰期较长,分析与其表面电荷分布有关,表面电荷降低可能会延缓抗体的清除。药代动力学参数及食蟹猴血常规和血生化结果提示,162、huAb1、huAb2和huAb3具有良好的药物有效性和安全性。进一步研究发现162、huAb1、huAb2和huAb3与HBsAg形成免疫复合物较小,有利于细胞的高效吞噬。通过对人IgG1Fc区域的突变,获得了体外活性与162相当,吞噬效应显着提高的162-IgG1-KD突变体。发现CH的替换可能导致Fc不依赖与FcγR作用途径,而是通过改变Fab与靶标的结合方式,形成不同大小的免疫复合物,影响吞噬效应。同时首次发现了抗体VH和CH1之间的linker对吞噬的影响,在162重链可变区末端引入柔性linker（Gly4Ser）3可能会增大Fab双臂间的距离,降低抗体的吞噬功能。综上所述,本研究建立了快速点突变抗体人源化方法并利用3株不同靶点的鼠抗完成了全面的验证,大大缩短了改造的时间,为鼠源抗体人源化的改造奠定了坚实的基础,丰富了人源化技术手段,为抗体人源化改造提供了新的选择。获得了具有专利保护的用于HBV感染相关疾病治疗的人源化抗体分子162、huAb1、huAb2和huAb3,并完成了较为全面的体内外活性评估及成药性分析,完善了抗体人源化改造平台,为相应疾病治疗性人源化抗体的研发奠定了坚实的基础,有望成为治疗慢乙肝的新药物。
陈姝承[2]（2017）在《猪瘟病毒E2蛋白猪源化单克隆抗体rHQ06Sw的嵌合表达及抗病毒活性鉴定》文中研究指明猪瘟（Classical swine fever,CSF）是严重危害养猪业的一种烈性传染病,给各个国家和地区造成巨大的经济损失,是世界动物卫生组织要求的必须申报的动物烈性传染病之一。猪瘟的病原是猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）,CSFV的结构蛋白包括囊膜糖蛋白Erns、E1、E2和衣壳蛋白C。CSFV E2蛋白是CSFV主要的保护性抗原,可以诱导机体产生中和抗体,从而抵抗CSFV的感染。现在,已有很多针对CSFV E2蛋白的单克隆抗体,在CSFV的鉴别诊断、抗原变异和抗原表位等研究中有着至关重要的作用。对抗体研究的逐渐深入,高效稳定的基因工程抗体技术已逐渐成为制备抗体的中流砥柱。通过之前的工作,通过免疫小鼠得到了一株鼠源E2单克隆抗体HQ06,HQ06可以特异性识别CSFV C株和Shimen株E2蛋白的线性表位,该单克隆抗体重链为IgG1型,轻链为к型。由于杂交瘤细胞并不能稳定长期保存,且易造成抗性的减少和消失,因此,本研究中利用基因工程技术,将HQ06抗体重链和轻链的可变区与猪源恒定区基因嵌合重组后克隆至真核表达载体,应用悬浮HEK293细胞构建稳定表达抗体的细胞系,制备一株猪瘟病毒E2蛋白猪源化单克隆抗体(rHQ0Sw)。将抗体纯化后,试验结果显示抗体已成功组装,并且可以和兔抗猪免疫球蛋白G反应,这标志着抗体猪源化的成功。之后应用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）、蛋白免疫印记试验（Western blotting）、免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）和证实了rHQ06Sw与CSFV E2蛋白的反应活性。应表面等离子共振试验（SPR）验证rHQ06Sw与CSFV E2的结合力。随后,通过交叉反应试验证明了rHQ06Sw对CSFV的特异性。更重要的是对rHQ06Sw抗病毒活性的探究,证明rHQ06Sw可以中和CSFV的感染。综上所述,本研究应用悬浮HEK293细胞稳定表达了具有良好反应原性和中和活性的重组CSFV E2蛋白的猪源化单克隆抗体rHQ06Sw,为研究CSFV E2蛋白结构、功能以及开发新型的CSFV诊断和治疗制剂奠定基础。
李素芬[3]（2015）在《利用大肠杆菌和烟草表达的重组全人源药用抗EGFR单链抗体的抗肿瘤分析》文中指出表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR）是肿瘤治疗中一个很重要的靶分子,针对EGFR靶点的抗体药物的研究具有广阔的前景。sc Fv是一种小分子抗体片段,其免疫原性较小,已逐渐成为抗体靶向治疗的重要研究方向。目前,虽然动物细胞表达抗体时,抗体活性高,但生产成本高。原核生物反应器可以有效的解决生产成本高的缺陷,但是其仍存在不足之处,它不能对翻译后的蛋白进行修饰,因而只适合表达Fv,sc Fv、Fab等抗体。植物生物反应器可以解决以上两者的缺陷,被认为是一种生产成本低、蛋白活性高的生物反应器。如已经有多种Fab、sc Fv等都已在植物中成功地表达。抗体经历了鼠源抗体,人源化抗体和全人源抗体三个阶段,全人源sc Fv能很大程度的消减HAMA反应。乳腺癌是常见的恶性肿瘤。抗EGFR单克隆抗体具有抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖的作用。本试验采用生物信息方法对HLL和LLH基因序列进行构建,并预测这两种蛋白的性质。构建了p ET-28a-c（+）-HLL、p ET-28a-c（+）-LLH表达载体;利用E.coli生产HLL-p ET和LLH-p ET蛋白,并分析其抗肿瘤活性。构建了p BI121-HLL-YC表达载体;利用烟草生产HLL-YC蛋白,并对其进行了Western Blotting检测。为了提高目的蛋白在烟草中的表达量和生物活性,构建了HLL-YCPH-YC和LLH-YCPH-YC基因序列。研究结果如下:1.HLL、LLH的生化指标都与可溶性sc Fv相符,但只有HLL与可溶性sc Fv有相似的空间结构。2.构建了p ET-28a-c（+）-HLL、p ET-28a-c（+）-LLH表达载体,表达了HLL-p ET和LLH-p ET蛋白。HLL-p ET对MCF-7有显着的增殖抑制作用,具有生物活性。LLH-p ET对MCF-7无显着的增殖抑制作用,不具有生物活性。3.构建了p BI121-HLL-YC表达载体,表达了HLL-YC蛋白。4.构建了HLL-YCPH-YC和LLH-YCPH-YC抗体基因序列,为了提高目的蛋白在烟草中的表达量和生物活性奠定了基础。
刘美君,高向东,徐晨[4]（2014）在《Fab类抗体的研究进展》文中进行了进一步梳理在基因工程抗体中,Fab类（Fabs）抗体有许多优势,如相对分子质量小、组织分布特异性强和免疫原性低等,使Fab类抗体成为近几十年来的研究热点。除了应用较广泛的体外酶消化法外,多种表达系统（如大肠杆菌和昆虫等）皆用于Fab类抗体的获得,其中大肠杆菌表达的系统研究最为彻底,且已经应用于制备Fab类临床药物。目前已经有赛妥珠单抗等6种Fab类抗体药物通过了美国FDA申请并上市,并有多种Fab类药物正处于临床试验阶段。本文分别对Fab类抗体的基本结构及特点、Fab类抗体的生成、表达和提高产量的策略、临床应用的研究进展进行介绍。
袁若森[5]（2014）在《抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体scFV98H的制备及应用研究》文中提出狂犬病是由狂犬病毒引起的人兽共患全球性传染疾病，人和动物一旦发病，几乎100%死亡。WHO推荐，对于狂犬病暴露，尤其严重暴露者应全程注射狂犬疫苗与抗狂犬病抗体。抗血清对预防狂犬病起着至关重要作用,由于马免疫血清（ERIG）副反应较大,而人源狂犬病免疫球蛋白（HRIG）来源有限，且存在潜在的病原污染与批次间差异等缺点。因此，急需开发治疗用人源抗狂犬病单克隆抗体或者人源化基因工程抗体。同时无论是狂犬疫苗生产过程中的滴度检测，还是疫苗免疫后的抗狂犬病中和抗体检测都需要相应的检测抗体。经研究证明，由几株能够中和狂犬病毒的人源化单克隆抗体组成的鸡尾酒混合抗体，有可能取代HRIG或ERIG用于狂犬病的暴露后预防。完整单克隆抗体必须在真核系统中进行表达，表达量小，成本高，而基因工程单链抗体可以在原核系统中高效表达。大肠杆菌是目前基因工程药物广泛使用的原核表达系统，表达产物常以包涵体的形式存在。因此，这种表达产物的复性与纯化工艺将成为基因工程下游技术的关键和难点。本论文主要研究了大规模制备抗狂犬病单链抗体scFV98H的发酵、复性和纯化工艺，并探索作为诊断制剂和治疗制剂的可行性。本文主要研究内容和结果如下：1．检测方法的建立与验证针对蛋白浓度测定方法（BCA法）进行了验证，在8M尿素、3M尿素、0.1M尿素、10%甘油、5%蔗糖体系中对线性、准确性、精密度、检测下限和定量下限进行了测定，在10%甘油、5%蔗糖体系检测的线性范围变窄，但是在各自的线性范围内，准确性与精密度的CV<20%，符合可接受标准。针对测定大肠杆菌宿主DNA的方法（PicoGreen法）进行了验证，在8M尿素体系、3M尿素体系、0.1M尿素体系中对线性、准确性、精密度、检测下限和定量下限等指标进行了测定；3M尿素体系、0.1M尿素体系中准确性与精密度的CV<20%，线性关系良好，符合可接受标准，8M尿素体系的样品需要稀释到3M以下进行检测。建立了狂犬病中和抗体的检测方法——RFFIT法；对该方法进行了验证，测定了RFFIT法的特异性、线性、准确性、精密度、检测下限和定量下限等指标；在3M尿素体系、0.1M尿素体系、10%甘油体系、5%蔗糖体系中检测结果的CV<30%，证明该方法稳定可靠，可以作为复性工艺开发中单链抗体活性分析方法。2．发酵与包涵体洗涤工艺初步研究本研究鉴定了携带scFv98H基因的工程菌种，进行了大比例传代，连续传10代之后，质粒拷贝数稳定，目的蛋白正确表达，蛋白表达量与原始菌种一致。在摇瓶培养水平，筛选出scFv98H基因的工程菌种的适宜培养基为：完全自诱导培养基或IPTG代替乳糖的不完全自诱导培养基。在3L生物反应器水平，筛选出scFv98H基因的工程菌种适宜的发酵pH范围为：7.0-7.5；适宜的发酵pH调节方式为：25%浓氨水作为pH调节剂。用不含乳糖的不完全自诱导培养基作为基础培养基，以相同的补料方式，采用3L发酵罐与14L发酵罐发酵得到的单位体积的菌体湿生相同。菌体超声后分离包涵体的离心转数和时间为8000rpm、10min，离心两遍；溶液Ⅰ的搅拌洗涤时间为120min；溶液Ⅲ的洗涤后的离心条件为10000rpm、10min。3．单链抗体scFV98H的纯化复性工艺研究scFv98H包涵体蛋白在变性条件下，采用IMAC亲和层析、SP、QXL离子交换层析以吸附洗脱模式，能将目的蛋白与大部分杂质分开，纯化效果和稳定性较好。采用DEAE、QXL、Nuvia Q以流穿模式，都能将scFv98H包涵体蛋白与大部分杂质分开，样品处理效率高。采用Nuvia Q的目的蛋白回收率最高，重复性较好。用透析复性的方式筛选出最适pH值，结合实际情况确定为pH9.0。作为诊断制剂的scFv98H蛋白，精细纯化工艺路线为：IMAC亲和层析，QXL吸附洗脱，透析复性。作为治疗制剂的scFv98H蛋白，精细纯化工艺路线为：Nuvia Q流穿纯化，脱盐后，QXL柱上复性。4．单链抗体scFV98H的诊断应用研究运用诊断制剂纯化复性工艺，制备了scFv98H抗体蛋白，并对复性后单体，二聚体进行了分离，分子量鉴定结果为：scFv98H抗体蛋白单体的分子量30Kda左右，scFv98H抗体蛋白二聚体的分子量60Kda左右。对单链抗体scFv98H的特异性进行了鉴定，能与灭活狂犬病毒特异结合。对单链抗体scFv98H与市售的抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体（NP mAb）的结合能力在ELISA和细胞免疫荧光应用进行了比较，在相同蛋白浓度下，二者结合能力相当。测定了scFv98H抗体的亲和力常数Kd为1×106M1。应用scFv98H抗体与NP mAb，对高中低三个水平的ERIG和HRIG的中和抗体效价，和高低水平的MRIG和RRIG中和抗体进行了测定，结果表明，scFv98H抗体与NP mAb的检测值经统计分析没有显着性差异。应用scFv98H抗体与NP mAb，针对不同狂犬病毒株的病毒增殖曲线进行检测，结果表明，scFv98H抗体与NP mAb的检测值经统计分析没有显着性差异。5．单链抗体scFV98H的治疗应用研究运用治疗制剂纯化复性工艺，制备了scFv98H抗体蛋白，假病毒体系鉴定了scFv98H抗体的中和活性，与HRIG一样能特异地中和假病毒。运用RFFIT法检测scFv98H抗体的中和效价，大于1000IU/mg。检测到scFv98H抗体能与感染狂犬病毒的活细胞表面的糖蛋白结合，而MAbNP不能结合。建立了狂犬病毒暴露后动物模型，用HRIG验证了该模型，为检测scFv98H抗体在动物水平的保护效果奠定了基础。运用建立的狂犬病毒暴露后动物模型，检测scFv98H在狂犬病毒暴露后2小时，20IU/kg的剂量，保护率可达70%，与阳性对照HRIG80%的保护率没有显着性差异。构建了scFv98N的表达菌株，根据scFv98H抗体蛋白制备的工艺路线，制备了scFv98N抗体。对scFv98N抗体的结合活性与中和活性进行测定，其结合活性和中和活性与scFv98H比较没有显着性差异。ScFv98N蛋白37°C放置加速稳定性结果表明，与ERIG的热稳定性一致；药代动力结果表明，体内代谢稳定性低于ERIG。运用建立的狂犬病毒暴露后动物模型检测scFv98N在狂犬病毒暴露后2小时，20IU/kg的剂量，保护率可达70%，与阳性对照HRIG80%的保护率没有显着性差异。总之，以上研究结果表明，本研究建立了单链抗体的制备工艺，采用该工艺生产的scFv98H具有诊断和治疗狂犬病毒感染的应用前景。
刘运洪[6]（2011）在《人源抗VEGFR2单链Fab抗体克隆表达研究》文中研究表明[背景]肿瘤的生长、侵袭和转移受诸多因素影响和制约,血管形成是其重要因素之一。肿瘤血管不仅提供了肿瘤生长所需的营养,而且也是癌细胞播散的途径。在血管内皮细胞的增殖和血管生成过程中,血管内皮生长因子受体2 （Vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2）起重要作用。目前以肿瘤血管形成为靶点的抗肿瘤治疗研究正成为当前的热点。Fab抗体（fragment antigen binding, Fab）是由两条肽链,即轻链（LC）和重链Fd段（Fd）通过二硫键和非共价键结合在一起,相当于全长IgG1抗体的1/3,其无Fc段,免疫原性低、分子量小,更易到达病灶,半衰期长于单链可变区片断（scFv）,广泛用于与生物毒素等的融合表达,目前,成熟的噬菌体展示技术可以制备的完全人源化抗体Fab片断,其免疫排斥反应小,是极具潜力的免疫靶向治疗药物。但是,Fab在原核系统表达量普遍较低。本课题通过噬菌体展示技术成功建立全人源抗VEGFR2 Fab抗体,筛选获得较高亲和力的克隆,根据该Fab片断的特点,设计一段长约110bp的人工合成的linker基因,连接LC和Fd,使二者在一个起始子下翻译和表达,表达产物为一条肽链,形成单链Fab片断（single chain Fab fragment, scFab）,借助高效表达载体pET系列,构建分泌型表达重组载体pET25b（+）-scFab和插入HRV3C蛋白酶切位点的融合型表达重组载体pET32a-HRV3C-scFab,通过建立最适表达和纯化条件,提高抗体在大肠杆菌里的可溶表达产量。[方法]（1）从人外周淋巴细胞提取总RNA,逆转录为cDNA,通过PCR技术将LC和Fd基因克隆到噬菌体载体pComb3XSS上,构建抗人VEGFR2噬菌体抗体库,通过ELISA筛选亲和力和特异性高的克隆（抗体基因片段）。（2）利用PCR技术,从噬菌体抗体库中高亲和力的克隆中获得LC和Fd基因,在其两端引入酶切位点,以酶切-连接的方式克隆至设计含有linker基因质粒上linker的前后两端,以构建pGH-scFab重组载体方式将LC和Fd基因连接形成scFab基因片段。（3）选择pGH-scFab重组载体上合适的酶切位点,以酶切-连接的方式将scFab克隆至pET25b（+）载体上,构建pET25b（+）-scFab重组载体,转化3种不同的表达型宿主菌BL21（DE3）、Origami2（DE3）和Rosetta-gami 2（DE3）,检测蛋白的表达形式,通过在不同温度、不同诱导起始OD600值、不同诱导剂IPTG浓度的条件下,研究pET25b（+）-scFab的最佳表达条件。（4）选择scFab两端合适的酶切位,以酶切-连接的方式克隆至设计含有HRV3C蛋白酶切位点的质粒上HRV3C基因下游,再以以酶切-连接的方式将HRV3C-scFab基因片段克隆至含硫氧还蛋白（Trx）的融合表达载体pET32a上,构建pET32a-HRV3C-scFab重组载体,转化表达型宿主菌Rosetta gami 2（DE3）,通过在不同温度、不同诱导起始OD600值、不同诱导剂IPTG浓度的条件下,研究pET32a-HRV3C-scFab的最佳表达条件。（5）在最佳表达条件下,大量表达scFab抗体蛋白,按照镍柱亲和层析纯化,HRV3C蛋白酶切,凝胶层析的先后顺序纯化scFab,用超滤离心浓缩和BCA蛋白定量调整scFab蛋白浓度,再通过ELISA以及流式细胞术检测scFab的亲和力和特异性。[结果]（1）构建了人源抗VEGFR2 Fab噬菌体抗体库,并通过4轮筛选获得了亲和力高的克隆pComb3XSS-Fab（33#）。（2）构建了pGH-scFab重组载体,成功地将LC和Fd基因在质粒上连接形成scFab基因片段。（3）构建了pET25b（+）-scFab分泌型表达重组载体,研究显示：最佳表达型宿主菌为Rosetta gami 2（DE3）,主要为包涵体表达,最佳诱导温度为20℃,最佳诱导起始OD600值为0.4,最适诱导剂IPTG浓度为0.5mM。（4）构建了pET32a-HRV3C-scFab融合型表达重组载体,用表达型宿主菌为Rosetta gami 2（DE3）进行表达时,主要为可溶表达,最佳诱导温度为20℃,最佳诱导起始OD600值为0.8,最适诱导剂IPTG浓度为0.5mM。（5）先后通过镍柱的亲和层析纯化,HRV3C蛋白酶切,分子筛过滤纯化,超滤离心浓缩,最后得到高纯度的scFab抗体蛋白。蛋白浓度为0.1mg/m1时,直接法ELISA的OD450/570nm值为1.583,竞争抑制ELISA显示其对VEGF有53%抑制率,流式细胞术检测显示对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）有39.62%的结合力。[结论]（1）噬菌体抗体库技术是获得人源抗体的有效途径,并且通过反复筛选可以得到高亲和力的克隆。（2）与Overlap PCR技术相比,在质粒上进行两个基因片段连接操作可行性更高,尤其是在像本实验中不易设计引物的情况下。（3）pET25b（+）-scFab和pET32a-HRV3C-scFab重组表达载体的表达条件研究显示：使用含大肠杆菌稀有密码子的宿主菌能显着增加scFab的表达；在没有分子伴侣的条件下,scFab主要以包涵体形式表达,硫氧还蛋白（Trx）的融合scFab进行表达能显着增加scFab的可溶表达量；此外低温、合适的诱导剂IPTG和起始起始OD600值都有利于增加scFab表达量。（4）本实验通过合适的纯化方式组合,最后得到高纯度的scFab抗体蛋白,HRV3C蛋白酶切是在低温（4℃）下进行,这既去除了分子伴侣,又保证了目的蛋白的活性。（5） scFab抗体蛋白的功能检测结果显示：linker的设计,对Fab的空间结构尤其是功能改变不大,但是能显着提高Fab抗体的产量。（6）本实验的研究结果为肿瘤血管靶向治疗动物实验及临床试验奠定基础,为Fab抗体的生产提供一个新的思路,也为本实验室建立了一个高效的原核融合表达平台。
李铁军[7]（2008）在《抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的构建、筛选及单链抗体的表达与特性研究》文中研究表明甲胺磷（O,S-二甲基硫代磷酰胺）是一种剧毒的有机磷类农药,由于较好的杀虫效果往往被违禁使用,危害严重,有必要进一步对其加强监测。免疫分析法具有灵敏、简便、快速等特点,在农药残留检测中具有突出的优势。目前虽有制备甲胺磷多克隆抗体和单克隆抗体的报道,但其抗体制备需进行动物免疫及昂贵的细胞培养设备,周期长,成本高。第三代抗体—重组抗体的出现为快速、低成本制备小分子化学农药抗体提供了新的途径。为此,本论文开展了抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的构建、筛选及抗甲胺磷单链抗体的表达与特性研究,主要研究内容及结果如下：1 Balb/c小鼠的免疫及抗血清特性初步分析利用活泼酯法将合成的甲胺磷半抗原β-（O,S-二甲基磷酰）氨基丙酸（HM3）与牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶联分别制备免疫原HM3-BSA和包被原HM3-OVA。将HM3-BSA按高（H）、中（M）、低（L）3个不同剂量组分别免疫Balb/c小鼠。抗血清分析结果表明,经过8次近6个月时间的免疫在高（H）剂量组中获得了1只良好免疫效果的H3号Balb/c小鼠。2抗体可变区基因的获得及抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的构建取H3号Balb/c免疫小鼠的脾细胞提取信使RNA（mRNA）,通过反转录PCR （RT-PCR）扩增出了大小约340bp和320bp的抗体重（VH）、轻链（VL）可变区基因片段。纯化回收的VH与VL基因在接近等摩尔浓度下,首先采用含有Linker接头片段的引物利用重叠延伸拼接法（SOE-PCR）将VH与VL基因片段组装成单链抗体（ScFv）基因片段,再用带有限制性内切酶位点的引物（5’端SfiⅠ,3’端NotⅠ）扩增含内切酶位点的ScFv基因,获得了大小约750bp的目的片段,纯化回收并分别用SfiⅠ和NotⅠ酶切消化后,与经SfiⅠ、NotⅠ双酶切过的噬菌粒载体pCANTAB5E连接,电转化大肠杆菌E.coli TG1,建成了库容约9.8×105的抗甲胺磷噬菌体单链抗体库。经对随机转化子质粒的PCR及HindⅢ、EcoRⅠ双酶切鉴定,该抗体库重组率高。BstNⅠ酶切图谱显示该噬菌体单链抗体库具有良好的多样性。3抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的筛选和鉴定借助辅助噬菌体M13K07的超感染,扩建了滴度约1.75×1013pfu/mL的抗甲胺磷噬菌体-ScFv表面展示文库。通过降低抗原包被浓度和增强洗脱力度的方法,以包被原HM3-OVA对展示库进行了五轮“吸附、洗脱、扩增”的富集筛选,结果显示,从第三轮开始,噬菌体回收率、多克隆噬菌体ELISA的OD值及阳性率均呈现上升趋势。从第5轮筛选后得到的细菌集落中分批随机挑选大量单克隆,经单克隆噬菌体ELISA及竞争ELISA进一步筛选鉴定,获得了6个特异性较强的抗甲胺磷噬菌体单链抗体阳性克隆,基因序列分析及Blast数据库检索表明所得6个阳性克隆的序列互不相同,均符合鼠源单链可变区抗体基因的结构和特征。4抗甲胺磷单链抗体在大肠杆菌中的可溶性表达及性质鉴定将6个甲胺磷噬菌体阳性克隆提取噬菌粒分别转化琥珀终止非抑制型大肠杆菌E.coli HB2151, IPTG诱导过夜小量制备各克隆的可溶性单链抗体。收集细菌沉淀及培养上清,采用渗透休克法提取菌体细胞周质中的可溶性单链抗体,并对培养上清进行超滤浓缩。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示,周质腔提取物及浓缩上清在分子量约30KD处明显出现一增粗条带,与单链抗体的预期分子量相符,而阴性对照菌中没有该条带。间接ELISA结果显示,6个克隆的细菌培养上清和周质腔提取物中的抗体均能与包被抗原反应,说明分泌型单链抗体得到了正确的折叠和表达。间接竞争ELISA初步分析6个克隆新鲜制备的周质腔提取物对游离甲胺磷的竞争抑制性,结果显示,6个克隆的表达产物对游离甲胺磷均具有不同程度的抑制作用,其中克隆Met-93的周质腔提取物抑制中浓度I50值最高（887.66μg/mL）,克隆Met-28D4的周质腔提取物I50值最低（146.74μg/mL）。以抗体表达的最优化条件对Met-28D4阳性克隆株进行摇瓶发酵（1L）大量制备纯化单链抗体,抗体产量约0.98 mg/L培养基。以纯化单链抗体为免疫试剂,初步建立了甲胺磷竞争ELISA分析法。该ELISA标准曲线的线性范围为1～500μg/mL, I50为118.69μg/mL,检出限120为3.36μg/mL;在该线性范围内,标准曲线的批内和批间变异系数分别为2.3%和4.8%,稻谷和小白菜样品中添加甲胺磷后的平均回收率分别为83.8%和87.0%。交叉反应结果显示,本研究制备的纯化Met-28D4单链抗体仅与乙酰甲胺磷有部分交叉反应（4.9%）,而与供试的其它5种有机磷农药（敌敌畏、乐果、甲拌磷、甲基对硫磷和水胺硫磷）的交叉反应率均小于0.1%,表明所制备的纯化单链抗体对甲胺磷的识别是高度特异的。抗体稳定性试验结果表明,在蛋白保护剂存在条件下,4℃保存下的纯化单链抗体其结合活性可维持约6-7周的时间,基本能满足短期内单链抗体研究的需要,但在大规模生产、应用等方面,就显得稳定性不够。5抗甲胺磷单链抗体在巴斯德毕赤酵母中的表达及性质鉴定在巴斯德毕赤酵母P. pastoris （X-33）中分泌表达Met-28D4-ScFv。设计引物从Met-28D4-pCANTAB5E-ScFv上扩增Met-28D4-ScFv,亚克隆至P. pastoris表达载体pPICZαC,获得酵母表达质粒pPICZαC-ScFv。表达质粒pPICZαC-ScFv线形化后,电转化P.pastoris （X-33）。随机挑选转化子菌落进行PCR鉴定,结果显示,转化子的酵母染色体中均整合有外源ScFv基因。在抗性梯度筛选多拷贝整合菌株试验中,共获得5个在2000μg/mL ZeocinTM的YPDS选择平板上正常生长的菌落,表型鉴定结果均为甲醇利用快速型（Mut+）。对5个多拷贝Mut+型转化菌进行甲醇诱导表达,SDS-PAGE结果显示,各菌株诱导48 h后在约30KD处均可见明显条带,72 h处表达量最大,各菌株表达量之间无明显差异；间接ELISA结果显示,各菌株诱导72h的表达产物具有较好的抗原结合活性。选其中一个稳定高表达的X-33-Pp-Met-28D4-1菌株进行优化诱导表达试验,优化后的条件为：本实验室30℃、250 rpm的振荡培养条件下,菌体接种量OD600nm =1.5,培养基pH值6.5,每24 h补加甲醇至终浓度1.00%,诱导时间72 h。经过优化条件下的诱导表达,单链抗体的表达量达25 mg/L,比Invitrogen公司推荐的诱导表达条件下的表达量高5 mg/L。对优化条件下的诱导表达产物进行纯化并进行竞争ELISA初步试验,结果表明,酵母表达纯化抗甲胺磷单链抗体与游离甲胺磷具有较好的抗原结合特异性,其I50为93.52μg/mL,与大肠杆菌表达的单链抗体的性质基本接近；交叉反应结果显示,酵母表达纯化单链抗体与乙酰甲胺磷的交叉反应率为3.8%,与其它农药的交叉反应率均小于0.1%。稳定性试验表明,酵母表达纯化抗甲胺磷单链抗体的稳定性比大肠杆菌表达的单链抗体的稳定性有了一定的提高。本论文研究结果为甲胺磷特异性抗体的大量制备奠定了一定的基础,对开发其它小分子化学农药的重组抗体具有重要的理论价值和实践意义。
万忠海[8]（2008）在《抗PEA单抗和单链抗体制备及在绿脓感染中的应用》文中指出绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginodsa PA）是导致外科手术或烧伤细菌感染死亡的最主要的病原细菌之一。绿脓杆菌外毒素A（PEA）是该菌的主要致病因子之一。PEA分为三个（IIII）功能区,I区与易感细胞识别有关;II区与PEA的“跨膜移位”有关;III区具有细胞毒性作用。PEA的毒性是其I区与细胞表面受体结合后,由受体介导的一系列反应引发的。所以抑制I区与受体的结合就可以阻断毒素的全部毒性作用。为获得绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白,本研究将PEA受体结合区亚单位基因克隆到表达载体pET28（c）中,构建了原核表达质粒pET-28（c）+B10,表达了重组的绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白,进行了免疫学实验。进而利用该蛋白免疫Balb/c小鼠制备了抗PEA单克隆抗体,抗PEA（3C6）单克隆抗体经过正辛酸和硫酸铵纯化后,对严重绿脓杆菌感染小鼠进行了疗效实验,效果明显。在此基础上,采用RT-PCR重叠延伸剪接法方法构建了单链抗体基因,并将基因克隆入pET28a中,筛选得到重组表达质粒pET28a-（PEA-1）ScFv。通过表达、变性、复性、纯化之后,进行了PEA的细胞毒性抑制实验。单链抗体在高浓度下能够起到一定的抑制作用。本研究旨在寻求治疗烧伤后绿脓杆菌感染的新方法新途径。
王丁丁[9]（2007）在《重组人抗狂犬病毒抗体的实验研究》文中认为本研究利用基因重组技术构建了可在真核表达系统毕赤酵母中稳定有效表达人小分子抗体scFv-Fc的表达载体pPICZα/scFv-Fc,建立了一套可表达筛选人小分子抗体scFv-Fc的真核表达体系。应用该表达体系构建人抗狂犬病毒小分子抗体scFv-Fc的表达文库,利用抗体的抗原特异结合活性从中筛选人抗狂犬病毒小分子抗体scFv-Fc,结果获得了新的具有狂犬病毒抗原结合活性的抗体可变区序列,其中克隆RS3（轻链可变区为κ链）和RS9（轻链可变区为λ链）具有较好的scFv-Fc小分子抗体表达及狂犬病毒抗原结合活性。进而在80L发酵条件下,对毕赤酵母工程菌RS3表达条件进行了优化,并建立一种适合于大规模纯化人抗狂犬病毒小分子抗体scFv-Fc的方法。另外,我们应用基因重组技术,将筛选获得的抗狂犬病毒小分子抗体RS3的重链和轻链可变区基因重组到本实验室已构建的完整人重链及轻链表达载体pPICZαCH及pPICZαCκ,利用分步整合法转化X33酵母菌对抗狂犬病毒全分子抗体进行分泌表达,制备具狂犬病毒抗原结合活性的完整人抗体,鉴定重组抗体的生物学活性。结果表明,在毕赤酵母菌中可经甲醇诱导产生具抗原结合活性的完整分泌型抗体。本实验的创新之处在于:1)利用毕赤酵母构建了人小分子抗体scFv-Fc的表达筛选体系并获得了新的具有狂犬病毒抗原结合活性的抗体可变区序列,国内外尚未见报道;2)建立了大规模发酵和纯化人小分子抗体scFv-Fc的方法,国内尚未见报道;3)利用分步整合法电转化X33酵母菌,制备得到具狂犬病毒抗原结合活性的完整人抗体。
李杰帅[10]（2007）在《人源抗GSH单链抗体的筛选及表达》文中研究指明谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）是生物体内抗氧化应激酶系的重要成员,是一种含硒蛋白质,它通过清除过氧化氢（H2O2）和有机氢过氧化物（ROOH）,保护机体免受活性氧的损伤或减少活性氧对机体的损伤程度。GPX的缺乏与多种疾病有关。天然的GPX具有不稳定,来源有限,分子量大,易引起人体免疫反应等缺点,极大限制了此酶的开发和应用。因此,许多科学家都开始对该酶的人工模拟物进行研究。我们以GSH的类似物S-2,4-二硝基苯酚-谷胱甘肽丁酯（GSH-S-DNPBu）作为抗原物质,通过三轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,从噬菌体展示人源抗体库中筛选出能与其特异性结合的小分子单链抗体,此单链抗体被展示在噬菌体表面。通过ELISA方法检测噬菌体抗体与抗原结合的特异性,最后挑选出亲和力较高的噬菌体单链抗体。从该噬菌体中提取单链DNA,以单链DNA为模板,用抗体库的公共引物进行PCR扩增,用NcoI和NotI两种酶对PCR产物进行双酶切,获得目的基因片段,再将目的基因片段与用相同酶切的pPelB质粒载体连接,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta,然后在适宜条件下用IPTG诱导进行可溶性表达。收集菌体,利用SDS-PAGE和Western blot进行初步鉴定。结果我们成功地在大肠杆菌中表达出了单链抗体。
二、人源抗HBs基因工程抗体在E.coli中的高效表达与折叠（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人源抗HBs基因工程抗体在E.coli中的高效表达与折叠（论文提纲范文）
（1）快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 抗体(Antibody)的概述 |
| 1.1.1 抗体的结构与功能 |
| 1.1.2 抗体的人源化 |
| 1.1.3 抗体药物市场 |
| 1.1.4 抗感染抗体药物的概况及趋势 |
| 1.1.5 Fc改造对效应功能的影响 |
| 1.2 乙型肝炎病毒(HBV)的概述 |
| 1.2.1 HBV基因组 |
| 1.2.2 HBV的病毒结构 |
| 1.2.3 HBV的生命周期 |
| 1.2.4 HBV基因编码的蛋白 |
| 1.2.5 HBV的基因型 |
| 1.2.6 HBV的流行病学 |
| 1.2.7 HBV的预防 |
| 1.2.8 HBV感染的抗病毒治疗 |
| 1.3 本研究的目的、意义和思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要耗材 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 实验常用溶液及试剂配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 常规分子克隆实验方法 |
| 2.2.2 常规细胞生物学方法 |
| 2.2.3 抗体的表达、纯化及鉴定 |
| 2.2.4 免疫学相关实验方法 |
| 2.2.5 体外调理吞噬实验 |
| 2.2.6 抗原-抗体免疫复合物特征分析 |
| 2.2.7 HBV相关抗体的小鼠体内实验方法 |
| 2.2.8 亲和力常数测定 |
| 2.2.9 抗体晶体培养及结构解析 |
| 2.2.10 食蟹猴体内评估抗体的药代动力学 |
| 2.2.11 抗体生物物理特性相关实验方法 |
| 2.2.12 数据处理统计学分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 快速点突变抗体人源化平台的构建 |
| 3.1 流感病毒鼠源抗体12G6的人源化 |
| 3.1.1 12G6-cAb体外活性的评估 |
| 3.1.2 12G6-cAb的人源化设计 |
| 3.1.3 12G6人源化抗体真核表达载体的构建 |
| 3.1.4 12G6人源化抗体小量转染细胞上清性质鉴定 |
| 3.1.5 12G6人源化抗体大量表达、纯化及性质鉴定 |
| 3.2 呼吸道合胞病毒鼠源抗体5B11和7G5的人源化 |
| 3.2.1 5B11-cAb和7G5-cAb体外活性的评估 |
| 3.2.2 5B11-cAb和7G5-cAb的人源化设计 |
| 3.2.3 5B11和7G5人源化抗体构建、表达、纯化及性质鉴定 |
| 3.3 第一部分小结 |
| 第二部分 乙型肝炎病毒治疗性抗体的改造及成药性评估 |
| 3.4 E6F6人源化抗体162的亲和力测定 |
| 3.4.1 E6F6人源化抗体162的晶体培养及结构解析 |
| 3.4.2 E6F6鼠抗的人源化改造 |
| 3.4.3 E6F6人源化抗体体内外活性的评估 |
| 3.4.4 E6F6人源化抗体的成药性评估 |
| 3.4.5 E6F6人源化抗体与HBsAg免疫复合物的结构特征分析 |
| 3.4.6 E6F6人源化抗体162 Fc改造对吞噬的影响 |
| 3.5 第二部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 鼠源抗体人源化方法 |
| 4.2 抗体CDR的划分和人源化模板的选择 |
| 4.3 FR区人源化点突变规则 |
| 4.4 E6F6人源化抗体在小鼠体内的清除速率 |
| 4.5 E6F6人源化抗体huAb1和huAb3在食蟹猴体内的半衰期 |
| 4.6 抗原-抗体复合物电镜观察与纳米流式检测 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果 |
| 致谢 |
（2）猪瘟病毒E2蛋白猪源化单克隆抗体rHQ06Sw的嵌合表达及抗病毒活性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 猪瘟概述 |
| 1.2 猪瘟病毒概述 |
| 1.2.1 猪瘟病毒 |
| 1.2.2 CSFV囊膜糖蛋白的结构和功能 |
| 1.3 单克隆抗体在CSFV研究中的应用 |
| 1.3.1 MAb对 CSFV与瘟病毒属其他成员中的鉴别诊断 |
| 1.3.2 MAb对 CSFV囊膜糖蛋白的探究 |
| 1.3.3 MAb对 CSFV保护性抗原的鉴定 |
| 1.3.4 MAb对 CSFV抗原变异性的鉴定 |
| 1.3.5 MAb在确定CSFV抗原表位中的作用 |
| 1.4 基因工程抗体 |
| 1.4.1 基因工程抗体概述 |
| 1.4.2 基因工程抗体分类 |
| 1.4.3 基因工程抗体宿主表达系统 |
| 1.5 研究的目的及意义 |
| 第二章 猪瘟病毒E2 蛋白猪源化单克隆抗体rHQ06_(Sw)的嵌合表达和反应活性鉴定 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 rHQ06_(Sw)重链、轻链重组质粒的构建 |
| 2.2.2 rHQ06_(Sw)猪源抗体活性的检测 |
| 2.2.3 rHQ06_(Sw)抗体的反应原性检测 |
| 2.2.4 rHQ06_(Sw)抗体与猪瘟病毒E2 蛋白的结合力分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 猪瘟病毒E2 蛋白猪源化单克隆抗体rHQ06_(Sw)的抗病毒活性鉴定 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 rHQ06_(Sw)抗体与BVDV交叉反应的检测 |
| 3.2.2 rHQ06_(Sw)抗体识别猪瘟病毒E2 蛋白抗原表位的三维结构同源建模分析 |
| 3.2.3 rHQ06_(Sw)抗体对猪瘟病毒的中和作用 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录一 英文缩略词表 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（3）利用大肠杆菌和烟草表达的重组全人源药用抗EGFR单链抗体的抗肿瘤分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 癌症 |
| 1.2 EGFR |
| 1.3 肿瘤抗体的研究进展 |
| 1.4 全人源化抗肿瘤抗体的表达系统 |
| 1.5 单链抗体 |
| 第二章 重组全人源药用抗EGFR scFv(HLL)和重组全人源药用抗EGFR scFv(LLH)基因设计及其生物信息学分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 重组全人源药用抗EGFR scFv(HLL-pET)和重组全人源药用抗EGFRscFv(LLH-pET)的构建、E.coli表达及抗肿瘤活性分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 重组全人源药用抗EGFR scFv(HLL-YC)的构建、烟草表达及蛋白鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 重组全人源药用植物偏好性密码子抗EGFR sc Fv(HLL-YCPH-YC)和EGFRscFv(HLL-YCPH-YC)基因序列分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 HLL-YCPH序列分析 |
| 5.3 构建LLH-YCPH-YC序列 |
| 5.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 附件 |
（4）Fab类抗体的研究进展（论文提纲范文）
| 1 Fab的结构和特点 |
| 2 Fab的生成、表达和提高产量的策略 |
| 2.1 酶法生成 |
| 2.2 Fab的大肠杆菌表达 |
| 2.2.1 大肠杆菌的周质可溶表达 |
| 2.2.2 大肠杆菌的上清表达和胞外分泌 |
| 2.2.3 大肠杆菌的包涵体表达 |
| 2.3 提高表达量的策略 |
| 2.4 提高纯化效率的策略 |
| 2.5 其他表达系统 |
| 3 Fab的临床应用 |
| 3.1 癌症 |
| 3.2 自身免疫病 |
| 3.3 心血管疾病 |
| 3.4 解毒剂 |
| 3.5 眼科疾病 |
| 3.6 诊断用Fab |
| 4 结语 |
（5）抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体scFV98H的制备及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 缩略词表 第一章 前言 |
| 一、 狂犬病 |
| （一） 全球疫情概况 |
| （二） 中国疫情概况 |
| 二、 狂犬病毒概述 |
| 三、 抗体工程及单克隆抗体 |
| （一） 抗体 |
| （二） 人用单克隆抗体的发展现状 |
| （三） 抗狂犬病毒单克隆抗体发展现状 |
| （四） 小分子抗体概述 |
| 四、 大肠杆菌表达体系的特点应用现状 |
| 五、 蛋白纯化与复性概述 |
| （一） 蛋白纯化 |
| （二） 蛋白质色谱纯化技术的主要类型 |
| （三） 大肠杆菌表达包涵体蛋白的纯化与复性 |
| 六、 分析方法的验证 |
| 七、 试验设计 |
| （一） 论文目的 |
| （二） 试验设计 第二章 检测方法的建立与验证 |
| 一、 材料、试剂和仪器 |
| （一） 主要试剂 |
| （二） 主要缓冲液 |
| （三） 主要仪器与设备 |
| 二、 实验方法 |
| （一） 蛋白含量测定（BCA 法）及方法验证 |
| （二） DNA 含量的测定及方法验证 |
| （三） 中和抗体效价测定（RFFIT）及方法验证 |
| 三、 实验结果 |
| （一） BCA 蛋白含量测定方法验证 |
| （二） DNA 含量测定方法验证 |
| （三） RFFIT 活性测定方法验证 |
| 四、 分析讨论 |
| 五、 小结 第三章 发酵与包涵体洗涤工艺初步研究 |
| 一、 培养基与主要仪器 |
| （一） 培养基 |
| （二） 主要仪器 |
| 二、 实验方法 |
| （一） 表达菌株的筛选 |
| （二） 发酵 PH 值选择 |
| （三） PH 调控方式选择 |
| （四） 发酵体积放大到 14L |
| （五） 包涵体洗涤 |
| 三、 实验结果 |
| （一） 菌种传代稳定性研究 |
| （二） 培养基筛选 |
| （三） 发酵 pH 筛选及调节方式选择 |
| （四） 发酵放大 |
| （五） 包涵体洗涤 |
| 四、 讨论 |
| 五、 小结 第四章 单链抗体 SCFV98H 的纯化复性工艺研究 |
| 一、 材料、试剂和仪器 |
| （一） 材料、试剂和试剂盒 |
| （二） 主要溶液 |
| （三） 主要仪器 |
| 二、 实验方法 |
| （一） scFv98H 变性蛋白的纯化 |
| （二） scFv98H 变性蛋白透析复性最适 pH 选择 |
| （三） scFv98H 变性蛋白柱上复性 |
| （四） 分析检测方法 |
| 三、 实验结果 |
| （一） scFv98H 变性蛋白的吸附洗脱模式纯化 |
| （二） scFv98H 变性蛋白流穿模式纯化 |
| （三） scFv98H 变性蛋白透析复性最适 pH 筛选 |
| （四） scFv98H 变性蛋白柱上复性 |
| 四、 讨论 |
| 五、 小结 第五章 单链抗体 SCFV98H 的诊断应用研究 |
| 一、 材料、试剂和仪器 |
| （一） 材料和试剂 |
| （二） 主要溶液 |
| （三） 主要仪器 |
| 二、 实验方法 |
| （一） 包涵体的纯化与复性 |
| （二） scFv98H 的表征与应用 |
| 三、 实验结果 |
| （一） 包涵体的纯化与复性 |
| （二） scFv98H 抗体的表征及应用 |
| 四、 讨论 |
| 五、 小结 第六章 单链抗体 SCFV98H 的治疗应用研究 |
| 一、 材料、试剂和仪器 |
| （一） scFv98H 的制备与应用 |
| （二） scFv98N（无 His 标签）的制备与应用 |
| 三、 实验结果 |
| （一） scFv98H 的制备与应用 |
| （二） scFv98N（无 His 标签）的制备与应用 |
| 四、 讨论 |
| 五、 小结 结论 参考文献 作者简介及攻读博士学位期间发表的论文 致谢 |
（6）人源抗VEGFR2单链Fab抗体克隆表达研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 实验路线总图 |
| 第一部分 人源抗VEGFR2 Fab的抗体库构建及筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验流程图 |
| 3 实验设计 |
| 3.1 内切酶位点选择 |
| 3.2 引物设计 |
| 4 实验步骤 |
| 4.1 人外周血淋巴细胞的分离 |
| 4.2 Trizol试剂提取人外周血淋巴细胞总RNA |
| 4.3 cDNA的合成 |
| 4.4 PCR扩增Fab抗体基因 |
| 4.5 轻链抗体基因重组载体的构建 |
| 4.6 Fab噬菌体抗体库的构建 |
| 4.7 Fab噬菌体抗体库的筛选 |
| 5 结果 |
| 6 讨论 |
| 7 参考文献 |
| 8 小结 |
| 第二部分 人源抗VEGFR2 scFab的克隆表达 |
| 第一章 人源抗VEGFR2 scFab基因的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验流程图 |
| 3 实验设计 |
| 3.1 连接序列linker的设计 |
| 3.2 环式PCR法突变内切酶位点设计 |
| 3.3 用于scFab表达载体构建的引物的设计 |
| 4 实验步骤 |
| 4.1 pGH-linker质粒的制备 |
| 4.2 环式PCR突变内切酶位点 |
| 4.3 △LC和△Fd基因片段的获取 |
| 4.4 pGH-linker-△LC的构建 |
| 4.5 pGH-linker-scFab的构建 |
| 5 结果 |
| 6 讨论 |
| 7 参考文献 |
| 8 小结 |
| 第二章 人源抗VEGFR2 scFab在pET25b(+)-scFab中的表达研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验流程图 |
| 3 实验设计 |
| 3.1 酶切位点的设计 |
| 3.2 表达条件确定的先后顺序设计 |
| 4 实验步骤 |
| 4.1 pET25b(+)-scFab重组质粒的构建 |
| 4.2 表达条件研究 |
| 5 结果 |
| 6 讨论 |
| 7 参考文献 |
| 8 小结 |
| 第三章 人源抗VEGFR2 scFab在pET32a-HRV3C-scFab中的融合表达研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验流程图 |
| 3 实验设计 |
| 3.1 HRV3C的设计 |
| 3.2 scFab转移酶切位点的设计 |
| 4 实验步骤 |
| 4.1 pGH-HRV3C-scFab重组质粒的构建 |
| 4.2 pET32a-HRV3C-scFab重组质粒的构建 |
| 4.3 表达条件研究 |
| 5 结果 |
| 6 讨论 |
| 7 参考文献 |
| 8 小结 |
| 第三部分 人源抗VEGFR2 scFab的纯化和特异性检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验流程图 |
| 3 实验设计 |
| 3.1 表达条件设计 |
| 3.2 纯化方案设计 |
| 4 实验步骤 |
| 4.1 pET32a-HRV3C-scFab优化条件下大量表达 |
| 4.2 使用His·Bind purification Kit纯化蛋白 |
| 4.3 HRV3C蛋白酶酶解 |
| 4.4 凝胶层析纯化 |
| 4.5 浓缩和保存 |
| 4.6 抗体活性检测 |
| 5 结果 |
| 6 讨论 |
| 7 参考文献 |
| 8 小结 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表的文章 |
| 致谢 |
（7）抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的构建、筛选及单链抗体的表达与特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 噬菌体抗体库技术研究进展 |
| 1 噬菌体抗体库技术的基本原理 |
| 2 噬菌体展示技术载体系统的发展 |
| 2.1 丝状噬菌体展示系统 |
| 2.2 λ噬菌体展示系统 |
| 2.3 T4噬菌体展示系统 |
| 2.4 T7噬菌体展示系统 |
| 3 噬菌体抗体库的构建 |
| 3.1 抗体可变区基因的获得 |
| 3.2 噬菌体抗体库载体的构建 |
| 3.3 抗体可变区基因的表达 |
| 4 噬菌体抗体库的筛选 |
| 4.1 固相化或液相抗原筛选法 |
| 4.2 交替筛选法 |
| 4.3 双层膜筛选法 |
| 4.4 选择性感染噬菌体筛选系统 |
| 5 噬菌体抗体库的类型 |
| 5.1 天然抗体库 |
| 5.2 免疫抗体库 |
| 5.3 化学合成抗体库 |
| 6 噬菌体抗体库技术的特点与优势 |
| 7 噬菌体抗体库技术的应用 |
| 7.1 噬菌体抗体库技术在生物学、医学等领域的应用 |
| 7.2 噬菌体抗体库技术在农兽药等小分子化合物残留检测中的应用 |
| 8 噬菌体抗体库技术的应用前景及存在的问题 |
| 第二章 单链抗体及其表达系统研究进展 |
| 1 单链抗体的结构及特点 |
| 2 单链抗体的构建 |
| 3 单链抗体的应用 |
| 3.1 应用于基础理论研究 |
| 3.2 应用于放射性影像分析 |
| 3.3 构建免疫毒素应用于肿瘤治疗 |
| 3.4 应用于细胞内免疫 |
| 3.5 应用于构建双特异性抗体等其它基因工程抗体 |
| 3.6 应用于有害物质残留的检测 |
| 4 单链抗体表达系统 |
| 4.1 原核表达系统 |
| 4.2 真核表达系统 |
| 4.2.1 酵母表达系统 |
| 4.2.2 昆虫表达系统 |
| 4.2.3 植物表达系统 |
| 4.2.4 哺乳动物表达系统 |
| 4.3 噬菌体展示系统 |
| 5 单链抗体表达策略 |
| 6 单链抗体存在问题及改进方法 |
| 7 展望 |
| 第三章 农药小分子抗体制备及其免疫分析技术应用研究进展 |
| 1 农药多克隆抗体制备技术研究进展 |
| 2 农药单克隆抗体制备技术研究进展 |
| 3 农药重组抗体制备技术研究进展 |
| 3.1 从杂交瘤细胞系制备农药重组抗体 |
| 3.2 从抗体库中制备农药重组抗体 |
| 3.3 抗体特性体外改造制备农药重组抗体 |
| 3.4 农药重组抗体制备技术发展动态 |
| 4 人工模拟抗体制备农药抗体技术研究进展 |
| 4.1 传统抗体以外的蛋白来源抗体 |
| 4.2 核酸来源抗体 |
| 4.3 小分子物聚合材料抗体 |
| 5 农药免疫分析技术应用研究进展 |
| 5.1 酶免疫分析法 |
| 5.2 免疫分析芯片的应用 |
| 5.3 免疫试纸条的应用 |
| 6 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 下篇 研究内容 |
| 技术路线图 |
| 第一章 Balb/c小鼠的免疫及抗血清特性初步分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要溶液 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 抗原合成 |
| 1.2.2 免疫原的紫外可见光谱鉴定 |
| 1.2.3 小鼠免疫 |
| 1.2.4 间接非竞争ELISA测定抗血清效价 |
| 1.2.5 间接非竞争ELISA测定抗血清交叉吸附情况 |
| 1.2.6 抗原抗体工作浓度的初步确定 |
| 1.2.7 间接竞争ELISA初步测定抗血清识别甲胺磷的能力 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 免疫原的合成和鉴定 |
| 2.2 抗血清效价测定 |
| 2.3 交叉识别 |
| 2.4 间接竞争ELISA的抗原抗体工作浓度 |
| 2.5 间接竞争ELISA初步测定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株及噬菌粒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 培养基及溶液 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 脾细胞的制备 |
| 1.2.2 总细胞RNA的提取 |
| 1.2.3 mRNA的纯化 |
| 1.2.4 第一链cDNA的合成 |
| 1.2.5 VH、VL基因的扩增 |
| 1.2.6 VH、VL基因的纯化回收及定量 |
| 1.2.7 ScFv基因的组装及扩增 |
| 1.2.8 ScFv基因的纯化回收及定量 |
| 1.2.9 ScFv的SfiⅠ和Not Ⅰ双酶切 |
| 1.2.10 与噬菌粒pCANTAB5E的连接 |
| 1.2.11 E.coli TG1电转感受态细胞的制备 |
| 1.2.12 大肠杆菌的电转化及库容量的测定 |
| 1.2.13 噬菌粒DNA的提取 |
| 1.2.14 转化子PCR及双酶切鉴定 |
| 1.2.15 抗体库多样性分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RNA的提取及鉴定 |
| 2.2 目的基因的扩增及鉴定 |
| 2.3 ScFv基因的连接与扩增 |
| 2.4 ScFv基因的克隆转化及库容量 |
| 2.5 转化子的PCR鉴定 |
| 2.6 转化子的双酶切鉴定 |
| 2.7 抗体库多样性分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的筛选和鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株、辅助噬菌体及单链抗体库 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 培养基和溶液 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 辅助噬菌体M13K07的大量制备 |
| 1.2.1.1 对数生长期E.coli TG1的制备 |
| 1.2.1.2 单个噬菌体原种M13K07病毒空斑的制备 |
| 1.2.1.3 辅助噬菌体M13K07的扩增 |
| 1.2.1.4 辅助噬菌体M13K07的滴度测定 |
| 1.2.2 原始scFv-噬菌体表面展示文库的扩建和滴度测定 |
| 1.2.3 噬菌体ScFv抗体库的富集筛选 |
| 1.2.3.1 第一轮富集筛选 |
| 1.2.3.2 次级噬菌体抗体库的制备和保存 |
| 1.2.3.3 次级ScFv-噬菌体表面展示文库的扩建和滴度测定 |
| 1.2.3.4 进一步富集筛选 |
| 1.2.4 富集筛选效果的鉴定 |
| 1.2.4.1 多克隆噬菌体ELISA的初步鉴定 |
| 1.2.4.2 筛选菌落的PCR鉴定 |
| 1.2.4.3 重组噬菌粒的双酶切验证 |
| 1.2.4.4 单克隆噬菌体单链抗体的制备 |
| 1.2.4.5 单克隆噬菌体ELISA鉴定筛选效率 |
| 1.2.5 高亲和力阳性噬菌体抗体克隆的筛选 |
| 1.2.5.1 单克隆噬菌体ELISA筛选试验 |
| 1.2.5.2 竞争抑制试验 |
| 1.2.6 高亲合力阳性克隆ScFv基因序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 原始ScFv-噬菌体表面展示文库的扩建 |
| 2.2 噬菌体单链抗体库的富集 |
| 2.3 富集筛选效果的分析鉴定 |
| 2.3.1 多克隆噬菌体ELISA的初步分析 |
| 2.3.2 筛选菌落的PCR鉴定 |
| 2.3.3 重组噬菌粒的双酶切验证 |
| 2.3.4 筛选效率的比较 |
| 2.4 单克隆噬菌体ELISA筛选高亲和力克隆 |
| 2.5 阳性噬菌体抗体克隆竞争抑制试验结果 |
| 2.6 阳性克隆单链抗体基因的序列分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 抗甲胺磷单链抗体在大肠杆菌中的可溶性表达及性质鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株及阳性噬菌体单链抗体克隆 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 培养基和缓冲液 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 可溶性单链抗体的小量制备及鉴定 |
| 1.2.1.1 对数生长期E.coli HB2151的制备 |
| 1.2.1.2 阳性克隆重组噬菌体的制备 |
| 1.2.1.3 阳性克隆噬菌体对E.coli HB2151的感染 |
| 1.2.1.4 ScFv的可溶性表达 |
| 1.2.1.5 不同表达部位产物的提取和浓缩 |
| 1.2.1.6 可溶性ScFv的SDS-PAGE检测 |
| 1.2.1.7 可溶性ScFv的间接ELISA检测 |
| 1.2.1.8 间接竞争ELISA初步分析 |
| 1.2.2 可溶性单链抗体的大量制备和纯化 |
| 1.2.2.1 可溶性单链抗体的大量制备 |
| 1.2.2.2 纯化 |
| 1.2.3 竞争ELISA分析方法的初步建立 |
| 1.2.3.1 纯化抗体的效价测定 |
| 1.2.3.2 抗原抗体工作浓度的测定 |
| 1.2.3.3 ELISA标准曲线的建立及灵敏度评价 |
| 1.2.3.4 抗体特异性考察 |
| 1.2.3.5 精确度试验 |
| 1.2.3.6 添加回收试验 |
| 1.2.4 单链抗体稳定性试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 可溶性单链抗体的小量制备及鉴定 |
| 2.1.1 阳性克隆噬菌体对E.coli HB2151的感染 |
| 2.1.2 ScFv的可溶性表达及检测 |
| 2.1.2.1 SDS-PAGE检测 |
| 2.1.2.2 间接ELISA检测 |
| 2.1.2.3 间接竞争ELISA分析 |
| 2.2 可溶性单链抗体的大量制备和纯化 |
| 2.3 纯化抗体ELISA标准曲线的建立及评价 |
| 2.3.1 纯化抗体的效价 |
| 2.3.2 抗原和抗体的工作浓度 |
| 2.3.3 ELISA标准曲线的建立及灵敏度评价 |
| 2.3.4 抗体特异性考察 |
| 2.3.5 精确度试验 |
| 2.3.6 准确度试验(添加回收) |
| 2.4 单链抗体的稳定性 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于Met-ScFv可溶性抗体的表达 |
| 3.2 关于单链抗体的纯化 |
| 3.3 关于本研究中单链抗体结合特性的分析 |
| 3.4 关于Met-ScFv可溶性单链抗体的亲和性和特异性 |
| 3.5 关于单链抗体的稳定性 |
| 3.6 关于单链抗体在农药酶联免疫分析上的应用前景 |
| 4 小结 |
| 第五章 抗甲胺磷单链抗体在巴斯德毕赤酵母中的表达及性质鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌种与质粒 |
| 1.1.2 PCR引物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 培养基和溶液 |
| 1.1.5 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 酵母表达质粒pPICZα C的制备 |
| 1.2.1.1 E.coli DH5α感受态细胞的制备 |
| 1.2.1.2 pPICZα C质粒的转化和质粒菌的扩增培养 |
| 1.2.1.3 pPICZα C质粒的提取和定量 |
| 1.2.1.4 pPICZα C质粒的单酶切鉴定 |
| 1.2.1.5 pPICZα C质粒菌的保存 |
| 1.2.2 酵母表达载体pPICZα C-ScFv质粒的构建 |
| 1.2.2.1 阳性克隆菌的扩增培养 |
| 1.2.2.2 质粒PCANTAB5E-ScFv的提取 |
| 1.2.2.3 含内切酶位点的目的基因ScFv的扩增、回收及定量 |
| 1.2.2.4 目的片段的双酶切、回收及定量 |
| 1.2.2.5 pPICZα C质粒的双酶切、回收及定量 |
| 1.2.2.6 目的片段ScFv与pPICZα C的连接、转化 |
| 1.2.2.7 转化子的PCR鉴定及酶切验证 |
| 1.2.2.8 阳性克隆的保存 |
| 1.2.3 表达载体pPICZα C-ScFv与酵母基因的整合 |
| 1.2.3.1 重组表达质粒pPICZα C-ScFv的大量提取及定量 |
| 1.2.3.2 质粒pPICZα C的大量提取及定量 |
| 1.2.3.3 pPICZα C和重组质粒pPICZα C-ScFv的线形化与纯化浓缩 |
| 1.2.3.4 感受态酵母细胞的制备 |
| 1.2.3.5 酵母菌株的电转化 |
| 1.2.4 菌落PCR检测目的基因整合 |
| 1.2.5 多拷贝Mut~+型转化子的筛选 |
| 1.2.5.1 多拷贝转化子的筛选 |
| 1.2.5.2 多拷贝菌株生长表型的鉴定 |
| 1.2.6 高表达阳性克隆的筛选 |
| 1.2.6.1 阳性克隆菌的诱导表达 |
| 1.2.6.2 表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 1.2.6.3 表达产物的ELISA分析 |
| 1.2.7 酵母表达条件的初步优化 |
| 1.2.7.1 诱导表达时间优化 |
| 1.2.7.2 不同菌体密度的诱导表达 |
| 1.2.7.3 不同pH培养液的诱导表达 |
| 1.2.7.4 不同剂量甲醇的诱导表达 |
| 1.2.8 优化条件下的大量表达 |
| 1.2.9 目的蛋白浓缩纯化 |
| 1.2.10 酵母表达单链抗体免疫特性初步分析 |
| 1.2.10.1 抗原抗体工作浓度确定 |
| 1.2.10.2 间接竞争抑制试验 |
| 1.2.10.3 抗体特异性测定 |
| 1.2.11 酵母表达单链抗体稳定性试验 |
| 1.2.11.1 表达产物4℃保存条件下的稳定性试验 |
| 1.2.11.2 遗传稳定性检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组质粒pPICZα C-ScFv的构建及鉴定 |
| 2.2 重组质粒转化毕赤酵母菌X-33及鉴定 |
| 2.3 多拷贝Mut~+型转化子的筛选结果 |
| 2.4 多拷贝Mut~+型转化子的原始诱导表达及鉴定 |
| 2.4.1 表达产物的SDS-PAGE鉴定 |
| 2.4.2 表达产物的ELISA鉴定及最佳诱导时间 |
| 2.5 酵母表达条件的初步优化 |
| 2.5.1 最佳诱导菌体密度 |
| 2.5.2 最佳诱导pH值 |
| 2.5.3 最佳诱导甲醇剂量 |
| 2.6 抗体的优化表达及纯化 |
| 2.7 酵母表达单链抗体化学免疫特性初步分析 |
| 2.7.1 抗原和抗体的工作浓度 |
| 2.7.2 酵母表达抗甲胺磷单链抗体抑制曲线 |
| 2.7.3 抗体特异性考察 |
| 2.8 酵母表达单链抗体的稳定性 |
| 2.8.1 4℃保存条件下的稳定性 |
| 2.8.2 遗传稳定性 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 总结、创新点及展望 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
（8）抗PEA单抗和单链抗体制备及在绿脓感染中的应用（论文提纲范文）
| 提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 烧伤感染及绿脓杆菌外毒素 A |
| 第二章 单链抗体研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 重组 PEA 受体结合区基因在大肠杆菌中的表达及免疫实验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 抗 PEA 受体结合区单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 抗 PEA 受体结合区单克隆抗体在严重绿脓杆菌感染中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 抗 PEA 单链抗体基因的克隆及原核表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 （PEA-1）ScFv 表达纯化复性与生物学特性的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文及其他成果 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| CURRICULUM VITAE |
（9）重组人抗狂犬病毒抗体的实验研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 前言 |
| 第一章 文献回顾 |
| 第一节 抗体和基因工程抗体 |
| 第二节 重组抗体的表达系统 |
| 第三节 抗体工程药物 |
| 第四节 抗狂犬病毒抗体研究进展 |
| 第二章 人小分子抗体scFv-Fc毕赤酵母表达筛选体系的建立 |
| 材料和方法 |
| 结果和讨论 |
| 第三章 RS3 工程菌中试规模发酵及纯化 |
| 材料和方法 |
| 结果和讨论 |
| 第四章 人抗狂犬病毒全分子抗体在毕赤酵母中的分泌表达 |
| 材料和方法 |
| 结果和讨论 |
| 研究总结 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间的学术成果 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
（10）人源抗GSH单链抗体的筛选及表达（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1. 谷胱甘肽过氧化物酶 |
| 2. 抗体 |
| 3. 噬菌体展示抗体库 |
| 4. 外源蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 5. 本论文的实验意义 |
| 第二章 从噬菌体展示人源抗体库中筛选抗GSH单链抗体 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三章 人源抗GSH单链抗体在大肠杆菌中的表达 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 致谢 |
四、人源抗HBs基因工程抗体在E.coli中的高效表达与折叠（论文参考文献）
- [1]快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究[D]. 周兵. 厦门大学, 2018(06)
- [2]猪瘟病毒E2蛋白猪源化单克隆抗体rHQ06Sw的嵌合表达及抗病毒活性鉴定[D]. 陈姝承. 天津农学院, 2017(07)
- [3]利用大肠杆菌和烟草表达的重组全人源药用抗EGFR单链抗体的抗肿瘤分析[D]. 李素芬. 聊城大学, 2015(02)
- [4]Fab类抗体的研究进展[J]. 刘美君,高向东,徐晨. 国际药学研究杂志, 2014(03)
- [5]抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体scFV98H的制备及应用研究[D]. 袁若森. 吉林大学, 2014(09)
- [6]人源抗VEGFR2单链Fab抗体克隆表达研究[D]. 刘运洪. 昆明医学院, 2011(10)
- [7]抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的构建、筛选及单链抗体的表达与特性研究[D]. 李铁军. 南京农业大学, 2008(05)
- [8]抗PEA单抗和单链抗体制备及在绿脓感染中的应用[D]. 万忠海. 吉林大学, 2008(11)
- [9]重组人抗狂犬病毒抗体的实验研究[D]. 王丁丁. 吉林大学, 2007(04)
- [10]人源抗GSH单链抗体的筛选及表达[D]. 李杰帅. 吉林大学, 2007(03)