一、THE EXPRESSION OF P53 PROTEIN AND P21~(WAFl/cipl/sdil) IN GASTRIC CARCINOMA（论文文献综述）
吕蓓蓓[1]（2020）在《胃癌中SPIN1的异常表达及作用机制研究》文中认为研究背景:胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。研究数据显示其死亡率位居第三位。由于症状隐匿,难以早期发现,胃癌患者就诊时多为中晚期,5年生存率不足20%,对国民的健康造成了严重的危害。由于胃癌的异质性较高,组织学形态多样,胃癌的系统性治疗近年来无显着性进展,治疗手段非常有限。尽管术后化疗是进展期胃癌患者的主要治疗手段,可适当延长总生存期,但存在多种不良反应,部分患者难以耐受,且治疗过程中容易耐药。随着胃癌发生、发展分子机制研究的不断深入,胃癌的分子靶向治疗逐渐崭露头角,但是除了曲妥珠单抗的应用使少部分HER-2阳性的晚期胃癌患者获益外,其他靶向药物的临床疗效不尽人意。因此,寻找在胃癌发生发展中敏感和特异的基因改变,并深入探索其发挥作用的分子机制,对胃癌的临床诊治以及提供抗癌药物的研究新靶点等方面都具有重要的理论和实际意义,符合当前我国胃癌个体化治疗的迫切需求。SPIN1（又名Spindlin1）,是SPIN/SSTY基因家族的主要成员,最先在小鼠中发现作为从卵母细胞向胚胎过渡时期的主要母体转录物,在配子发生中发挥重要作用。近年来的研究表明,SPIN1在多种人类恶性肿瘤如卵巢癌、肺癌、乳腺癌及脂肪肉瘤中高表达,SPIN1基因过表达可促使小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3细胞发生恶性转化。本课题组前期在乳腺癌中的研究发现SPIN1在乳腺癌耐药及转移性组织中表达上调,通过正向调控PI3K/Akt通路、药物代谢酶进而促进乳腺癌细胞的化疗耐药性及迁移浸润,抑制细胞凋亡。以上结果均提示SPIN1可能作为一个重要的癌基因,参与恶性肿瘤的发生和发展。但是目前关于SPIN1与胃癌的关系未见相关研究,此外SPIN1在肿瘤中高表达的分子机制仍不明确。本研究在临床样本水平阐明了 SPIN1与胃癌临床病理参数及预后的关系,在转录水平上探索胃癌中SPIN1高表达的上游调控机制。通过体内外功能实验明确SPIN1对胃癌细胞增殖、浸润和转移能力的影响,并进一步阐明了 SPIN1促进胃癌迁移、浸润及增殖的分子机制。研究方法:（1）通过生物信息学分析、免疫组化及实时定量PCR明确SPIN1在胃癌组织及细胞中的表达情况,进一步分析SPIN1表达与胃癌患者临床病理参数及预后的关系。（2）为了探索胃癌中SPIN1高表达的上游调控机制,构建SPIN1上游启动子区的截短质粒并进行双荧光素酶实验,明确SPIN1的核心启动子区。使用生物信息学网站预测可能与SPIN1核心启动子区结合的转录因子,并进一步通过双荧光素酶实验、RT-qPCR、Western blot及染色质免疫共沉淀（ChIP）实验验证转录因子对SPIN1的调控作用。（3）体外细胞学实验通过Transwell实验、MTS、EDU细胞增殖实验及平板克隆形成实验检测过表达及干扰SPIN1后对胃癌细胞迁移、浸润及增殖能力的影响,通过流式细胞学技术检测过表达及干扰SPIN1后对胃癌细胞凋亡能力及细胞周期的影响。（4）使用全基因表达芯片、实时定量PCR、Western blot等结合文献报道阐明SPIN1调节的靶基因并分析其参与的信号通路,进一步探讨SPIN1对靶基因的直接调控作用。免疫组化检测靶基因在胃癌及非肿瘤性胃粘膜组织中的表达情况,分析其与胃癌患者预后的关系及与SPIN1的相关性。（5）体内验证SPIN1对胃癌细胞浸润及增殖能力的影响,并初步判定其作为胃癌治疗靶点的可行性。通过免疫组化检测实验组及对照组瘤体组织中Ki67的表达情况,分析其相关性。新鲜的瘤体组织提取RNA及蛋白验证体外鉴定的SPIN1参与调控的信号通路。研究结果:（1）SPIN1在胃癌组织中表达升高,且与不良预后密切相关TCGA数据分析显示,SPIN1在人类胃癌样本中的表达较非肿瘤性胃粘膜组织中明显升高。Kaplan-Meier Plotter网站进行生存分析结果显示,SPIN1高表达的患者较低表达者有较差的总生存期和首次进展生存期。免疫组化结果显示SPIN1在非肿瘤性胃粘膜组织、胃癌原发灶及淋巴结转移灶中高表达的比例逐渐增高。另外,SPIN1在伴有淋巴结转移的胃癌中的表达明显高于没有淋巴结转移的胃癌组织,提示SPIN1可能与胃癌淋巴结转移有关。临床病理参数分析显示SPIN1高表达与淋巴结转移、远处转移、临床分期及分化程度密切相关。Kaplan-Meier生存分析显示,SPIN1高表达与较差的总生存（OS）和无病生存（DFS）相关。Cox 比例风险回归模型进行单因素和多因素分析结果表明,SPIN1表达、临床分期、淋巴结转移及远处转移与胃癌患者的OS显着相关,而只有远处转移是OS的独立预后因素。ROC曲线分析显示SPIN1表达可以较好地区分胃癌有无淋巴结转移、临床分期、分化程度以及有无远处转移。（2）转录因子E2F1结合在SPIN1的启动子区并激活SPIN1转录通过UCSC网站找到人SPIN1的启动子序列,下载SPIN1转录起始位点上游2000bp序列。构建SPIN1上游启动子区的系列截短片段质粒,双荧光素酶实验结果表明SPIN1上游-374～-75 bp区域是其核心启动子区。我们进一步利用JASPER和PROMO网站对该转录因子结合位点区域进行预测分析。结果显示在SPIN1核心启动子区域有SP1、E2F1、YY1等多个转录因子的潜在结合位点。结合转录因子功能,我们选择SP1、E2F1、YY1和CEBPβ进行后续验证。通过双荧光素酶实验、RT-qPCR及Western blot实验表明E2F1可以激活SPIN1转录,并通过ChIP实验验证了 E2F1可以与SPIN1启动子区域直接结合。（3）SPIN1促进胃癌细胞的迁移、浸润和增殖课题组前期已构建了 SPIN1的过表达质粒,并设计合成了 3条SPIN1小干扰序列。通过RT-qPCR验证了过表达及干扰效率。Tanswell实验结果表明过表达SPIN1可显着促进胃癌细胞的迁移和浸润能力,而干扰SPIN1则可抑制胃癌细胞的迁移和浸润能力。MTS、EdU及平板克隆形成实验表明过表达SPIN1后,胃癌细胞的增殖能力显着增加,而干扰SPIN1后其增殖能力明显减弱。（4）SPIN1促进胃癌细胞周期进展,对胃癌细胞凋亡没有影响由于SPIN1可以促进胃癌细胞增殖,接下来我们确定SPIN1过表达或敲除是否会影响胃癌细胞的细胞周期或凋亡能力。流式细胞学实验结果显示,SPIN1过表达能促进细胞周期G1期向S期过渡,而抑制SPIN1表达则会引起S期细胞数量减少。结果表明,SPIN1在G1/S期转换中起着重要作用。接下来,我们研究了 SPIN1对细胞凋亡的影响。Annexin V-FITC检测结果显示,过表达及干扰SPIN1后实验组和对照组之间的细胞凋亡比例无明显差异。这些结果表明,SPIN1介导的胃癌细胞增殖能力提高是由于其对细胞周期的调控而实现的。（5）SPIN1通过调控EMT促进胃癌细胞迁移、浸润通过Western blot实验检测过表达/沉默SPIN1后胃癌细胞中EMT相关蛋白 Vimentin、Zeb1、Zo-1、β-catenin、Snai1、Slug 及 Claudin-1 的变化。结果表明与对照组相比,过表达SPIN1后Slug表达上调,Claudin-1表达下调;干扰SPIN1后Slug相应的表达下调而Claudin-1表达上调,其余蛋白未见明显变化。结果提示SPIN1可能通过调控Slug及Claudin-1参与EMT进程。（6）SPIN1通过激活MDM2-p21-E2F1信号通路促进胃癌细胞的增殖基因表达芯片结合文献报道,选择MAP2、MDM2、MAPKBP1和GPNMB等4个癌症相关基因作为SPIN1的候选下游调控靶基因进行研究。RT-qPCR和Western blot结果显示,当SPIN1过表达时,MDM2的mRNA水平和蛋白表达量增加,而MAP2、MAPKBP1和GPNMB的mRNA和蛋白表达量无明显变化。MDM2是细胞周期调控的重要媒介,细胞学实验也表明SPIN1可以促进胃癌的细胞周期进展,我们推测SPIN1通过MDM2介导的信号通路促进胃癌的细胞周期进展。通过RT-qPCR和Western blot检测MDM2、p21、p27以及相关细胞周期调节因子的表达。结果发现,干扰SPIN1降低了MDM2、CDK4、CyclinD1和E2F1的mRNA及蛋白水平,p21表达升高。而当SPIN1过表达时,MDM2、CDK4、CyclinD1、P-RB和E2F1的蛋白表达增加,而p21蛋白表达减少,mRNA无明显变化。以上结果表明SPIN1可以正向调控MDM2-P21-E2F1信号通路。如前所述,E2F1作为转录因子可以直接激活SPIN1的转录,由此形成了正反馈环路,使SPIN1处于持续激活的状态,促进胃癌的进展。为了进一步研究SPIN1和MDM2的相关性,免疫组化方法检测胃癌和非肿瘤性胃粘膜组织中MDM2的表达情况。结果显示,MDM2在非肿瘤性胃粘膜组织中呈阴性,伴淋巴结转移的胃癌中MDM2的表达高于无淋巴结转移的胃癌。Kaplan-Meier生存分析显示,MDM2的高表达与较差的OS和DFS相关。Spearman’s相关分析结果显示,MDM2与SPIN1呈正相关。为了验证我们的结果,我们进一步基于TCGA数据分析MDM2的表达及预后价值,结果显示MDM2在人类胃癌样本中的表达与非肿瘤性胃粘膜组织相比明显升高。利用Kaplan-Meier Plotter进行的生存分析显示,MDM2高表达的患者总体生存率较低,与我们的结果一致。这些数据进一步证明,SPIN1通过MDM2介导胃癌细胞增殖。（7）SPIN1通过与H3K4me3结合直接调控MDM2的表达为了进一步阐明SPIN1调控MDM2表达的分子机制,使用UCSC基因组浏览器预测MDM2的上游存在H3K4me1、H3K4me3和H3K27AC的富集峰。文献报道SPIN1是一种组蛋白代码读取器,可以识别H3K4me3。因此,我们推测SPIN1通过识别H3K4me3促进MDM2的转录激活。随后,我们利用抗H3K4me3抗体进行CHIP-qPCR检测。结果显示MDM2启动子区存在H3K4me3。最后我们利用抗SPIN1抗体进行Co-IP实验,验证了胃癌细胞中内源性SPIN1与H3K4me3之间的直接结合作用。以上研究结果表明,SPIN1通过与MDM2启动子的H3K4me3结合,促进了 MDM2的转录激活。由于MDM2是已知的p53的重要靶基因,为了进一步确定SPIN1对MDM2的调控是否依赖于p53,我们进行了拯救实验。结果显示当p53被敲除时,SPIN1的过表达仍然会增加MKN45和BGC823（野生型TP53）细胞中MDM2的表达。同样,当野生型p53过度表达时,SPIN1敲除仍会降低SGC7901（突变型TP53）细胞中MDM2的表达,结果表明SPIN1对MDM2的调控作用是不依赖于p53的。（8）SPIN1可作为抑制体内胃癌生长的治疗靶点为了初步探究SPIN1是否可以作为胃癌治疗的靶点,我们进行了动物实验。裸鼠皮下成瘤后,根据瘤体大小和体重匹配的原则分为实验组和对照组。将慢病毒包装的LV-ShRNA-SPIN1及对照LV-NC分别注入瘤体内,多点多次注射,每7天1次。经过30天的持续观察,我们发现LV-ShRNA-SPIN1组与LV-NC组相比,肿瘤体积明显缩小。此外,LV-ShRNA-SPIN1组中的肿瘤结节是非侵袭性的,而NC组的肿瘤却部分出现了边缘和周围纤维间质或肌肉组织的浸润。Ki-67的免疫组化显示,LV-shRNA-SPIN1组的胃癌细胞的阳性率低于LV-NC组。综上所述,这些发现初步表明SPIN1可作为胃癌治疗的靶点。为了进一步研究SPIN1体内促进胃癌细胞增殖的分子机制,提取新鲜瘤体的RNA和蛋白通过RT-qPCR及Western blot验证MDM2-P21-E2F1信号轴,与体外细胞学的实验结果一致。结论:本研究首次阐明了 SPIN1作为癌基因促进胃癌的发生、发展;SPIN1高表达与胃癌患者不良预后密切相关。E2F1可以直接结合到SPIN1的启动子区并激活SPIN1转录,SPIN1通过与MDM2启动子区域的H3K4me3结合,促进MDM2转录,并进一步正向调控MDM2-p21-E2F1信号通路,因此形成了正反馈环路,使SPIN1处于持续激活状态,促进胃癌进展。SPIN1可作为胃癌的潜在治疗靶点。
李雪[2]（2020）在《RRP12在胃癌发生中的作用及机制研究》文中提出研究背景胃癌是一种恶性肿瘤,主要发生于胃黏膜上皮。胃癌发病率居于世界第四位,位居肿瘤相关死亡率第三位,进展期胃癌术后五年生存率低。在胃癌发生的过程中,基因的异常表达调控起到不可或缺的作用。基因的异常表达调控会对细胞多种功能起到直接或间接影响。RRP12（ribosomal RNA processing 12 homolog）,参与真核生物核糖体亚基的成熟和转运,是一种RNA结合蛋白。RRP12是一种核蛋白,但是它可以穿过核膜参与pre-rRNA的运输与装配。RRP12主要参与核糖体40S和60S亚基前体的核外运输。虽然RRP12的表达缺失会削弱60S和40S亚基的核外运输,但是RRP12缺失后酵母的核糖体总量变化不大。并且已有研究证明RRP12可以调节酵母的细胞周期和DNA损伤应答。目前仅有的研究证明,在骨肉瘤细胞中,RRP12可以增强细胞对化疗药物的抗性,干扰RRP12表达后,p53的表达明显上调。但是RRP12促进细胞抵抗化疗药物,促进细胞增殖、调节p53表达的机制尚不清楚。RRP12在其他肿瘤中的作用也未见报道。我们首次研究了 RRP12在胃癌中的作用及其调控机制,发现RRP12可通过调控p21的表达促进细胞增殖,抑制细胞衰老,促进胃癌的发生。实验目的研究RRP12在人胃癌组织和癌旁正常胃黏膜组织中的表达情况,以及干扰RRP12对胃癌细胞增殖、细胞衰老和细胞周期进程的作用,并阐明其作用的分子机制,为评价RRP12作为一种新的胃癌诊断标志物和治疗靶点的可行性提供数据支持。实验方法1.RRP12在人胃癌组织标本中的表达免疫组化检测癌旁和胃癌组织切片中RRP12的蛋白表达水平,评估其是否能作为胃癌的潜在诊断标志物。2.RRP12对在体外胃癌细胞生物学行为的影响检测不同的胃癌细胞系中RRP12 mRNA的表达水平。利用包被有RRP12干扰序列载体的慢病毒（Lentivirus-RRP12）和阴性对照（Lentivirus-negative control）处理RRP12表达水平较高的两个细胞BGC823和AGS,并构建稳定干扰RRP12的细胞株。检测稳转细胞系中RRP12的mRNA和蛋白表达水平。稳定干扰RRP12细胞系的增殖能力通过CCK8和克隆形成检测;通过β-半乳糖苷酶染色实验检测干扰RRP12对胃癌细胞衰老的影响;稳定干扰RRP12细胞系细胞周期变化通过PI染色后流式细胞术检测;稳定干扰RRP12细胞系的迁移和侵袭能力通过transwell实验检测。3.RRP12对在体内胃癌细胞生物学行为的影响Western blot检测稳转细胞系中RRP12的表达水平,将对照和稳定干扰RRP12表达的细胞注射到裸鼠腋下或尾静脉,检测RRP12在体内对胃癌细胞功能的影响。4.RRP12调控细胞增殖和细胞周期的分子通路稳定干扰RRP12的BGC823、AGS细胞株与其对照细胞提取总蛋白,检测与调控细胞周期进程、影响细胞增殖和细胞衰老相关的关键分子,包括p53、p21、p27及细胞周期调控蛋白,明确RRP12调控细胞增殖和细胞周期进程的分子机制。。5.RRP12是否通过p53调控p21的表达在稳定干扰RRP12的BGC823和AGS细胞株与对照细胞中检测p21 mRNA的表达水平变化。筛选稳定干扰RRP12的AGS细胞株,干扰p53后检测p21的表达变化。稳定干扰RRP12的AGS、BGC823细胞株,加入环己酰胺孵育0、15、30、60、90、120min后提取蛋白,检测p21半衰期的变化。过表达RRP12并加入MG132处理后检测p21的表达变化。6.Co-IP与质谱寻找与RRP12相互作用蛋白首先通过co-IP实验获取与RRP12相互结合的蛋白,通过质谱技术进行RRP12结合蛋白的定性检测,根据western blot结果筛选调控细胞衰老、细胞周期的关键效应分子。最后通过co-IP确定该分子与RRP12的相互作用。7.幽门螺杆菌对RRP12在胃癌细胞中表达的影响使用幽门螺杆菌Hp11637和Hp26695感染胃癌细胞,MOI=100。感染2、4、6和8小时后收取细胞,Western blot检测各组中RRP12蛋白表达水平。实验结果1.RRP12在胃癌临床组织标本中高表达IHC结果显示胃癌组织中RRP12表达水平明显高于癌旁组织,RRP12主要表达在细胞质中。2.干扰RRP12的表达抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,诱导胃癌细胞衰老和细胞周期停滞QRT-PCR结果表明,RRP12在BGC823和AGS细胞中表达较高;利用包被有RRP12干扰载体的慢病毒（Lentivirus-RRP12）感染胃癌细胞BGC823和AGS,构建稳定干扰RRP12的细胞株。稳定干扰RRP12的细胞株中RRP12的mRNA和蛋白表达均低于对照细胞。细胞功能实验表明,稳定干扰RRP12细胞株的克隆形成能力显着降低和细胞增殖能力显着降低（***P<0.001）;β-半乳糖苷酶染色结果显示,干扰RRP12后实验组衰老的细胞数量明显增多（**P<0.01）;流式细胞术分析细胞周期结果显示,下调RRP12后,胃癌细胞S期细胞数量显着减少,G1期细胞数量明显增多,G1期到S期的进程受到抑制（*P<0.05）;transwel实验表明,稳定干扰RRP12细胞株的迁移和侵袭能力显着减弱（***P<0.001,***P<0.001）。3.干扰RRP12后胃癌细胞在体内增殖和转移能力受到抑制Western blot首先确定稳定干扰RRP12的BGC823细胞中RRP12表达明显低于对照细胞。随后腋下注射细胞,对照组观察到瘤体后开始测量,记录。记录完成后处死裸鼠,对瘤体拍照、称重。结果表明,与对照组相比,稳定干扰RRP12的胃癌细胞在体内的增殖能力明显弱于对照细胞（**P<0.01,***P<0.001）。裸鼠尾静脉注射胃癌细胞,35天后进行活体成像,结果显示对照组的荧光强度明显高于干扰组（**P<0.01）。处死裸鼠并解剖,肝肺荧光信号采集后发现对照组细胞比稳定干扰RRP12的胃癌细胞肝和肺部转移能力更强（*P<0.05）。肉眼观察发现,实验组肿瘤结节少于对照组,实验组肝肺的体积也小于对照组,实验组肺重量明显小于对照组（**P<0.01）。肝和肺部瘤体切片H&E染色结果显示RRP12干扰组裸鼠肝部和肺部肿瘤转移明显减少。4.下调RRP12的表达影响p21相关信号通路中分子的表达Westernblot检测发现,稳定干扰RRP12的细胞株,AGS和BGC823细胞中p21、p27的蛋白表达水平高于对照细胞,CDK2、CDK6和cyclin E1蛋白表达水平低于对照细胞,p53、p16的表达无差异,提示RRP12可能通过负向调控p21的表达诱导胃癌细胞衰老逃逸和促进细胞周期进程。5.RRP12通过不依赖于p53的途径调控p21的表达在稳定干扰RRP12的BGC823和AGS细胞株中,我们通过qRT-PCR检测发现p21 mRNA的水平并没有明显变化（nsP>0.05）。同时干扰RRP12和p53的AGS细胞中p21的蛋白水平显着低于只干扰RRP12的AGS细胞中p21的水平,但是明显高于只干扰p53胃癌细胞中的p21的表达水平。因此我们推测,RRP12可能通过独立于p53的方式调控p21的表达。加入环己酰胺抑制蛋白质合成后,干扰RRP12,p21降解速率明显变慢,半衰期延长（***P<0.001）。因此,在胃癌细胞中RRP12可能通过促进p21的降解调控p21的表达。随后,过表达RRP12并加入泛素化蛋白酶体抑制剂MG132,结果显示加入MG132可以显着上调由过表达RRP12引起的p21的表达降低。因此,RRP12可以通过泛素化蛋白酶体途径调节p21的表达。6.RRP12通过与SKP1相互作用调控p21的降解为进一步明确RRP12调控p21的机制,我们在胃癌细胞中做了 co-IP实验和质谱检测。结果提示RRP12可以与SKP1相互作用。Western blot检测发现干扰RRP12表达后SKP1蛋白水平并没有明显变化。我们猜测RRP12通过影响SCF复合物的稳定性促进p21的降解诱导胃癌细胞的衰老逃逸和细胞周期停滞。7.幽门螺杆菌能够上调胃癌细胞中RRP12的表达水平Hp11637和Hp26695以MOI=1:100感染BGC823和AGS细胞,分别感染2、4、6和8小时后,Western blot结果显示BGC823和AGS细胞中RRP12蛋白水平逐渐升高。
杨京彦[3]（2019）在《MCM7在胃癌组织中的表达及对胃癌细胞增殖、侵袭和转移的影响及机制》文中提出背景目前在我国,胃癌的死亡率和发病率居高不下。近年来,随着手术、新辅助化疗、靶向治疗等综合治疗的进步,胃癌患者的预后已经得到了初步改善,但大多数患者,尤其是进展期胃癌患者的预后仍较差。所以,对胃癌及癌前病变患者进行早期诊断和早期治疗,对提高其生存率、改善其预后具有重要意义。但是,目前还没有针对早期胃癌的精准的病理诊断标准。统计数据显示,我国早期胃癌的检出率尚不足10%,这表明早期胃癌的诊治还有很大的提升空间。胃癌的发生及进展是一个极其复杂的多步骤过程。具体过程可分为:正常胃粘膜—胃粘膜肠上皮化生—胃上皮内瘤变—胃癌。在这个过’程中,多种因素都可对其产生影响,导致很多病变的形态不典型;另外,大多数早期胃癌的病理诊断均基于胃镜活检小标本,不仅数量有限,而且观察视野有限,有时很难准确区分,导致同一例病理标本不同的病理工作者会做出不同的病理诊断。在我国,胃癌多为肠型胃癌。公认的Lauren分型,将胃腺癌分为肠型、弥漫型和混合型三种类型。与胃腺癌相关的胃上皮内瘤变以及胃粘膜内癌的早期诊断对胃癌患者的治疗及预后起着至关重要的作用。一直以来,胃粘膜低级别瘤变（low grade neoplasia,LGN）与非肿瘤性病变--例如肠上皮化生（intestinal metaplastic,IM）尤其是复杂肠化修复性增生之间的鉴别、胃粘膜高级别瘤变（high grade neoplasia,.HGN）与胃浸润性粘膜内癌（gastric intramucosal carcinoma,GIC）之间的鉴别均存在很大困难。病理学诊断在形态学上出现难以鉴别的情况时往往会参考相关分子指标检测来辅助诊断。分子检测指标的发展依赖于胃癌发生发展机制的相关信号通路的深入的研究。我们希望可以发现能帮助临床诊断,可以进一步明确癌前病变和早期胃癌,预测胃癌预后的实用指标。微小染色体维持蛋白家族（minichromosome maintenance proteins,MCMs）是一组在真核生物中广泛存在的高度保守蛋白家族,与DNA复制密切相关。它主要参与DNA复制许可和控制细胞周期进展,是复制准许因子中的一个重要成员,因此,MCMs蛋白水平能够敏感而特异地反映细胞增殖程度。微小染色体维持蛋白7（mini-chromosome maintenance protein 7,MCM7）作为MCMs家族的一员,是MCMs蛋白复合体的一部分,是真核细胞DNA复制起始所必需的解旋酶。目前多项研究表明,MCM7参与调控细胞周期、影响转录和细胞增殖,与肿瘤形成密切相关,在多种恶性肿瘤中如前列腺癌、肝癌、食管癌、结肠癌等中均高表达。它可促进肿瘤增殖、抑制凋亡,还与上述多种肿瘤的转移显着相关,MCM7高表达预示着肿瘤患者的预后不良。但是,MCM7在胃癌中的表达和临床意义却很少被提及,其发挥作用的机制也尚不清楚。本研究的主要目的在于,检测MCM7在胃黏膜病变组织中及胃癌组织中的表达情况,并分析MCM7的表达和胃癌患者临床病理参数及预后之间的关系,阐明MCM7对胃癌细胞增殖、浸润和迁移能力的影响,并探讨MCM7参与胃癌细胞浸润转移的可能调节机制。第一章MCM7在早期胃癌中的表达及其诊断意义研究目的:检测微小染色体维持蛋白7（MCM7）在不同病理阶段胃粘膜病变中的表达情况,明确其作为一种生物标志物在区分上皮内瘤变与胃粘膜病变中的作用,并探讨MCM7的表达是否与胃癌的多步骤进程有关。研究方法:纳入我院收治的93例患者的各类胃粘膜病变的病理标本作为研究对象。标本共分6组:胃炎组18例;肠上皮化生组16例;低级别上皮内瘤变l 1例;高级别上皮内瘤变8例;浸润性粘膜内癌13例;粘膜下浸润性癌27例。应用免疫组织化学方法检测各组标本中的MCM7和Ki67表达,用光学显微镜进行评分。细胞核MCM7和Ki67染色作为阳性。所得数据进行统计学分析。研究结果:胃炎组中MCM7和Ki67的表达低于其它组（P0.001）,在肠上皮化生组中MCM7和Ki67的表达与其他组相比差异有统计学意义（P<0.001）。在胃浸润性腺癌中MCM7和Ki67表达最高（P<0.05）。在胃粘膜上皮内低级别瘤变、上皮内高级别瘤变和粘膜内癌组中MCM7表达差异无统计学意义（P>0.05）。Ki67表达显示胃粘膜低级别瘤变组和粘膜内癌组比较差异有统计学意义（P<0.05）。同时,MCM7表达随肿瘤分级升高而升高,与Ki67呈显着正相关（r=0.940,P<0.001）。而且在部分病例中,一些肿瘤细胞对MCM7有免疫反应,但对Ki67呈阴性。研究结论:MCM7表达有助于对胃黏膜病变的病理分级做由鉴别诊断,联合MCM7与ki67可作为评价癌前病变和早期胃癌的更为敏感的增殖标志物。同时,MCM7表达与胃癌的发生呈正相关,MCM7表达可能促进胃癌的发生发展。第二章MCM7对胃癌细胞增殖、侵袭及迁移的作用研究目的:研究MCM7在胃癌组织中的表达,分析MCM7与患者临床病理指标、患者总体生存率之间的关系;应用RNA干扰技术,构建靶向MCM7基因的siRNA,转染人胃癌细胞,观察敲除MCM7后,胃癌细胞增殖和侵袭、迁移能力的变化。研究方法:1.以58例胃癌患者的病理标本作为研究对象,制备蜡块后切片,免疫组化法检测MCM7蛋白在胃癌组织中的表达。计数肿瘤细胞MCM7核染色阳性细胞的百分比,据此分组,阳性细胞占计数细胞百分比≤50%为MCM7低表达,百分比>50%为MCM7高表达。分析MCM7的表达与患者临床病理特征、总体生存率之间的相关性。2.选用人胃癌细胞系MGC-803和人正常胃上皮细胞系GES-1,一方面通过siRNA干扰降低MCM7在胃癌细胞中的表达（siMCM7组和对照组NC）,另一方面,反方向在胃上皮细胞中过表达MCNM7基因（dsMCM7组和对照组NC）。通过CCK-8试验、细胞平板克隆实验、Transwell试验、细胞划痕试验等方法检测正常胃上皮细胞和胃癌细胞的增殖、侵袭、迁移等生物学行为的变化。研究结果:1.MCM7主要表达于浸润性胃腺癌细胞的细胞核中:58例胃癌患者中MCM7低表达17例（29.3%）,MCM7高表达41例（70.7%）,说明在浸润性胃癌中,多数病例会出现MCM7高表达。同时,MCM7表达与胃癌淋巴结转移、TNM分期明显相关:在淋巴结转移组MCM7的表达显着高于无淋巴结转移组（P<0.001）;TNM分期越高,其表达的程度越高（P=0.05）。术后总体生存率MCM7高表达的患者明显低于MCM7低表达的患者（P=0.018）,说明MCM7高表达的患者预后差。2.CCK-8试验结果表明:沉默MCM7后,细胞增殖能力相比对照组明显降低,在48小时有明显抑制,差异具有统计学意义（p<0.0001）;同样,在细胞克隆实验中,沉默MCM7后,细胞克隆数目显着降低,差异有统计学意义（p<0.0001）。划痕实验与Transwell实验结果也提示:相比对照组,siMCM7组的胃癌细胞的体外迁移和侵袭能力明显受到抑制。与之相反,在胃正常细胞中过表达MCM7后,CCK-8试验表明dsMCM7组增殖相比对照组明显升高,在48、72小时均有显着差异（P=0.0028,P<0.0001）;细胞平板克隆实验观察到克隆数目显着升高,差异具有统计学意义（P<0.0001）。同时,划痕实验与Transwell实验结果也显示,过表达MCM7也可显着促进胃细胞的迁移及侵袭功能。研究结论:MCM7在胃癌中的表达与肿瘤分期及淋巴结转移相关,MCM7高表达的患者,其总体生存率较低。在体外下调胃癌细胞中MCM7的表达,可对胃癌细胞的增殖、侵袭及转移能力产生显着抑制。第三章MCM7对胃癌细胞EMT的影响及可能的机制研究目的:研究MCM7对上皮-间质转化（EMT）过程的作用以及调节EMT的可能机制,探讨MCM7影响胃癌细胞侵袭和转移的可能分子机制。研究方法:采用人胃癌细胞系MGC-803和人正常胃上皮细胞系GES-1,通过siRNA干扰技术降低MCM7在胃癌细胞中的表达,并反向在胃上皮细胞中过表达MCM7基因。采取Western Blot技术检测EMT相关因子E-cadherin、N-cadherin、和Vimentin等蛋白的变化;并进一步检测PI3K/Akt信号通路中PI3K、Akt、mTOR基因蛋白的表达变化。研究结果:1.EMT相关基因蛋白表达情况:胃癌细胞siMCM7组:上皮的标志物如E-cadherin的表达显着升高,间质的标志物如N-cadherin及Vimentin的表达明显降低。而在胃上皮细胞dsMCM7组:E-cadherin的表达显着降低,而N-cadherin及Vimentin的表达明显上调。2.PI3K/Akt/mTOR通路相关基因蛋白的表达:胃癌细胞siMCM7组中,PI3K蛋白表达降低,Akt和mTOR未见明显变化,而p-Akt和p-mTOR降低。而在胃上皮细胞dsMCM7组中,PI3K蛋白可见表达上调,Akt和mTOR无明显变化,.但p-Akt和p-mTOR可见表达上调。研究结论:MCM7表达与胃癌细胞EMT进程相关。并且MCM7可能是通过PI3K/Akt/mTOR信号通路,来调控EMT相关基因的表达,进而最终影响胃癌细胞体外的侵袭和迁移。
都小龙[4]（2019）在《miR-34a-5p/UHRF2及相关信号通路在红芪多糖治疗胶质瘤中作用机制的研究》文中研究表明研究背景人胶质瘤（glioma）是最为致命的原发性中枢神经系统肿瘤之一,不管是采取手术、放疗或者化疗,其预后效果极差,治疗后中位生存期（median survival）仅为12～15个月。探索胶质瘤的发病机制,寻找新的有效治疗靶点成为当前胶质瘤研究的热点。胶质瘤具有显着异质性的特征,表现为子代胶质瘤细胞的基因表达和表型同母代胶质瘤细胞截然不同,在细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、肿瘤侵袭及耐药性等方面表现出明显的恶化倾向。异质性是胶质瘤细胞不断进化并适应外界微环境从而导致恶性进展,以至最终逃避临床治疗的原因所在。本研究试图从基因角度阐明胶质瘤病理发展的分子生物学机制,这可能为胶质瘤的治疗提供新的方法。红芪多糖（Hedysarum polybotrys polysacchcrides,HPS）来自于多序岩黄耆的根部,是一种生物活性大分子物质。大量的研究显示,HPS既可以直接杀伤多种癌症肿瘤细胞,也可以通过免疫调节等间接方式抑制多种癌症的发展,但HPS对胶质瘤发生发展的影响尚无明确报道。UHRF2（ubiquitin like with PHD and RING finger domains 2,泛素样含 PHD 和环指域2）是一种泛素样蛋白,具有细胞周期调控、基因组稳定性调控、泛素-蛋白酶体调节以及表观遗传学调控等多方面的复杂功能。UHRF2基因在细胞周期调控中占据中心地位,被认为是一种潜在的抑癌基因。微小RNA（MicroRNAs,miRNAs）是一种长度包含18～27个核苷酸的单链小型非编码RNA（non-coding RNAs,ncRNA）。miRNAs通过靶向结合mRNAs,诱导其转录后沉默进而调控基因的蛋白表达。近年来,miRNAs已经公认为是一类新的癌症治疗靶点。第一部分人胶质瘤组织UHRF2及相关miRNAs的表达特征研究目的探讨人胶质瘤及正常脑组织中UHRF2及相关miRNAs的表达水平差异,以及UHRF2同细胞周期蛋白cyclin E1/cyclin D1的表达水平相关性。方法收集30例通过手术切除的胶质瘤组织和10例非肿瘤性正常脑组织（normal brain tissue,NBT）,其中包括14例低级别胶质瘤组织（low grade glioma,LGG,包括WHO Ⅰ级和WHO Ⅱ级胶质瘤）和16例高级别胶质瘤组织（high grade glioma,HGG,包括WHO Ⅲ级和WHO Ⅳ级胶质瘤）。采用实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR,qRT-PCR）法分析 UHRF2 mRNA 表达水平和 UHRF2相关 miRNAs（hsa-miR-196b-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-98-5p 和 hsa-miR-34a-5p）的表达水平。采用蛋白免疫印迹法检测UHRF2蛋白的表达水平,及其下游cyclins E1、cyclins D1蛋白的表达水平,并采用Pearson’s相关分析法观察UHRF2同cyclins E1以及UHRF2同cyclins D1的表达水平相关性。结果1.UHRF2mRNA和蛋白表达水平在NBT、LGG和HGG中随肿瘤恶性程度增高而逐渐降低,即UHRF2表达水平同人胶质瘤的恶性进展程度呈负相关。2.cyclins E1和cyclins D1的表达水平在NBT、LGG和HGG中随肿瘤恶性程度增高而逐渐升高,即cyclins E1和cyclins D1表达水平同人胶质瘤的恶性进展程度呈正相关。3.在人胶质瘤组织中,UHRF2同cyclins E1以及UHRF2同cyclins D1的表达水平均具有负相关性,提示人胶质瘤组织中,随着UHRF2表达水平的改变,cyclins E1和cyclins D1表达水平随之变化,呈负相关性。4.同NBT相比,UHRF2相关的4种miRNAs在胶质瘤组织中表达上调,其中hsa-miR-34a-5p表达上调最为明显。结论1.UHRF2水平同人胶质瘤的恶性进展呈负相关,cyclins E1和cyclins D1水平同人胶质瘤的恶性进展呈正相关,UHRF2的改变可能会造成cyclins E1和cyclins D1 的变化。2.hsa-miR-34a-5p是上调最为明显的UHRF2相关miRNAs。第二部分红芪多糖对人胶质瘤细胞的效应及对UHRF2的影响目的在体外水平上,观察HPS对人胶质瘤细胞的抗增殖作用以及细胞周期调控作用的影响。方法培养人胶质瘤 U251 细胞株,用 0 μg/ml、50 μg/ml、250 μg/ml、500 μg/ml浓度的HPS溶液处理U251细胞48 hours,用MTT法检测HPS对U251细胞增殖的影响。用500μg/ml的HPS溶液处理U251细胞48hours,用PI染色和流式细胞法检测HPS对U251细胞周期的影响;用蛋白免疫印迹法检测U251细胞中UHRF2、cyclin E1、cyclin D1、p53、Bcl-2、Bax 蛋白的表达水平变化情况,并用 qRT-PCR 法检测 cyclin E1、cyclin D1、p53、Bcl-2、Bax 蛋白的 mRNA 表达水平变化情况。用包含UHRF2 cDNA的pcDNA-3.1质粒转染U251细胞,用蛋白免疫印迹法检测UHRF2过表达对cyclin E1、cyclin D1的表达水平影响。结果1.0μg/ml、50μg/ml、250μg/ml、500μg/ml 浓度的 HPS 溶液处理的 U251 细胞生长抑制率随HPS浓度增加而逐渐升高,并且以500μg/ml HPS溶液处理的U251细胞被阻滞于G0/G1期,提示HPS抑制U251细胞生长。2.500 μg/ml HPS溶液处理后,U251细胞的UHRF2蛋白表达水平明显升高,cyclin E1和cyclin D1的蛋白表达水平明显降低,促凋亡相关蛋白Bax和抗肿瘤相关蛋白p53表达水平升高,而抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达水平降低。3.UHRF2过表达诱导了 U251细胞的细胞周期蛋白cyclin El、cyclin D1表达减少,这一结果同HPS处理后UHRF2表达水平升高,cyclin E1和cyclin D1表达水平降低结果一致,提示HPS通过上调UHRF2表达,降低细胞周期蛋白cyclin E1、cyclin D1的表达,从而抑制U251细胞生长。结论1.HPS阻滞胶质瘤U251细胞周期于G0/G1期,抑制胶质瘤U251细胞生长。2.HPS通过上调UHRF2表达,降低cyclin E1和cyclin D1表达,抑制U251细胞生长,其作用同UHRF2过表达的作用效果相一致。第三部分 红芪多糖经mi RNA-34a-5p/UHRF2轴抑制人胶质瘤细胞的机制研究目的从UHRF2及其相关miRNAs角度分析HPS影响胶质瘤细胞发生发展的潜在分子生物学机制。方法构建包含UHRF2 3’-UTR的野生型（wt UHRF2 3’-UTR）或突变型（mut UHRF23’-UTR）荧光素酶报告基因载体,同miRNA-34a-5p mimic或者NC mimic共转染,检测共转染48hours后的荧光素酶活性。转染miRNA-34a-5p mimic后,用500μg/ml浓度的HPS溶液处理胶质瘤U251细胞48hours,用qRT-PCR法检测miRNA-34a-5p的表达水平,并用蛋白免疫印迹法检测UHRF2、cyclin E1、cyclin D1的蛋白表达水平变化,以及通过MTT法检测胶质瘤U251细胞的增殖水平。结果1.wt UHRF2 3’-UTR和miRNA-34a-5p mimic共转染后,荧光素酶活性显着降低,证实在胶质瘤U251细胞中,miRNA-34a-5p直接靶向作用于UHRF2基因。2.500μg/ml HPS溶液处理U251细胞后,miRNA-34a-5p表达水平显着降低;经HPS处理、miRNA-34a-5p mimic转染联合作用后,U251细胞中miRNA-34a-5p表达水平显着上调。3.miRNA-34a-5p过表达下调了被HPS增强表达的UHRF2表达水平,上调了被HPS降低表达的cyclin E1、cyclin D1表达水平。结论1.HPS 抑制 miRNA-34a-5p 的表达。2.miRNA-34a-5p直接靶向作用与UHRF2基因,逆转了 HPS升高UHRF2以及降低cyclin E1、cyclin D1表达水平的作用。3.HPS抑制的U251细胞增殖可被miRNA-34a-5p过表达所逆转。第四部分 红芪多糖对荷胶质瘤裸鼠肿瘤生物学特性的影响目的在体内水平上,探讨研究HPS对人胶质瘤细胞的抗增殖作用及对人胶质瘤动物模型生物学特性的影响。方法将胶质瘤U251细胞接种于免疫缺陷裸鼠皮下,建立人胶质瘤异种移植模型鼠,然后以150mg/kg、400mg/kg的HPS剂量对荷胶质瘤裸鼠进行灌胃治疗,同时设计400 mg/kg HPS灌胃和miRNA-34a-5p mimic瘤内注射实验组。胶质瘤U251细胞接种模型鼠后,每4天检测肿瘤体积变化,第24天时剥离并称量肿瘤的重量,并用蛋白免疫印迹法检测肿瘤内cyclin E1、cyclin D1、p53、Bcl-2、Bax蛋白的表达水平。结果1.150mg/kg、400mg/kg HPS给药剂量可抑制荷瘤裸鼠体内异种移植瘤的体积增长和重量增加,并且这种抑制作用的强弱同HPS的剂量呈正相关性;然而miRNA-34a-5p过表达可逆转HPS的抗胶质瘤作用,诱导胶质瘤的生长。2.150 mg/kg、400 mg/kg HPS 剂量处理组肿瘤内 cyclin E1 和 cyclin D1 表达水平明显降低,促凋亡相关蛋白Bax和抗肿瘤相关蛋白p53表达水平升高,而抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达水平降低,然而miRNA-34a-5p过表达可逆转HPS的此种作用,上调cyclin E1、cyclin D1、Bcl-2蛋白表达水平,下调Bax和p53蛋白表达水平。结论1.HPS通过下调细胞周期相关蛋白cyclin E1、cyclin D1,上调促凋亡相关蛋白Bax和抗肿瘤相关蛋白p53的水平,降低抗凋亡相关蛋白Bcl-2的水平,进而在体内水平抑制人胶质瘤的生长。2.miRNA-34a-5p逆转HPS的体内抗胶质瘤生长作用。第五部分 红芪多糖对荷胶质瘤裸鼠免疫调控的影响目的观察HPS对人胶质瘤动物模型免疫系统功能的影响。方法采用鸡红细胞刺激法,检测荷胶质瘤裸鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性和吞噬指数。收集各组裸鼠血清,采用ELISA法检测血清中TNF-α和caspase-3的浓度。结果1.150mg/kg、400mg/kg的HPS剂量能够提高荷胶质瘤裸鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性和吞噬指数,增强裸鼠的免疫功能,然而miRNA-34a-5p过表达降低了腹腔巨噬细胞的吞噬活性和吞噬指数,降低裸鼠的免疫功能。2.150mg/kg、400mg/kg的HPS剂量能够上调荷瘤裸鼠血清中下降的TNF-α和caspase-3浓度,然而miRNA-34a-5p过表达阻遏了 HPS的这种上调作用。结论HPS可增强荷瘤裸鼠的免疫功能,miRNA-34a-5p过表达阻遏了 HPS的免疫增强作用。
赵依纳[5]（2019）在《膜联蛋白A7通过p21-cyclin/CDK-PCNA-E2F信号轴调控胃癌细胞增殖的研究》文中研究指明胃癌（gastric cancer,GC）是全球常见恶性肿瘤,严重威胁人类健康。据2017年2月,国家癌症中心发布的中国最新癌症数据显示,胃癌位于我国癌症发病率第四位,死亡率第二位。化疗作为肿瘤的传统治疗手段,存在有效率低、不良反应大以及获得性耐药等问题。分子靶向治疗由于具有较好的分子选择性,可高效杀伤肿瘤细胞,减少对正常组织的损伤,因而成为肿瘤患者的主要治疗方式之一。因此,寻找阳性表达率高的基因靶点并探讨其作用机制已成为当前胃癌分子靶向治疗的迫切需要。膜联蛋白（annexin,ANX）是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白家族,该家族多个成员的表达异常与肿瘤细胞的恶性程度、转移侵袭及临床进展密切相关。多项研究表明,该家族成员膜联蛋白A7（ANXA7）表达异常与胃癌的发生、发展密切相关,许多学者已将ANXA7作为分子靶点,从多种角度探索其在肿瘤发生发展与治疗方面的作用。p21是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂,作为KIP家族的代表,不仅可以抑制CDK4/6-cyclinD和CDK2-cyclin E复合体的结合,使细胞G1→S期受阻;还可以通过与PCNA相互作用抑制DNA聚合酶延伸DNA从而抑制细胞增殖。多项研究证实p21的表达失调参与影响了胃癌的发生发展。但对于ANXA7与p21在胃癌中的相关性研究,目前国内外尚未见报道。本研究拟通过检测ANXA7和p21在胃癌中的表达,分析二者相关性;而后在体外水平改变ANXA7的表达,检测其对胃癌细胞产生的影响,并探讨其影响胃癌发生发展的机制,以初步阐明ANXA7可通过p21-cyclin/CDK-PCNA-E2F信号轴影响胃癌的发生发展,同时为ANXA7成为临床胃癌靶向治疗的潜在靶点提供新的实验依据,具有重要的临床意义。目的:1组织水平:通过检测ANXA7与p21在胃癌组织及癌旁正常胃粘膜组织中的表达,探讨ANXA7、p21在胃癌中的表达与胃癌临床病理学特征的关系及二者的相关性。2细胞水平:通过下调ANXA7在胃癌细胞中的表达,探讨ANXA7低表达对人胃癌细胞增殖的影响及其机制。方法:1组织水平:于2016年9月至2018年5月收集承德医学院附属医院及承德市中心医院共50例胃癌石蜡组织标本及20例新鲜胃癌组织标本,每例标本包含胃癌组织和相应癌旁正常胃粘膜组织。采用免疫组织化学SP法检测50例石蜡组织标本中ANXA7和p21的表达;采用Western blot方法检测20例新鲜组织标本中ANXA7和p21的表达。2细胞水平:（1）体外培养人正常胃粘膜GES-1细胞、人胃腺癌高分化MKN-28细胞、人胃腺癌中分化SGC-7901细胞和人胃腺癌低分化MGC-803细胞,采用Western blot法检测ANXA7表达最高的一株细胞。（2）将ANXA7表达最高的胃癌细胞分为si-ANXA7组、阴性对照组（si-con）和空白对照组（blank）,采用RNA干扰技术将靶向ANXA7的siRNA和阴性对照siRNA脂质体转染法分别转染胃癌细胞,空白组不予任何处理,转染后48h分别采用qRT-PCR和Western blot法在mRNA水平和蛋白水平进行抑制效率的鉴定。（3）MTT和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力。（4）流式细胞术检测细胞周期分布情况。（5）qRT-PCR和Western blot法在mRNA和蛋白水平检测p21、PCNA、cyclinD1、cyclin E、E2F1的表达情况。结果:1组织水平:（1）免疫组化实验结果显示ANXA7在胃癌组织中的阳性表达显着高于癌旁正常胃粘膜组织,差异具有统计学意义（P<0.05）。p21在胃癌组织中的阳性表达显着低于癌旁正常胃粘膜组织,差异有统计学意义（P<0.05）;ANXA7在胃癌组织中的差异表达与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移有关,差异有统计学意义（P<0.05）;p21在胃癌组织中的差异表达与肿瘤的浸润深度有关,差异有统计学意义（P<0.05）。42例ANXA7阳性表达的胃癌患者中p21阳性表达的有10例（24%）,p21阴性表达的有32例（76%）;8例ANXA7阴性表达的胃癌组织中p21阳性表达的有5例（63%）,p21阴性表达的有3例（37%）,经Spearman相关性分析显示胃癌组织中ANXA7和p21的表达呈负相关（χ2=4.79,P<0.05,rs=-0.31）。（2）Western Blot实验结果示,胃癌组织中ANXA7蛋白的表达显着高于癌旁正常胃粘膜组织,差异有统计学意义（P<0.05）;胃癌组织中p21的表达显着低于癌旁正常胃粘膜组织,差异有统计学意义（P<0.05）。2细胞水平:（1）胃癌细胞中ANXA7的表达显着高于正常胃粘膜GES-1细胞中ANXA7的表达,且ANXA7在人胃腺癌低分化MGC-803细胞株中表达最高,差异有统计学意义（P<0.05）。（2）靶向ANXA7的siRNA可显着抑制ANXA7的表达,差异有统计学意义（P<0.05）。（3）ANXA7表达受抑后,与阴性对照组和空白对照组比,si-ANXA7组细胞增殖显着抑制,差异有统计学意义（P<0.05）。（4）ANXA7表达受抑后,与阴性对照组和空白对照组比,si-ANXA7组细胞G1期阻滞显着,差异有统计学意义（P<0.05）。（5）ANXA7表达受抑后,与阴性对照组和空白对照组比,si-ANXA7组PCNA、cyclinD1、cyclinE、E2F1的表达明显下调差异有统计学意义（P<0.05）;p21的表达显着上调,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1 ANXA7在胃癌中显着高表达,且其在胃癌中的差异表达与肿瘤的分化程度、浸润深度及有无淋巴结转移密切相关;而p21在胃癌中显着低表达,且其在胃癌中的差异表达与肿瘤的浸润深度相关。2 ANXA7与p21在胃癌中的表达具有负相关关系。3 ANXA7可通过调控p21-cyclin/CDK-PCNA-E2F信号轴影响细胞周期,进而促进细胞增殖。
李焱洪[6]（2018）在《新型细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的发现及抗肿瘤药理学活性研究》文中研究指明研究背景:癌症在医学上是指起源于上皮组织的恶性肿瘤,它是由于生命体在各种致瘤因素（物理、化学等）的作用下,局部组织的正常细胞在基因水平上失去了对其生长发育的正常调控导致了异常的增生与分化,从而形成的肿块。并且这种肿块的生长将不再受机体的生理调节,它会破坏正常的组织和器官,这决定了其一旦形成便不因病因消除而停止生长。尽管人们尚未完全了解恶性肿瘤的病因,但随着多年的科研实验、流行病学研究及和临床观察,发现与环境因素有关的恶性肿瘤大约在80%以上。各种各样的致癌因素（环境、遗传等）可能会以协同或者序贯的方式使细胞的DNA发生非致死性的损伤,这将激活原癌基因或（和）失活肿瘤的抑制基因,加上调节凋亡的基因和（或）DNA修复基因的改变,细胞便发生转化。这些转化的细胞会先呈多克隆性增生,经过一个比较漫长的多阶段的演进过程,某个克隆开始相对无限制扩增,通过某种附加突变,将选择性地形成具有不同特点的亚克隆,进而获得浸润能力和迁移能力,形成恶性肿瘤。所以从本质上来说肿瘤是一种基因病。目前已发现的肿瘤致病基因有40多种,它们编码的蛋白产物包括蛋白激酶、生长因子和GTP-结合蛋白等。很多癌基因蛋的白和生长因子的受体都属于蛋白激酶,并且转化细胞跟正常细胞相比显示更高的蛋白磷酸化水平。另外,在蛋白激酶的控制之下,这种磷酸化蛋白质作为下游的效应分子,通过放大相关的信号通路,导致某些关键的基因转录异常和增殖失调,癌症由此产生。尽管医学在不断进步,癌症每年夺去数以百万计患者的生命,而且就算所谓的“灵丹妙药”也只能使患者的寿命平均延长几个星期。况且现有的药物一般情况下只能针对某一种肿瘤细胞,如果癌症的变化太大,那么看来有用的药物将不再起作用;而且即便某些药物暂时地消灭了癌症,但一些高度变异的癌细胞可能处在潜伏状态,疾病仍然会复发。目前,治疗效果不佳、毒副反应严重以及多种药物产生获得性耐受,是临床上治疗肿瘤的普遍难题,故研发特异性更强、边缘效应更小的抗肿瘤药物是现医药界面临的巨大挑战。细胞周期的失调被认为是人类癌症的重要标志,其调控机构中组成成分的改变与大部分肿瘤的发生密切相关。鉴于细胞周期的每个阶段都是为了后一期做准备,以获得两个相同遗传物质的子细胞,故细胞在进入下一时期前都要进行一种“检查”,我们称这些“检查”点为稽查点（checkpoint）或关卡。其作用是当细胞遇到外界压力或是DNA发生损伤时使细胞周期暂时停滞,这对维持基因组的稳定性是非常关键的,如果这些稽查点的功能失灵就可能导致肿瘤的形成。细胞周期有四个稽查点,分别是G1/S、S/G2、G2/M和M/G0,以G1/S和G2/M最为重要。但由于肿瘤细胞普遍有G1/S检查点缺陷的现象,并且当肿瘤细胞的DNA发生损伤后,都有选择性地滞留在G2/M期的趋势,因此该期的检查点成为研究肿瘤治疗药物的一个诱人靶标。当长时间地把肿瘤细胞阻滞于G2/M期时,一方面可以抑制肿瘤细胞的生长,另一方面又可以使肿瘤细胞累积DNA损伤而触发凋亡,从而治疗肿瘤。细胞凋亡是指由基因控制的细胞死亡,这种死亡是自主的有序的。在近几年的研究中发现,细胞凋亡的异常是癌症发生的重要原因,一些诱导细胞凋亡的基因（如Bax）的失活,以及抑制细胞凋亡基因（如Bcl-2）的过度表达,在恶性肿瘤发生过程中起着重要作用。而细胞凋亡通路的损伤是目前临床上肿瘤对治疗产生耐药性的主要原因,例如,80%的人肝癌细胞存在XIAP蛋白质过表达,来抑制caspases的激活和它的进一步活化;50%以上人肿瘤细胞中存在抗凋亡蛋白Bcl-2的表达增强等,这些机制直接或间接促进了肿瘤的发生及发展。正常的细胞周期调节机制瓦解导致细胞的异常增殖是所有癌细胞最本质的生物学特征,而细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）作为一类至关重要的细胞周期调控蛋白酶,它与细胞周期或转录调节密切相关,在肺癌、结肠癌、肺癌乳腺及恶性淋巴癌中,频繁检测出极度活跃的CDKs活性。若能开发出可以使癌症细胞周期发生紊乱以及诱导其凋亡的特异性CDKs抑制剂对于癌症的控制及治愈是非常有效的,故CDKs抑制剂特别是选择性高的CDKs抑制剂的研发一度成为了抗肿瘤药物研究中一个非常热门的领域。研究目的:以本课题组前期设计合成的ATP竞争性小分子CDKs抑制剂C-4为先导化合物,对其结构进行修饰改造,设计合成一系列二氨基嘧啶类化合物（系列Ⅰ）,研究该类化合物的体外抗肿瘤活性,并在此基础上初步阐明其作用机制,为选择性的CDKs抑制剂的发现及研究提供一定的参考。研究方法和结果:1.目标化合物的合成以课题组前期发现的具有较高抗肿瘤活性的化合物C-4为先导,对其进行结构改造和优化,以2,4-二氯嘧啶为原料,经两步亲核取代反应得到10个未见文献报道的最终产物。2.MTT法检测细胞活力不同浓度的系列Ⅰ化合物分别与人结肠癌细胞株HCT 116、人宫颈癌细胞株Hela、人肝癌细胞株Hep G2和人前列腺癌细胞株PC-3共同孵育48 h后停止培养,MTT法检测发现大部分系列Ⅰ化合物能显着抑制以上四种肿瘤细胞的生长。化合物I-7对这四种细胞的IC50分别是0.4365±2.56μM,1.846±0.42μM,2.28±0.99μM,46.02±0.60μM。3.流式细胞仪检测细胞周期的分布及凋亡情况用不同浓度的化合物Ⅰ-7处理HCT 116和Hela后,发现该化合物可以改变HCT 116和Hela的细胞周期分布,且明显将细胞生长阻滞在G2/M期;不仅如此,Ⅰ-7还能诱导两种肿瘤细胞产生凋亡,并呈剂量依赖效应。4.蛋白免疫印记法检测G2/M期及凋亡蛋白的表达情况我们在研究化合物Ⅰ-7对结肠癌细胞HCT 116、宫颈癌细胞Hela相关蛋白的影响时发现,随着化合物浓度的提高以及作用时间的延长,化合物Ⅰ-7减少了p-CDK1、CyclinB1、CDK2、p21 waf1/Cip1和抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达,但是基本不改变促凋亡蛋白Bax的表达,同时增加了 PARP剪切带和p53蛋白的表达。5.统计学分析数据分析和作图均采用GraphPad Prism 5.0（数据分析和作图软件）软件。研究结论:1.设计合成了 10个2,4-二氨基嘧啶化合物,这些化合物均采用1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS及元素分析进行了结构表征;2.化合物I-7显着性抑制人结肠癌细胞株HCT 116、人宫颈癌细胞株Hela、人前列腺癌细胞株PC-3和人肝癌细胞株Hep G2四种肿瘤细胞的活力,其IC50在0.4-46 μM;3.化合物Ⅰ-7抑制CDK1/CyclinB1复合物使HCT 116和Hela细胞阻滞G2/M期;4.化合物Ⅰ-7能下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,引起下游的PARP蛋白被活化,从而诱导细胞发生凋亡;5.化合物I-7诱导HCT 116和Hela发生细胞周期阻滞和凋亡的作用与调控细胞周期的关键因子p21 waf1/Cip1和p53蛋白有关。
黄声凯[7]（2016）在《AlUp对胃癌细胞增殖与细胞周期调控的影响及分子机制研究》文中进行了进一步梳理胃癌是常见的人消化道癌症,发病率在全部人类癌症中占据第四位,同时,胃癌的致死率达到70%,远远高于其他常见的人类癌症。胃癌的高发病率与高致死率严重影响了人类健康和生活。近几十年来,尽管新的诊疗技术不断出现,但由于胃癌早期诊断困难,且容易转移,故其手术根治效果较差,术前术后放化疗效果亦不理想。分子生物学研究的不断深入,为胃癌的基因治疗提供了广阔前景,近些年来,人们越来越多地把目光投向癌症的基因治疗。因此,寻找可用于胃癌治疗的靶基因对胃癌的治疗具有重要价值。AlUp （ataxin-1 interacting ubiquitin-like protein）即人共济失调蛋白-1泛素样互作蛋白,属于Ubiquilins家族的。Ubiquilins可以通过将蛋白连接到蛋白酶体,增强自噬介导的退化和参与内质网有关的蛋白降解。但A1Up在肿瘤与正常组织中的表达情况及在其肿瘤细胞中的功能相关研究还未见报道。在本研究中,我们对94对胃癌组织和癌旁组织进行免疫组化分析,结果发现A1Up在胃正常组织中表达高于胃癌组织（p<0.01）。随后通过体外实验也进一步发现A1Up可抑制胃癌细胞增殖、克隆形成能力,诱导细胞G0/G1期阻滞、细胞衰老,以及抑制MKN45在裸鼠体内的成瘤能力。我们对过表达及敲降A1Up的细胞进行基因表达谱分析,筛选到874个差异表达基因,其中上调基因450个,下调基因424个。为进一步验证这些基因的功能,我们进行了GO分析和KEGG分析。结果显示,A1Up很可能通过p53信号通路发挥生物学作用。Western blot实验进一步验证了A1Up可以调控p53、p21的表达,并且二者的表达量与A1Up的表达量呈正相关。用化疗药物Camptothecin诱导MKN45细胞中p53的表达,A1Up也呈表达增高趋势,并且A1Up表达升高和下降的趋势均早于p53、p21。而A1Up对p21的表达量的影响,除依赖p53的转录调控外,还有其它的调控方式。用蛋白合成抑制剂放线菌酮CHX处理细胞,与对照组相比,MKN45/pLVX-AlUp细胞中p21的降解速率明显减慢。由此我们得出结论,A1Up可以抑制p21的泛素化降解,从而上调p21的表达水平。随后我们对A1Up的相互作用蛋白进行了富集,通过质谱分析寻找到相互作用蛋白——RNF114, Co-IP也进一步验证了RNF114与A1Up有相互作用。在MKN45和BGC-823细胞中进行了A1Up的过表达和敲降,结果显示RNF114与A1Up的表达量成反比。而RNF114作为p21的一个E3连接酶,能过RING结构介导p21的降解,所以A1Up很有可能通过介导RNF114的泛素化降解来稳定细胞中p21的表达。与胃癌细胞株MKN45、BGC823不同的是,A1Up可以诱导永生化胃粘膜细胞株GES-1发生凋亡。流式细胞术实验结果显示,感染空载病毒及A1Up病毒的两组细胞早期凋亡比例分别为3.4±1.1%和13.1±1.8%,差异具有统计学意义（p<0.01）。Western blot也检测到了凋亡的执行分子Caspase 3、PARP的活化。更有趣的是,我们分别将GES-1、MKN45、BGC823细胞同步化于G1/S、S、G2/M及M期,发现A1Up在M期发生了磷酸化修饰,并且该修饰依赖于激酶CDK1的活性。经质谱鉴定磷酸化位点,结果显示A1Up在G1期的磷酸化位点有19个,在M期有32个,其中仅在M期发生磷酸化的位点有22个。综上所述,我们对A1Up在胃癌中的表达情况进行了研究,首次发现了A1Up通过调控p53信号通路及其下游基因,在胃癌的发生发展中发挥着重要的抑癌作用。本文的研究结果具有创新意义,揭示了A1Up基因在胃癌细胞内涉及的功能和的分子机制,不仅对今后理解并研究A1Up基因的功能和作用机制具有指导意义,还为胃癌的基因治疗提供了新的靶点。
吴坤[8]（2016）在《p21功能缺失在衰老背景下对小鼠MEF及胃部组织影响的研究》文中认为胃癌在世界范围内是最常见的恶性肿瘤之一,其发病死亡率高,早期诊断率低。根据世界卫生组织（WHO）公布的全球统计报告,世界胃癌年发病率为13.86%/10万人,仅次于肺癌发病率而位居第二。我国是胃癌的高发区,每年新发现40万胃癌患者,占世界胃癌发病人数的42%。恶性肿瘤是严重威胁人类生命与健康的一大类疾病,据WHO报道,癌症将取代心血管疾病成为世界死亡人数最多的疾病。亚洲及南美洲国家的胃癌发病率远高于美国及其他西欧国家。引起胃癌发病的机理仍不是非常清楚,对于胃癌的基础研究目前越来越受到各国研究人员的重视。由于胃癌的高发年龄主要集中在中老年人群中,因此构建一个衰老动物模型来研究胃粘膜细胞的生理及病理变化将为基础研究提供一个独特的思路,对模拟衰老与胃部病变乃至胃癌的发生都将有所助益。早老综合症（Werner Syndrome,WS）是一种罕见的常染色体隐性遗传病,大约一百万人中会有一人罹患此病,该病也被视为是研究衰老的理想模型。为了在小鼠模型中模拟人类的早老综合症,我们通过双敲除Wm基因和端粒酶RNA组分来实现。在临床研究中发现,胃癌细胞中周期阻滞因子p21（Cdknla）表达异常。已有研究表明由端粒功能异常引起的DNA损伤信号中p21起到了很重要的作用。然而,p21与衰老相关的凋亡以及与胃部组织细胞的增殖活性之间的关系仍不明确。在本研究中,我们将较晚代端粒RNA组分敲除的小鼠（G2或G3mTerc-/-）和Wm基因敲除以及p2l基因敲除的小鼠进行杂交,得到G2或G3mTerc-/-Wrn-/-p21-/-小鼠。最终我们得到子代为G3mTerc-/-Wrn-/-和G3mTerc-/-wrn-/-p21-/-小鼠成纤维细胞（MEFs）以及G4mTerc-/-Wrn-/-和G4mTerc-/-Wrn-/-p21-/-小鼠并通过western blot技术分析检测MEFs凋亡相关蛋白的表达情况。G4 mTerc-/-Wrn-/-p21-/-小鼠出现明显的体格和活动力下降。运用流式细胞仪检测分析线粒体膜电位以及细胞凋亡情况,使用荧光免疫分析技术分析DNA损伤情况。结果显示,p21的功能缺失增强G3 mTerc-/-Wrn-/-MEFs凋亡增强以及DNA损伤增加。此外,通过SA-β-Gal染色法探究G4 mTerc-/-Wrn-/-p21-/-小鼠胃部组织的衰老情况。我们发现p21的功能缺失不仅没有缓解胃部组织细胞的衰老情况,而且能够加速小鼠胃部组织的衰老进程。另外,我们用BrdU掺入法评估G4mTerc-/-Wrn-/-p21-/-小鼠胃部组织细胞的增殖率。有意思的是,结果显示G4mTerc-/-Wrn-/-p21-/-小鼠胃部组织细胞的增殖效率显着提高。
蔡少鑫[9]（2013）在《DACH1对非小细胞肺癌细胞生长的影响及其机制研究》文中进行了进一步梳理目的：检测非小细胞肺癌组织中DACH1的表达情况及其临床意义,并探索其表达变化的可能机制。方法：1.从oncomine数据库中获得DACH1在肺癌组织中的mRNA表达情况；从Biomax（美国）公司购得人肺癌组织芯片,用DACH1多克隆抗体进行免疫组化实验；并与正常组织DACH1的表达情况进行比较。2.通过荟萃分析研究DACH1在非小细胞肺癌中表达的高低与p53以及Sox2的相关性。3.用DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷以及组蛋白去乙酰化抑制剂TSA处理非小细胞肺癌细胞系H1299,观察DACH1的表达情况。结果：在人非小细胞肺癌中,内源性DACH1蛋白水平和转录水平（mRNA）都较正常组织中显着降低并与临床分期负相关；DACH1的低表达与p53正相关,与Sox2负相关；用DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷处理非癌细胞系H1299后,细胞的DACH1蛋白表达升高。结论：DACH1在非小细胞肺癌中低表达并与临床分期负相关,DACH1的低表达与p53的低表达相关,与Sox2的高表达正相关,DACH1低表达的机制可能与DNA甲基化相关。目前,肺癌是肿瘤中导致死亡的主要病因之一。在非小细胞肺癌（NSCLC）中,抑癌基因p53发生突变是常见的病因。我们之前已经发现在人非小细胞肺癌中,内源性DACH1蛋白水平和转录水平（mRNA）都较正常组织中显着降低。我们成功克隆出Dachshund基因（在果蝇中为Dac,本文指的是在人类的DACH1）。在非小细胞肺癌细胞系中高表达DACH1能够减少克隆形成,上调p53依赖信号通路相关蛋白。内源性DACH1与p53可共定位于核内,也可共定位于核外。DACH1与p53的结合位点位于DACH1的C端。在肺癌细胞系中,DACH1对克隆形成实验的抑制和细胞周期的阻滞作用依赖于p53的存在。因此我们得出结论,内源性的DACH1通过结合p53抑制非小细胞肺癌细胞的生长。
徐益苗[10]（2013）在《热休克蛋白27及其磷酸化对p53的调控及介导MCF-7细胞多柔比星耐受的研究》文中认为p53作为一个重要的抑癌基因,一方面调控着促进细胞凋亡的过程,另一方面通过调控细胞周期从而调节应激条件下细胞修复机制。在很多肿瘤细胞中都伴随着热休克蛋白27（Hsp27）的高表达,它是热休克蛋白家族中可以被磷酸化修饰的小热休克蛋白的典型代表。Hsp27调节p53蛋白水平和其激活已有报道,但对于涉及Hsp27磷酸化修饰在此过程中作用的研究并不系统和完整。本课题就Hsp27及其磷酸化形式对于p53蛋白的调控,下游信号的激活和相关信号通路等都做了较为深入和系统的研究。首先,本研究发现Hsp27参与了调节p53蛋白稳定性和激活的过程。在人胚肾细胞株HEK293A细胞中的研究发现,Hsp27能下调外源性p53引起的p21转录激活,并且抑制了由此引起的细胞周期阻滞。在细胞内通过瞬时转染过表达外源性Hsp27发现Hsp27可以显着增强p53的泛素化,但是却对p53下游的MDM2的表达呈现剂量效应的抑制作用。通过对于p53下游p21,MDM2的抑制和对p53本身泛素化的促进,表明Hsp27对p53具有负向调控的功能,从而缓解由于p53引起的细胞周期阻滞。Hsp27是一种可以被磷酸化修饰的小热休克蛋白,其磷酸化和非磷酸化形式均在细胞的增殖、凋亡、分化、炎症等多种生理病理过程中发挥了不同的生物学功能。在本文中,我们发现并报道了磷酸化的Hsp27发挥着与非磷酸化的Hsp27不同的作用：1)过表达磷酸化Hsp27突变体（Hsp27-3D）促进了p53的激活,但是长时间作用后促进了p53的下调；2)过表达Hsp27-3D促进了p53的核聚集,而过表达非磷酸化Hsp27突变体（Hsp27-3A）并没有表现出这种p53趋核聚集的现象,相反的出现了出核增加的趋势；3)磷酸化的Hsp27促进了ATM的激活,从而增强了p53/p21信号级联反应。这些结果都表明Hsp27磷酸化后对于p53的激活发挥了重要的作用。多柔比星（Dox）是一种常用的DNA毒抗癌药物,容易在细胞核内聚集并导致细胞凋亡。在最后一部分中,我们发现亚致死剂量的Dox可以引起具有野生型p53的乳腺癌细胞MCF-7中Hsp27, ATM和p53的磷酸化,磷酸化后的Hsp27增加了与ATM, p53形成三元复合物的水平,从而引起p21的积累。而当使用多种手段抑制Hsp27磷酸化后,ATM和p53磷酸化也同时被抑制,进而阻断了p21蛋白水平的上调和其介导的细胞保护作用,引起细胞凋亡的增加。这些结果表明磷酸化的Hsp27通过增加与ATM的结合从而激活p53,通过p53/p21通路对细胞进行保护性调节。综上所述,本研究首次揭示了Hsp27磷酸化形式对于p53激活和蛋白水平的调控作用；提出了Hsp27在胞内发挥保护作用的新的作用机制。这些结果对深入研究Hsp27在细胞周期,肿瘤耐受等多种生理病理条件下的调节作用具有重要的指导意义。
二、THE EXPRESSION OF P53 PROTEIN AND P21~(WAFl/cipl/sdil) IN GASTRIC CARCINOMA（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、THE EXPRESSION OF P53 PROTEIN AND P21~(WAFl/cipl/sdil) IN GASTRIC CARCINOMA（论文提纲范文）
（1）胃癌中SPIN1的异常表达及作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
| 外文论文 |
| 外文论文一 |
| 外文论文二 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（2）RRP12在胃癌发生中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 附录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）MCM7在胃癌组织中的表达及对胃癌细胞增殖、侵袭和转移的影响及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一章 MCM7在早期胃癌中的表达及其诊断意义 |
| 前言 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 第二章 MCM7对胃癌细胞增殖、侵袭及迁移的作用 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 MCM7对胃癌细胞EMT的影响及可能的机制 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 论文的不足与展望 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
（4）miR-34a-5p/UHRF2及相关信号通路在红芪多糖治疗胶质瘤中作用机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 人胶质瘤组织UHRF2及相关miRNAs的表达特征研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 附图表 |
| 第二部分 红芪多糖对人胶质瘤细胞的效应及对UHRF2的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 附图表 |
| 第三部分 红芪多糖经miRNA-34a-5p/UHRF2轴抑制人胶质瘤细胞的机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 附图表 |
| 第四部分 红芪多糖对胶质瘤裸鼠肿瘤生物学特性的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 附图表 |
| 第五部分 红芪多糖对胶质瘤裸鼠免疫调控的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 UHRF2生物功能及参与疾病发生发展的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学位论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文一 |
| 英文论文二 |
（5）膜联蛋白A7通过p21-cyclin/CDK-PCNA-E2F信号轴调控胃癌细胞增殖的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）新型细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的发现及抗肿瘤药理学活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 二氨基嘧啶类细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的设计与合成 |
| 第一节 2,4-二氨基嘧啶类化合物的设计 |
| 第二节 2,4-二氨基嘧啶类化合物的合成 |
| 第三节 讨论 |
| 第二章 二氨基嘧啶类细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的体外活性实验 |
| 第一节 实验材料及仪器 |
| 第二节 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 代表化合物Ⅰ-7对肿瘤细胞周期、凋亡及相关蛋白的影响 |
| 第一节 实验材料及仪器 |
| 第二节 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 全文讨论 |
| 参考文献 |
| 附录缩写词表 |
| 论文发表情况 |
| 致谢 |
（7）AlUp对胃癌细胞增殖与细胞周期调控的影响及分子机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 实验结果 |
| 一、A1Up在多种消化道组织及肿瘤组织表达检测 |
| 二、A1Up在胃癌组织中的表达低于癌旁正常组织 |
| 三、A1Up在多种胃癌细胞系中的表达情况检测 |
| 四、A1Up过表达及敲降质粒的构建 |
| 五、A1Up对胃癌细胞株MKN45、BGC-823的影响及机制探讨 |
| 5.1 过表达A1Up对胃癌细胞株MKN45、BGC823细胞表型的影响 |
| 5.2 A1Up发挥抑癌作用相关通路研究 |
| 5.3 A1Up通过p53及其相关通路发挥抑癌作用 |
| 5.4 A1Up相互作用蛋白的筛选与鉴定 |
| 六、A1Up对胃粘膜永生化细胞株GES-1的影响及机制探讨 |
| 6.1 A1Up对GES-1细胞形态学的影响 |
| 6.2 流式细胞术检测A1Up对GES-1细胞株凋亡率的影响 |
| 6.3 A1Up对Caspase凋亡通路相关蛋白的影响 |
| 七、A1Up在细胞周期M期磷酸化修饰的研究 |
| 7.1 A1Up在细胞周期M期发生磷酸化修饰 |
| 7.2 细胞周期M期A1Up磷酸化依赖于激酶CDK1 |
| 7.3 质谱鉴定A1Up磷酸化修饰的位点 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 UBL-UBA蛋白家族研究进展 |
| 参考文献 |
| 基金支持 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（8）p21功能缺失在衰老背景下对小鼠MEF及胃部组织影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 p21的研究现状 |
| 1.1.1 国内外p21的研究基本概况 |
| 1.1.2 p21的结构与功能 |
| 1.1.2.1 P21是细胞周期的一个负调控因子 |
| 1.1.2.2 p21调节基因的转录 |
| 1.1.2.3 p21是细胞凋亡的调节子 |
| 1.1.2.4 p21与DNA修复 |
| 1.2 p21的转录调节与癌症 |
| 1.2.1 CDKN1A基因转录激活的致癌 |
| 1.2.2 CDKN1A转录的p53非依赖调节 |
| 1.3 衰老与癌症 |
| 1.3.1 衰老的九大特征 |
| 1.3.2 衰老与癌症的辩证关系 |
| 1.4 WS综合症-研究衰老过程的理想模型 |
| 1.4.1 人类WS概述 |
| 1.4.2 小鼠衰老模型(WS)的构建 |
| 1.5 本研究的主要内容及意义 |
| 第二章 实验材料 |
| 2.1 MEF细胞与小鼠 |
| 2.2 实验主要仪器设备 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 试剂配制 |
| 第三章 实验方法 |
| 3.1 小鼠MEF细胞的制作 |
| 3.2 细胞培养 |
| 3.2.1 细胞的复苏 |
| 3.2.2 细胞传代 |
| 3.2.3 细胞冻存 |
| 3.3 细胞收集 |
| 3.4 免疫荧光检测DNA损伤情况 |
| 3.4.1 免疫荧光检测DNA损伤的基本原理 |
| 3.4.2 免疫荧光检测DNA损伤的一般步骤 |
| 3.5 冰冻切片组织衰老相关β-半乳糖苷酶检测(Senescence-associatedbeta-galactosidase,SA—βgal) |
| 3.6 Western Blot蛋白免疫印迹 |
| 3.6.1 总蛋白提取 |
| 3.6.2 蛋白定量 |
| 3.6.3 SDS-PAGE电泳体系配制 |
| 3.6.4 SDS-PAGE电泳 |
| 3.6.5 Western Blot——转膜 |
| 3.6.6 封闭 |
| 3.6.7 一抗孵育 |
| 3.6.8 二抗孵育 |
| 3.6.9 显影 |
| 3.6.10 抗体的剥离 |
| 3.7 实时荧光PCR |
| 3.7.1 总RNA的提取 |
| 3.7.2 RNA反转录成单链DNA(cDNA) |
| 3.7.3 RT-PCR(实时定量荧光PCR) |
| 3.7.3.1 引物 |
| 3.7.3.2 实时荧光PCR体系 |
| 3.7.4 RT-PCR数据分析 |
| 3.8 检测细胞ROS实验 |
| 3.8.1 ROS实验的原理 |
| 3.8.2 ROS检测实验步骤 |
| 3.9 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 |
| 3.9.1 实验原理 |
| 3.9.2 实验步骤 |
| 3.9.2.1 样品染色 |
| 3.9.2.2 样品分析 |
| 3.10 JC-10法检测线粒体膜电位 |
| 3.10.1 实验原理 |
| 3.10.2 实验步骤 |
| 3.11 BrdU掺入实验 |
| 3.12 透射电子显微镜材料准备以及统计方法 |
| 第四章 结果与讨论 |
| 4.1 p21功能缺失对WS小鼠寿命的影响 |
| 4.1.1 实验结果 |
| 4.1.2 讨论 |
| 4.2 G4mTerc~(-/-)Wrn~(-/-)p21~(-/-)小鼠的胃部组织明显衰老迹象以及胃组织细胞增殖能力增强 |
| 4.2.1 实验结果 |
| 4.2.2 讨论 |
| 4.3 p21功能缺失导致WS小鼠胃窦组织细胞线粒体异常 |
| 4.3.1 实验结果 |
| 4.3.2 结果判定 |
| 4.3.3 讨论 |
| 4.4 p21缺失导致WS小鼠MEF细胞凋亡增强并引起细胞线粒体膜电位异常 |
| 4.4.1 实验结果 |
| 4.4.2 讨论 |
| 4.5 p21功能缺失使G3 mTere~(-/-)Wrn~(-/-)MEF细胞DNA损伤加重 |
| 4.5.1 实验结果 |
| 4.5.2 结果讨论 |
| 4.6 G3 mTerc~(-/-)Wrn~(-/-)p21~(-/-)MEF细胞增殖能力增强,活性氧族(ROS)有所下降 |
| 4.6.1 实验结果 |
| 4.6.2 结果讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 本人在硕士阶段发表的文章 |
（9）DACH1对非小细胞肺癌细胞生长的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 DACHl在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 实验材料和仪器 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 DACH1通过P53依赖途径抑制非小细胞肺癌细胞生长 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表的文章 |
| 致谢 |
（10）热休克蛋白27及其磷酸化对p53的调控及介导MCF-7细胞多柔比星耐受的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 p53与Hsp27的研究进展 |
| 第一节 抑癌基因p53的研究进展 |
| 第二节 小热休克蛋白27的研究进展 |
| 本章小结 |
| 第二章 Hsp27抑制p53活化并促进其MDM2依赖的泛素化过程 |
| 第一节 Hsp27抑制了p53下游基因的转录和p53介导的细胞周期阻滞 |
| 第二节 Hsp27通过与p53和MDM2的相互作用调节p53的泛素化过程 |
| 第三节 MDM2是Hsp27促进p53降解过程的主要限速因子 |
| 本章讨论与分析 |
| 第三章 Hsp27的磷酸化在p53激活过程中的调控作用 |
| 第一节 持续磷酸化的Hsp27突变体Hsp27-3D促进了p53的向核聚集和活化 |
| 第二节 Hsp27-3D促进了MDM2的积累和p53的反馈性下调 |
| 第三节 Hsp27-3D促进了p53以ATM依赖的方式活化 |
| 第四节 Hsp27的磷酸化介导了MCF-7对多柔比星的耐受性 |
| 本章讨论与分析 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 附录 |
| 附录A 实验所用主要溶液 |
| 附录B 实验技术流程 |
| 附录C 免疫印迹实验所用抗体 |
| 附录D 主要仪器设备 |
| 在读期间发表的学术论文和主要科研成果 |
| 致谢 |
四、THE EXPRESSION OF P53 PROTEIN AND P21~(WAFl/cipl/sdil) IN GASTRIC CARCINOMA（论文参考文献）
- [1]胃癌中SPIN1的异常表达及作用机制研究[D]. 吕蓓蓓. 山东大学, 2020(04)
- [2]RRP12在胃癌发生中的作用及机制研究[D]. 李雪. 山东大学, 2020(02)
- [3]MCM7在胃癌组织中的表达及对胃癌细胞增殖、侵袭和转移的影响及机制[D]. 杨京彦. 山东大学, 2019(03)
- [4]miR-34a-5p/UHRF2及相关信号通路在红芪多糖治疗胶质瘤中作用机制的研究[D]. 都小龙. 山东大学, 2019(02)
- [5]膜联蛋白A7通过p21-cyclin/CDK-PCNA-E2F信号轴调控胃癌细胞增殖的研究[D]. 赵依纳. 承德医学院, 2019(06)
- [6]新型细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的发现及抗肿瘤药理学活性研究[D]. 李焱洪. 南方医科大学, 2018
- [7]AlUp对胃癌细胞增殖与细胞周期调控的影响及分子机制研究[D]. 黄声凯. 北京协和医学院, 2016(01)
- [8]p21功能缺失在衰老背景下对小鼠MEF及胃部组织影响的研究[D]. 吴坤. 昆明理工大学, 2016(02)
- [9]DACH1对非小细胞肺癌细胞生长的影响及其机制研究[D]. 蔡少鑫. 华中科技大学, 2013(02)
- [10]热休克蛋白27及其磷酸化对p53的调控及介导MCF-7细胞多柔比星耐受的研究[D]. 徐益苗. 南京师范大学, 2013(12)