一、Dynamic Expression of bFGF and TGFβ2 in Glomus Cell Grafts of Carotid Body in Rat Model of Parkinson Disease（论文文献综述）
Cornelia Larissa Granz,Ali Gorji[1]（2020）在《Dental stem cells: The role of biomaterials and scaffolds in developing novel therapeutic strategies》文中进行了进一步梳理Dental stem cells（DSCs） are self-renewable cells that can be obtained easily from dental tissues, and are a desirable source of autologous stem cells. The use of DSCs for stem cell transplantation therapeutic approaches is attractive due to their simple isolation, high plasticity, immunomodulatory properties, and multipotential abilities. Using appropriate scaffolds loaded with favorable biomolecules, such as growth factors, and cytokines, can improve the proliferation, differentiation, migration, and functional capacity of DSCs and can optimize the cellular morphology to build tissue constructs for specific purposes. An enormous variety of scaffolds have been used for tissue engineering with DSCs. Of these, the scaffolds that particularly mimic tissue-specific micromilieu and loaded with biomolecules favorably regulate angiogenesis, cell-matrix interactions, degradation of extracellular matrix, organized matrix formation, and the mineralization abilities of DSCs in both in vitro and in vivo conditions. DSCs represent a promising cell source for tissue engineering, especially for tooth, bone, and neural tissue restoration. The purpose of the present review is to summarize the current developments in the major scaffolding approaches as crucial guidelines for tissue engineering using DSCs and compare their effects in tissue and organ regeneration.
冯蕾[2]（2008）在《GDNF基因修饰的嗅鞘细胞对帕金森病的治疗作用及其机理》文中认为帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种好发于中老年人并严重影响其生活质量的神经退行性疾病,该病的主要病理变化是黑质多巴胺能神经元的进行性退变和缺失,致使纹状体内多巴胺水平异常降低。迄今为止,PD的病因和发病机制还未完全明确。研究表明,PD与遗传、环境、细胞凋亡、线粒体功能异常等有关。随着老龄社会的来临,我国的PD发病率也在逐年升高,严重威胁着老年人的生活质量和生命安全。目前对该病的预防和治疗虽然有许多方案,但效果都不够理想。近年来,脑内移植技术与转基因技术相结合治疗PD,成为一新的研究热点。嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells,OECs）是目前所发现的极少数中枢神经系统可以再生的细胞之一。OECs兼有雪旺氏细胞与星形胶质细胞的双重功能特点,它能伴随轴突从外周神经系统进入中枢神经系统,能在损伤段为再生神经纤维形成髓鞘,保护其不受局部抑制因子的影响;尚可分泌多种神经营养因子（如NGF、BDNF、NT-4、NT-5等）。OECs是当今国际上普遍认为用作细胞移植治疗中枢神经系统损伤与再生修复很有临床应用前景的候选细胞。但是神经损伤或病变后影响神经再生修复的因素极其复杂,OECs本身表达神经营养因子的水平较低,单纯依靠OECs移植难以满足治疗的需要。胶质源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF）是目前发现的在体外支持运动神经元生长最有效的神经营养因子。不仅能在体外有效地促进多巴胺能神经元存活和分化,而且在体内,对黑质纹状体多巴胺能系统也有保护和修复作用,是目前防治神经元退化性疾病的最有前途的一种神经营养因子。但由于不能通过血脑屏障,为临床应用带来极大困难。本课题用6—羟基多巴（6-OHDA）损伤制作的PD体内和体外模型,观察了GDNF基因修饰的OECs移植对PD大鼠模型的疗效,并利用免疫荧光、RT-PCR、流式细胞分析和Western blot等方法对其机理进行了初步研究。旨在为GDNF基因修饰的OECs移植治疗PD提供实验依据,为PD治疗提供新思路。本实验分为4部分,摘要如下:第一部分嗅鞘细胞的培养、纯化和鉴定和生物学特征目的:探讨新生大鼠嗅球OECs的分离培养和纯化方法,并观察其形态学变化;观察不同浓度OECs培养上清（conditional medium,CM）对6-OHDA引起的PC12细胞凋亡的抑制作用,探讨其机制。方法:采用原代培养技术,从新生大鼠的嗅球分离培养OECs,用差速贴壁和阿糖胞苷抑制相结合方法纯化培养OECs,并用牛垂体提取液（BovinePituitary Extract,BPE）扩增OECs,倒置相差显微镜下观察OECs形态变化特点及生长情况,采用NGFRp75抗体行免疫细胞化学染色鉴定,根据NGFRp75免疫细胞化学染色统计培养的OECs的纯度。收集OECs培养上清,将不同浓度（25%、50%和75%）的OECs培养上清与100μM 6-OHDA共孵育PC12细胞,用MTT法测各组细胞活力;倒置显微镜观察细胞形态变化:Hoechst33342/PI双染观察细胞凋亡的形态学改变;流式细胞技术检测线粒体膜电位的改变;RT-PCR检测各组细胞bcl-2/bax mRNA表达差异。结果:成功培养出高纯度的OECs,体外培养的新生大鼠OB-OECs主要为双极或三极细胞,其突起细长。未经纯化则成纤维细胞生长迅速而占据优势。CM（25%、50%和75%）处理组较6-OHDA组相比,细胞活性增强,Hoechst33342/PI双染显示凋亡细胞的比例减少,可稳定线粒体膜电位,bcl-2/bax mRNA比值升高,两者有统计学差异,p＜0.05。结论:差速贴壁和Ara-C相结合的纯化方法是一种高效率、方便、经济的纯化培养OECs的方法。OECs培养上清对6-OHDA诱导PC12细胞有保护作用,其机理可能是OECs分泌的营养因子,抑制bcl-2/bax mRNA比值降低,稳定线粒体膜电位而发挥细胞保护作用。第二部分GDNF基因修饰的嗅鞘细胞的构建和生物学鉴定目的:构建pIRES2-EGFP-GDNF载体,建立OEC s-GDNF基因工程细胞。方法:用TRIZOL Reagent法从新生大鼠脑组织提取总RNA,用RT-PCR反转录出GDNFcDNA片段,回收纯化,将其与经SacⅠ和SmaⅠ双酶切的pIRES2-EGFP连接,应用分子克隆技术构建载体pIRES2-EGFP-GDNF。将此重组载体用脂质体LipofectamineTM2000转入OECs细胞,用G418筛选阳性克隆,构建出OECs-GDNF工程细胞。用RT-PCR、ELISA检测OECs-GDNF工程细胞GDNF的表达变化。结果:经测序检验,成功构建出pIRES2-EGFP-GDNF,GDNF基因无突变;筛选出OECs-GDNF工程细胞,RT-PCR检测显示OECs-GDNF工程细胞GDNFmRNA表达明显增高,ELISA检测OECs-GDNF工程细胞培养上清中GDNF明显增高,分泌量为15.2ng/106细胞/24hr。结论:成功构建了pIRES2-EGFP-GDNF表达载体,经测序分析GDNF无突变。LipofectamineTM2000转染OECs方法简单,转染效率较高,经RT-PCR、ELISA分析OECs-GDNF工程细胞可高表达GDNF。第三部分GDNF基因修饰嗅鞘细胞移植对帕金森病大鼠模型的治疗作用目的:研究GDNF基因修饰的OECs对PD大鼠模型的治疗作用。方法:大鼠脑立体定位仪下,用6-OHDA两点注射右侧内侧前脑束制作单侧PD大鼠模型,注射等剂量的生理盐水的作为假手术组。将实验分为4组,每组6只:A假手术组;BPD模型组（纹状体注入等量生理盐水）;C OECs-GDNF组（纹状体内注入OECs-GDNF工程细胞）;D OECs组（纹状体内注入OECs）。术后2w、4w、6w和8w,分别观察阿朴吗啡诱导的行为学改变:术后8w用TH免疫荧光染色检测各组大鼠黑质部位TH阳性神经元数量及纹状体TH阳性纤维密度的改变,分析对PD大鼠模型的治疗作用。结果:OECs-GDNF工程细胞植入纹状体后,PD大鼠的旋转行为有所改善,细胞移植后4w、6w和8w,旋转圈数较PD模型组明显减少。荧光显微镜下显示移植细胞成活,标记细胞向周围分散,提示细胞移植后可向周围迁移。TH免疫荧光染色结果显示:PD模型毁损侧黑质部位TH阳性细胞明显减少,纹状体部位TH阳性纤维终末密度值明显降低;与模型组相比,OECs-GDNF组大鼠毁损侧黑质多巴胺神经元数量明显增多,纹状体部位TH阳性纤维的相对密度值明显增强,两者有统计学差异,p＜0.05;OECs组和PD模型组比较,无统计学差异,p＞0.05。结论:OECs-GDNF工程细胞对帕金森病模型大鼠有一定的治疗作用:能改善PD模型大鼠的旋转行为,对黑质、纹状体部位多巴胺神经元有一定的保护作用。第四部分GDNF基因修饰嗅鞘细胞移植对帕金森病大鼠模型的Bcl-2/Bax表达影响目的:研究GDNF基因修饰OECs移植对PD大鼠模型Bcl-2/Bax蛋白表达变化的影响。方法:实验分组同第三部分。细胞移植后8w,低温快速取出大鼠中脑腹侧组织,用Western blot方法检测各组大鼠中脑腹侧组织中Bcl-2/Bax蛋白表达的变化。结果:与假手术组比较,6-OHDA引起了PD模型组大鼠中脑腹侧组织Bcl-2蛋白表达降低,Bax蛋白升高,p＜0.01。与PD模型组比较,OECs-GDNF组中脑腹侧组织Bcl-2蛋白表达增高,Bax蛋白表达降低,Bcl-2/Bax蛋白比值升高,两者有统计学差异,p＜0.05。与PD模型组比较,单纯OECs组Bcl-2蛋白表达增高,Bax蛋白表达无变化,但无统计学意义,p＞0.05。结论:6-OHDA引起了PD模型大鼠中脑腹侧组织Bcl-2表达降低,Bax蛋白升高;OECs-GDNF工程细胞对PD大鼠的治疗作用可能与其抑制Bcl-2蛋白表达的降低、Bax蛋白表达升高,升高Bcl-2/Bax比值有关。结论和意义:本课题研究发现,OECs培养上清对6-OHDA诱导的PC12细胞有较强的保护作用,其作用机理可能是OECs分泌的细胞因子提高了细胞bcl-2 mRNA的表达,降低bax mRNA的表达,稳定线粒体膜电位,抑制了细胞凋亡;OECs-GDNF工程细胞移植对PD大鼠模型有治疗作用,可改善其旋转行为,其作用机理可能与抑制中脑腹侧组织内Bcl-2蛋白表达的升高、Bax蛋白表达降低,升高Bcl-2/Bax比值有关。本课题利用细胞培养、分子克隆、免疫荧光、RT-PCR和Western blot等实验技术,研究了OECs细胞对PC12的保护作用和OECs-GDNF工程细胞对PD大鼠模型的治疗作用,及其机制,在细胞和分子水平上为OECs-GDNF工程细胞治疗PD提供了实验依据。
宋锐锋[3]（2002）在《中药抗呆Ⅰ号对脑缺血再灌注星形胶质细胞因子的影响》文中研究说明星形胶质细胞为中枢神经系统主要的胶质细胞，正常情况下它们通过调节离子及其它代谢物浓度、神经递质的转运等保持内环境稳定，脑缺血后星形胶质细胞异常活跃，它通过分泌生长因子、细胞因子、识别因子等修复损伤的神经元，起到恢复神经系统正常功能的作用，但其具体机制仍不清楚，本研究以此为切入点从以下两方面进行研究：第一，用我室已建立的小鼠前脑缺血再灌注模型探讨脑缺血后海马星形胶质细胞GFAP、BDNF和BDNFmRNA、bFGF、bcl-2和bax表达的动态变化及抗呆Ⅰ号的影响；第二，用我室已建立的体外模拟脑缺血再灌注模型观察了体外除氧去糖情况下星形胶质细胞表达BDNF、bFGF的动态变化及抗呆Ⅰ号的影响，以期探讨在缺血性脑损伤中星形胶质细胞产生部分营养因子和与凋亡有关的因子的变化规律，进一步阐明缺血性脑损伤的机制，且为抗呆Ⅰ号的临床应用提供更完善的实验依据。1．抗呆Ⅰ号对小鼠前脑缺血再灌注损伤海马星形胶质细胞表达部分营养因子和与凋亡有关的因子作用的实验研究本研究应用昆明小鼠前脑缺血再灌注模型，免疫组化染色观察海马星形胶质细胞损伤后的动态变化，以及抗呆Ⅰ号的干预作用。1．1模型的制备：模型组以水合氯醛（350mg/kg）腹腔麻醉，颈正中切口，用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉加鼠尾尖放血造成低血压，缺血15min后再灌15min，再次缺血15min，整个缺血过程中小鼠置于恒温箱内，保持肛温于36℃左右。假手术组除不阻断血流、不放血外余同前。正常对照组不做任何处理。分别在缺血再灌注损伤后1d、3d、7d、10d和15d取材染色处理。免疫组化染色：采用ABC法。1．2 抗呆Ⅰ号对脑缺血后小鼠海马星形胶质细胞GFAP、BDNF和bFGF蛋白表达动态变化影响的实验研究前脑缺血再灌注1d只有少数星形胶质细胞表达GFAP，再灌注3d表达GFAP的阳性细胞数增加，再灌注7-10d表达GFAP的阳性细胞数达到高峰，同时，可见细胞反应性胶质化特征，前脑缺血再灌注15d GFAP阳性反应细胞数仍维持在较高水平。用药组GFAP的表达细胞数较模型组明显减少。而正常对照组和假手术组只有少数星形胶质细胞表达GFAP。且星形胶质细胞表达GFAP的强弱与神经细胞的存亡有关。<WP=6>1．3 抗呆Ⅰ号对脑缺血后小鼠海马星形胶质细胞bcl-2和bax蛋白表达的动态变化影响的实验研究前脑缺血再灌注3～7d bcl-2表达呈强阳性。再灌注7～10d bax表达呈强阳性。用药组bcl-2和bax的表达较模型组均减弱。而正常对照组和假手术组无bcl-2和bax的表达。且星形胶质细胞表达bcl-2和bax的强弱与神经细胞的存亡有关。在体模拟脑缺血再灌注损伤实验提示：损伤后星形胶质细胞反应性增生肥大，突起增粗，特异性蛋白GFAP表达增强，处于活化状态， 模型组BDNF和bFGF表达明显，一方面，通过把产生的营养因子分泌到组织间隙促进神经元恢复；另一方面，通过自身修复、调节内环境的稳定、清除代谢产物等环节，保护损伤的神经元。另外，通过表达与凋亡相关基因bcl-2与bax来调节自身和神经细胞的凋亡。用药后星形胶质细胞反应性增生减弱，各种因子表达减少，充分说明其对缺血再灌注损伤的保护作用。2．抗呆Ⅰ号对体外模拟脑缺血后星形胶质细胞BDNF、bFGF蛋白动态变化影响的实验研究模型的制备：将正常培养的传代星形胶质细胞按实验要求分为正常对照组、模型组、用药组（天麻素25mg/L）。正常对照组的培养孔中加入有糖Earle,s液，模型组加入无糖Earle,s液，用药组加入无糖Earle,s液+抗呆Ⅰ号。模型组和用药组培养板置缺氧罐中，通入93%N2+7%CO2的混合气，持续30min，将缺氧罐封闭置37℃培养箱中5h，取出培养板。正常组和模型组换完全培养液，用药组换完全培养液+抗呆Ⅰ号，根据实验要求继续培养2h、6h、18h、28h、48h和72h取出进行免疫组化染色。免疫组化染色：采用ABC法，结果采用图像分析技术处理。体外模拟脑缺血再灌注不同时间点BDNF和bFGF免疫组化染色显示，正常细胞胞体较大，各时间点光密度值和面密度均较模型组和用药组低；模型组各时间点光密度值和面密度均为最高；用药组各时间点光密度值和面密度值处于以上两者之间，各组间采用方差分析均有显着性差异。体外模拟脑缺血再灌注损伤实验提示：损伤后星形胶质细胞反应性增生肥大，表达BDNF和bFGF明显增强，此为一种保护性反应，除增强自身的修复外，还可能对神经细胞有保护作用。用药组较模型组细胞反应性增生减弱，提示抗呆Ⅰ号可减轻缺血再灌对星形胶质细胞的损伤作用。综上所述，在整体实验中抗呆Ⅰ号可减轻星形胶质细胞的损伤，使得星形胶质细胞的反应性胶质化程度减弱，用药组GFAP、BDNF、bFGF、bcl-2和bax的表达细胞数较模型组明显减少，在离体实验中抗呆Ⅰ号可使培养的星形胶质细胞损伤减轻，BDNF、bFGF蛋白表达减少,其机制可能是通过稳定内环境、增加对缺血缺氧的耐受性等作用减轻海马星形胶质细胞在脑缺血再灌注中的损伤，从而恢复和加强其对神经细胞的保护作用。
周秀娟[4]（2019）在《参芪复方的靶点网络构建及改善胰岛微循环障碍的实验研究》文中认为目的:基于网络药理学预测参芪复方治疗2型糖尿病的潜在靶点及作用机制;并以糖尿病血糖波动大鼠为研究对象,通过实验研究对参芪复方改善胰岛微循环进行疗效评价与机制探索。方法:1、以参芪复方为研究对象,运用网络药理学的研究方法,首先借助TCMSP数据库筛选参芪复方的化学组分及相关靶点,运用Cytoscape3.6.1对其“组分—靶点”进行网络拓扑学分析,通过Uniprot数据库进行官方名称校正及基因代码转换;其次,借助CTD/TTD/Drug Bank等数据库获取2型糖尿病相关靶点;将“药物—靶点”与“疾病—靶点”进行关联分析,获取参芪复方与2型糖尿病的共同作用靶点。借助STRING 11.0数据库构建其蛋白互作（PPI）网络,通过David数据库进行GO分析及KEGG通路富集分析,预测参芪复方治疗2型糖尿病的潜在靶点及作用机制。2、70只SD大鼠适应性喂养1周,采用链脲佐菌素（STZ）制备糖尿病模型,将糖尿病大鼠随机分为模型组（M）、中药高剂量组（SH）、中药中剂量组（SM）、中药低剂量组（SL）、格华止组（G）;此后连续8周每周2天定时予以皮下注射超短效胰岛素3U及腹腔注射250g/L葡萄糖溶液0.38g/（kg·d）,制备糖尿病血糖波动模型;另设10只普通SD大鼠作为空白对照组（C）。各组大鼠进行血糖波动造模的同时给予相应药物干预。药物干预期间每日观察大鼠一般状态（体质量、摄食量、饮水量）,每周测试1日5点血糖水平,计算各项血糖波动指数（MBG、SDBG、LABG）;药物干预8周后处死大鼠,腹主动脉采血,ELISA法检测血清胰岛素、肾素、血管紧张素II（Ang II）、醛固酮（ALD）;采集胰腺组织,HE染色观察胰岛病理形态改变、检测胰岛微血管数量与密度、胰岛微血管管壁厚度,免疫组织化学法（IHC）检测胰岛α细胞、β细胞数量;TUNEL法检测胰岛细胞凋亡情况;高通量测序法对胰岛微血管进行Affymetrix WT表达谱芯片测序,借助David数据库对差异基因进行GO分析及KEGG通路富集分析;QPCR技术检测胰岛ACE2、IRS-1、AKT1 m RNA表达水平;Western blot技术检测胰岛ACE2、Mas1、IRS-1、pan-AKT蛋白表达水平。结果:1、网络药理学研究结果（1）参芪复方药物配伍后,共计获得152个活性化合物组分,对应278个靶标蛋白;T2DM“疾病-靶点”共计26924个;将“药物—靶点”及“疾病—靶点”进行关联分析后,获得方剂与疾病共同作用靶点共计261个,其中一氧化氮合酶（NOS）家族、蛋白激酶B（AKT）家族是其核心靶点群,与代谢、炎症相关通路等密切相关。（2）“药物—疾病”共同靶点经KEGG通路富集分析,获得参芪复方治疗T2DM的通路共计182条;经文献比对,其中52条通路与T2DM密切相关,包括氧化应激（AGE-RAGE信号通路）、炎症反应（IL-17信号通路、TNF信号通路）、细胞凋亡、胰岛素抵抗等多条信号通路。（3）将上述靶点及通路与文献信息比对,预测参与胰岛微循环的靶标蛋白约35个,包括蛋白激酶B（AKT）家族、基质金属蛋白酶（MMP）家族、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族、肾素血管紧张素系统（ACE2、ANG2、ACE）等。2、实验研究结果（1）一般情况及胰岛病理结果显示:治疗后,中药三组大鼠整体情况较佳,毛色光亮,精神状态良好。M组与G组大鼠在造模后体质量不断下降,但中药三组（SH、SM、SL）大鼠体质量呈先降后升的趋势,与M组及G组比较具有明显差异（p<0.01,p<0.05）;造模后各组大鼠摄食量及饮水量均明显增加,与M组比较,中药三组（SH、SM、SL）可在一定程度上减少糖尿病多食、多饮情况（p<0.01）。各组大鼠胰岛病理损伤严重程度依次为:M>SH>G>SM>SL>C。（2）胰岛内分泌细胞及糖调节激素结果显示:与C组比较,造模后各组大鼠胰岛α细胞无明显变化（p>0.05）,而β细胞明显减少（p<0.01）;治疗后,与M组比较,SL组胰岛β细胞增加（p<0.05）;与M组比较,中药三组（SH、SM、SL）均可在一定程度上改善胰岛细胞凋亡（p<0.01,p<0.05）;与M组比较,SH组可在一定程度上恢复胰岛素水平（p<0.05）。（3）胰岛微循环各组分结构显示:治疗后,与M组比较,中药三组（SH组、SM组、SL组）大鼠胰岛微血管管壁增厚情况明显改善（p<0.01）;与M组比较,SM组胰岛微血管数量增加（p<0.05）,SL组、SM组胰岛微血管密度增加（p<0.05）。（4）肾素血管紧张素系统（RAS）激素结果显示:造模后各组大鼠血清肾素（Renin）均明显降低（p>0.05）,治疗后未见明显变化（p>0.05）;治疗后,与M组比较,中药三组（SH、SM、SL）血管紧张素II（Ang II）显着降低（p<0.01）;治疗后,与M组、G组比较,SL组大鼠血清醛固酮水平降低（p<0.05）。（5）胰岛微血管Affymetrix WT表达谱芯片测序及生物信息学分析显示:组间存在基因的显着差异表达:（1）模型组（M）与空白组（C）比较,获得差异基因共183个,其中上调基因59个（32.24%）,下调基因124个（67.76%）;GO富集获得99个条目,其中生物学过程44条（44.4%）,主要涉及胰岛素分泌参与细胞对葡萄糖刺激的反应、G蛋白偶联受体信号通路等;KEGG信号通路富集分析结果共16条,包括淀粉和蔗糖的代谢,肾素-血管紧张素系统,碳水化合物的消化和吸收,代谢途径等。（2）中药组（SL）与模型组（M）比较,差异基因共321个,其中上调基因239个（74.45%）,下调基因82个（25.55%）;GO富集获得93个条目,其中生物学过程59条（63.4%）,主要涉及G蛋白偶联受体信号通路、血管生成、血管形态发生等;KEGG信号通路富集分析结果共9条,包括核糖体,代谢途径等。（3）格华止组（G）与模型组（M）比较,差异基因共301个,其中上调基因183个（60.80%）,下调基因118个（39.20%）;GO富集获得74个条目,其中生物学过程50条（67.6%）,主要涉及钙调节通路等;KEGG信号通路富集分析结果共15条,包括Wnt信号通路,m TOR信号通路,Hippo信号通路等。（6）胰岛微循环关键调控靶点蛋白及m RNA表达情况显示:治疗后,与M组比较,中药组（SL组）ACE2、IRS-1 m RNA表达水平升高（p<0.01,p<0.05）,AKT1 m RNA表达水平有升高趋势,但无统计学意义（p>0.05）;中药组（SH组、SL组）ACE2、Mas1、IRS-1、pan-AKT蛋白表达水平增高（p<0.01,p<0.05）。结论:1、参芪复方具有“多组分、多靶点、多途径”的作用特点,可通过调节多个靶标蛋白及信号通路起到防治2型糖尿病的作用。2、参芪复方具有改善糖尿病血糖波动大鼠胰岛微循环的功效。参芪复方可在一定程度上改善糖尿病血糖波动大鼠多饮、多食、体重减轻等症状及胰岛病理形态,并且改善胰岛细胞凋亡,恢复糖调节激素水平,降低RAS激素的血管损伤,改善胰岛微血管血供,从而改善胰岛微循环。3、2型糖尿病胰岛微循环障碍具有多基因、多途径的特点,肾素-血管紧张素系统可能是参与胰岛微循环的重要环节,参芪复方改善糖尿病血糖波动大鼠胰岛微循环的可能机制是通过激活RAS旁路途径（ACE2/Mas轴）,促进IRS-1及AKT表达而实现。
曹学兵,孙圣刚,刘洪涛,童萼塘,夏穗生[5]（2003）在《Dynamic Expression of bFGF and TGFβ2 in Glomus Cell Grafts of Carotid Body in Rat Model of Parkinson Disease》文中研究说明
于莎莎[6]（2018）在《Klotho通过NF-κB p65通路调节BAG3表达对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移的作用机制》文中认为目的:近年来,血管重塑（Vascular remodeling）的发病机制和防治措施已成为国内外的研究热点。血管重塑是一个非常复杂的病理过程并且个体差异明显,其确切的机制仍不十分明确,但其共同的特征是血管弹性/血管平滑肌细胞收缩性增加和周围血管阻力增加,而其中每一个复杂的过程都涉及到血管平滑肌细胞的表型转化。血管平滑肌细胞表型转化的机制研究已成为有效预防及治疗高血压、动脉粥样硬化及血管再狭窄等的热点问题。血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）能够激活多种信号转导通路,经过与细胞膜上的Ang Ⅱ受体结合的作用,从而激发各组信号级联反应,因此现在人们普遍认为,多种血管增殖性疾病,例如高血压、冠状动脉粥样硬化及各种血管再狭窄疾病的发生及进展均与Ang Ⅱ的促进生长作用有关。同时Ang Ⅱ在VSMCs功能调节中也具有非常重要的作用,但是到目前为止Ang Ⅱ影响VSMCs增殖和迁移的分子机制尚不十分清楚,血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMCs）是Ang Ⅱ调节血管功能的主要靶细胞,也是Ang Ⅱ的一个重要来源。但是目前现有的研究尚不能完全诠释清楚Ang Ⅱ影响VSMCs增殖和迁移的分子机制。另外根据资料显示,在20世纪90年代发现的凋亡蛋白家族BAG（Bcl-2 associated athanogene,BAG）家族,它的成员可以通过“BAG”功能区与热休克蛋白（Heat-shock protein,Hsp）家族成员结合,BAG家族中最具有代表意义的就是BAG3,它与热休克蛋白Hsp70/Hsc70具有高度亲和力,通过作用于Hsp70/Hsc70产生非常广泛的细胞生物学效应,比如抑制细胞的凋亡或者促进肿瘤的转移等,BAG3在大部分正常人体组织中检测水平极低甚至不表达,可是在某些肿瘤组织中,例如白血病、实体肿瘤细胞内BAG3表达水平较高,维持肿瘤细胞存活,增殖及转移,而在特殊的应激作用下,如氧化剂、高温、血清剥夺等,即便正常细胞（如淋巴细胞,上皮细胞,神经胶质细胞）也会出现BAG3表达的增加。这些研究表明,BAG3通过与多种蛋白相互作用,在多个水平调控细胞的增殖、运动、迁移及侵袭等行为。NF-κB信号通路激活可以促进炎症反应及氧化应激,同时亦被证明参与血管平滑肌细胞的增殖及迁移过程。近期有研究证实,NF-κB通路参与调节BAG3的表达,是其中关键调节通路。我们前期研究发现,BAG3参与晚期糖基化终末产物（AGE）诱导的VSMCs的增殖、迁移过程,与血管平滑肌表型转化有重要联系,但BAG3是否参与Ang Ⅱ诱导的VSMCs增殖、迁移过程,及NF-κB通路是否参与其中,目前尚无研究涉及。在1997年日本学者Kuro-等在研究自发性高血压动物实验过程中发现了与衰老有关的新基因并将其命名为Klotho,通过对Klotho的进一步研究发现它长50kb,由5个外显子和4个内含子组成,分为膜型和分泌型两种蛋白,Klotho基因表达缺失的小鼠,出现了类似人衰老的各种表达变化。目前我国及国外研究人员也已经对Klotho基因及其表达产物进行了大量临床病例对照研究,发现Klotho基因的多态性和心血管疾病息息相关,同时与心血管疾病有关的危险因素,如慢性肾功能不全、血糖异常、尿酸升高、血压升高、血脂异常等也密切相关。因此,本研究将探讨Klotho和BAG3在Ang Ⅱ诱导的VSMCs增殖、迁移过程中的作用机制,探索NF-κB p65通路在该过程中的作用。阐明上述问题为心血管疾病的防治提供特异性治疗靶点,为揭示血管重构机制及动脉粥样硬化、高血压和血管再狭窄等心血管疾病的发病机制提供新的实验和理论依据。研究方法第一部分Ang Ⅱ诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移及NF-κB通路促进Ang Ⅱ诱导BAG3的表达及其作用机制:首先评估Ang Ⅱ对VSMCs增殖、迁移的影响,取5-9代对数生长期大鼠血管平滑肌细胞,以3′104个细胞接种于96孔板中（MTS测定）,细胞浓度为5′105个细胞接种6孔板中（用于流式细胞检测及实时定量PCR）,细胞为2′106个细胞接种于25cm2培养瓶中（用于Western blot印迹检测）培养细胞待其贴壁融合60-80%用无血清DMEM培养基同步化24h,分组处理:（1）对照组,（2）10-8 M Ang Ⅱ组,（3）10-7M Ang Ⅱ组,（4）10-6M Ang Ⅱ组,培养不同时间（0、4、8、16、24、48h）收获细胞。应用MTS评估Ang Ⅱ对VSMCs增殖影响;采用流式细胞术PI（Propidium Iodide,碘化丙啶）单染法评估Ang Ⅱ对VSMCs细胞周期影响;通过划痕实验和迁移小室实验来明确Ang Ⅱ对VSMCs迁移能力的影响;采用荧光实时定量PCR检测各组细胞PCNA和SM22 mRNA的表达;Western blot检测PCNA和SM22α水平表达;其次,评估BAG3在VSMCs增殖迁移中的作用及NF-κB通路促进Ang Ⅱ诱导BAG3的表达及其作用机制,首先应用基因沉默技术干扰BAG3的表达,再应用NF-κB通路抑制剂（PDTC）阻断通路表达,分组处理:（1）对照组,（2）Ang Ⅱ组（10-7 M）,（3）对照+sh RNA-BAG3,（4）Ang Ⅱ（10-7M）+sh RNA-BAG3,（5）对照+PDTC,（6）Ang Ⅱ（10-7 M）+PDTC。应用MTS评估VSMCs增殖;流式细胞技术评估细胞周期影响;通过划痕实验和迁移小室实验来评估VSMCs迁移能力的影响;采用荧光实时定量PCR法检测各组细胞BAG3mRNA的表达;Western Blot检测PCNA,SM22α,BAG3,NF-κB p65、p-NF-κB p65的表达水平;Western Blot检测细胞周期蛋白（Cyclin D1、Cyclin E、CDK2、CDK4）和迁移相关蛋白（ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、MMP2、MMP9）的表达变化;第二部分大鼠重组Klotho蛋白抑制Ang Ⅱ诱导VSMCs增殖、迁移及其对NF-κB p65/BAG3信号通路的作用及机制:取5-9代对数生长期大鼠血管平滑肌细胞,以3′104个细胞接种于96孔板中（MTS测定）,细胞浓度为5′105个细胞接种6孔板中（用于流式细胞检测及实时定量PCR）,细胞为2′106个细胞接种于25cm2培养瓶中（用于Western blot印迹检测）培养细胞待其贴壁融合60-80%用无血清DMEM培养基同步化24h,分组处理:（1）对照组,（2）Ang Ⅱ组（10-7 M）,（3）对照+Klotho组,（4）Ang Ⅱ+Klotho组,培养0h、4h,8h,16h,24h,48h,收获细胞。以外源性重组Kltoho蛋白处理Ang Ⅱ培养的VSMCs;采用MTS评估Klotho对Ang Ⅱ诱导VSMCs增殖影响;流式细胞技术评估Klotho对Ang Ⅱ培养的VSMCs细胞周期影响;采用鬼笔环肽染色法,荧光显微镜下观察细胞骨架及形态变化,并计算细胞面积及圆度。通过划痕实验和迁移小室实验来明确Klotho对Ang Ⅱ培养的VSMCs迁移能力的影响;采用荧光实时定量PCR检测各组细胞PCNA,BAG3和SM22αmRNA的表达;Western blot检测PCNA,BAG3,NF-κB p65、p-NF-κB p65和SM22α水平表达;Western blot检测细胞周期蛋白（Cyclin D1、Cyclin E、CDK2、CDK4）及迁移相关蛋白（ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、MMP2、MMP9）表达。结果1.Ang Ⅱ能明显增加VSMCs增殖能力,且呈现剂量和时间依赖的趋势。10-7M能够明显促进VSMCs的增殖。划痕实验和迁移小室证实Ang Ⅱ增加VSMCs迁移能力。2.Ang Ⅱ可以促进VSMCs中BAG3 mRNA和蛋白的表达升高并呈时间及浓度依赖性,以基因沉默干扰技术抑制BAG3的表达后,发现Ang Ⅱ引起的VSMCs的增殖及迁移增加幅度明显减轻。3.采用Western Blot检测VSMCs的SM22α及PCNA的mRNA及蛋白的表达,Ang Ⅱ+sh BAG3组较单纯Ang Ⅱ刺激组SM22α降低幅度及PCNA增加幅度及ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、MMP2、MMP9增加幅度明显减轻,BAG3参与调节Ang Ⅱ诱导的VSMCs增殖及迁移过程。4.Ang Ⅱ培养VMSCs过程中,Western Blot检测发现NF-κB通路明确激活,伴随BAG3的表达升高,以NF-κB p65的特异性抑制剂PDTC处理Ang Ⅱ培养的VMSCs后,Western Blot检测结果提示Ang Ⅱ+PDTC组BAG3蛋白表达水平较Ang Ⅱ组明显下降,提示NF-κB通路参与调节Ang Ⅱ诱导的BAG3表达增高。5.外源性重组Klotho蛋白可明显抑制Ang Ⅱ培养的VMSCs增殖,且呈现剂量和时间依赖的趋势。6.外源性重组Klotho抑制VSMCs周期进程,阻断细胞进入S期,单独Ang Ⅱ使VSMCs停滞在G0/G1期细胞比例,升高了S期和G2/M期细胞比例,而200 ng/ml Klotho与Ang Ⅱ共同刺激VSMCs组与单独Ang Ⅱ组相比,可以降低S期的细胞比例,抑制细胞周期进程。7.外源性重组Klotho能够降低由Ang Ⅱ诱导VSMCs中G0/G1期相关蛋白CDK2,CDK4,cyclin D1和cyclinE表达水平的升高。8.划痕实验和迁移小室证实外源性重组Klotho蛋白可抑制Ang Ⅱ刺激的VMSCs迁移。9.Western Blot结果显示,外源性重组Klotho能够降低Ang Ⅱ诱导的VSMCs中迁移和粘附相关蛋白MMP2,MMP9,ICAM-1,VCAM-1和MCP-1的表达。10.利用鬼笔环肽对细胞骨架染色,荧光显微镜下观察,发现Ang Ⅱ可使VSMCs细胞面积变大,形态变圆,骨架重排,肌丝分布杂乱,外源性重组Klotho预处理能够抑制Ang Ⅱ诱导的细胞骨架、形态、大小的改变。11.Western Blot结果显示,Ang Ⅱ可诱导VSMCs标志蛋白SM22α表达水平降低,BAG3和PCNA表达水平升高,而Klotho预处理可以缓解Ang Ⅱ诱导的上述指标的改变。12.以Klotho重组蛋白处理Ang Ⅱ培养的VMSCs后,Western Blot检测结果提示Ang Ⅱ+Klotho组较Ang Ⅱ组NF-κB p6磷酸化蛋白及BAG3蛋白表达均有显着降低。结论1.Ang Ⅱ刺激大鼠血管平滑肌细胞增殖及迁移,并呈时间及剂量依赖性。2.BAG3参与Ang Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖及迁移,Ang Ⅱ可通过NF-κB通路刺激大鼠血管平滑肌细胞中BAG3的表达。3.外源性重组Klotho蛋白可以抑制Ang Ⅱ诱导的VSMCs的增殖及迁移。4.外源性重组Klotho蛋白可通过调节Ang Ⅱ激活的NF-κB/BAG3信号通路来抑制大鼠平滑肌细胞的增殖、迁移。
丁红芳[7]（2014）在《胎盘间充质干细胞输注在缺氧缺血脑损伤模型中的研究》文中研究表明研究背景缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage,HIBD）是由于围产期窒息、缺氧、缺血引致的新生儿脑损伤性疾病,围产期的窒息会导致3～5/1000的活产婴儿患中度或重度缺氧缺血性脑病,常常导致新生儿死亡和遗留一些神经功能障碍,如脑性瘫痪、癫痫以及智力低下。其中,脑瘫是儿童期最主要的运动机能伤残性疾病,可造成患儿终生的残疾,HIBD的高发病率、致残率给患儿本人、家庭和社会都造成了巨大的精神、经济负担。HIBD的发病过程是一个十分复杂的病理过程,是多种机制综合参与的一系列连锁反应的结果,而目前确切的发病机制并不明确。目前新生儿HIBD的治疗多采用高压氧治疗、神经细胞营养药物、物理康复等措施,这对损伤程度相对较轻的患儿具有一定的效果,但对于中-重度脑病所造成的中枢神经功能障碍难以奏效。因此寻求一种有效的治疗手段对减轻HIBD患儿的病死率、致残率具有非常重要的临床意义。近年的研究表明,间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）治疗在HIBD的动物试验及临床前期试验中都取得了很大的进展,目前研究较多的是骨髓MSCs,但是BMSCs存在干细胞含量少、增殖能力和分化潜能减弱、有创操作、病毒感染的机率增高等局限性,使其临床应用和推广受到了限制。本研究证实从孕鼠胎盘可以分离、培养胎盘来源MSCs （placenta-derived mesenchymal stem cells, PD-MSCs）,经鉴定符合间充质干细胞鉴定标准,验证了从大鼠胎盘获得MSCs是完全可行的,而PD-MSCs因其自身的优点,将来可能会成为一种理想的种子细胞,具有极大的应用潜能。HIBD的发病机制涉及炎症反应、氧化应激损伤、脑组织能量代谢紊乱等多个环节。缺血后的炎症反应已成为研究的焦点,炎性细胞可以渗入到脑实质并释放多种神经毒性物质造成炎症级联反应,多种细胞因子参与其中,辅助T细胞17（T helper cell17, Th17）和调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）也在HIBD的发生、发展都起到至关重要的作用。另外,在脑组织缺氧缺血损伤中,氧化应激损伤也是一个核心病理过程,在机体抗氧化应激防御机制中,Keap1-Nrf2/ARE信号通路是重要的化学通路之一,可以通过综合的抗氧化、抗凋亡和抗炎特性起到保护细胞免受损害的作用,Nrf2调控下游血红素加氧酶HO-1酶的表达。脑损伤的细胞移植治疗最早被认为是一种神经细胞的替代机制,目前认为是一个多方面联合的修复机制,移植细胞不仅可以直接替代受损细胞,而且可以通过促进内源性神经干细胞、旁分泌营养因子、改善局部血供等机制。因而本研究结合HIBD的发病机理,从抗炎性反应和抗氧化应激机制两方面探讨了PD-MSCs的作用机制。研究目的第一部分：从大鼠的生长发育、神经行为学、病理改变等方面评估PD-MSCs干预治疗HIBD模型鼠的效果；第二部分：从抑制炎性反应、免疫调节、抗氧化应激等方面深入探讨PD-MSCs治疗HIBD模型鼠的作用机制。研究方法1.从孕鼠胎盘分离、培养PD-MSCs,利用流式细胞术检测细胞表型,利用体外诱导分化技术证明其多向分化能力,验证其是否符合间充质干细胞的国际通用标准；然后利用GFP转染标记PD-MSCs,回输新生鼠并观察MSCs输注后在体内各主要组织器官的分布情况；2.选取7日龄（postnatal day7, P7）健康Wistar大鼠,按照改良Rice法制作新生鼠HIBD模型。观察大鼠行为学改变,采用Bederson评分进行功能评分等级,标准为：0分：没有神经损伤症状；1分：抓大鼠鼠尾提起,大鼠不能完全伸展对侧前爪；2分：大鼠的前肢对对侧推力的抵抗能力下降；3分：大鼠出现向对侧转圈现象。HIBD模型建立后48h,随机分为对照组（Control）、 HIBD组（HIBD）、PD-MSCs治疗组（HIBD+PD-MSCs）和成纤维细胞治疗组（HIBD+Fibroblasts）,在立体定向引导下,向大鼠脑组织内匀速注射等量的PD-MSCs、成纤维细胞。3.细胞治疗后,观察每只实验大鼠的生长发育、皮肤外观形态、体重的增长情况及行为有无异常表现。4.采用悬挂试验、滑棒试验评价大鼠的运动行为；水迷宫试验评价大鼠的认知功能。悬挂试验、滑棒试验在P10、P16、P22和P28完成,Morris水迷宫试验在P24～P28完成。5.细胞治疗后5d, CD4+CD25+T淋巴细胞的检测。6.在大鼠缺氧缺血损伤后3h、6h、24h、3d、5d以及细胞治疗后3d检测了TNF-α、 IFN-γ、IL-10、IL-17mRNA的表达。7.缺血缺氧损伤后6h、24h、48h、72h、5d以及细胞治疗后5d时检测了HO-1、 Nrf2mRNA的表达。8.细胞治疗后5d,采用Western blot法分别对脾脏组织中Foxp3和海马组织中HO-1、Nrf2进行检测。9.细胞治疗后3d,应用ELISA法检测外周血清中TNF-α、IFN-γ、IL-10、IL-17的水平。10.缺血缺氧损伤后6h,24h,48h,72h以及细胞治疗后5d,检测海马组织中MDA含量。11.P28运动实验完成后,进行HE染色和尼氏染色并行病理分析。结果1.从孕鼠胎盘可以分离、培养出MSCs,利用流式细胞术和体外细胞诱导分化技术,证明所获细胞符合间充质干细胞鉴定标准,验证了从大鼠胎盘获得MSCs是完全可行的。2.新生鼠在缺氧开始时出现烦躁、紫绀,其后逐渐转为抑制,甚至出现抽搐。HIBD组与对照组相比体重明显减轻。悬挂试验、滑杆试验中,HIBD组大鼠与正常对照组比较表现出明显的运动机能落后,Morris水迷宫定位航行试验中,HIBD组与对照组相比逃避潜伏期明显延长,在第6天的空间探索试验中,HIBD组穿过原平台的频率明显降低。脑组织大体可见肿胀、苍白；后期有萎缩、梗死、液化。HE染色镜下见损伤侧皮层、海马神经细胞、小脑浦肯野细胞排列紊乱、变性、坏死。尼氏染色尼氏小体消退,出现神经元嗜酸性变、胶质细胞噬细胞现象。从生长发育、运动功能评估、病理改变等多方面判断HIBD模型是成功的。3.PD-MSCs脑内迁移：移植后6小时,GFP阳性PD-MSCs被发现主要是在注射部位。移植后6天,绿色荧光信号明显减弱。GFP阳性细胞在接受注射的大鼠缺血侧,而对侧皮层没有发现GFP阳性细胞。PD-MSCs主要在注射针道和／或注射部位被发现。然后大量细胞迁出注射部位、扩散到整个皮层和脑室周围区域。4.流式细胞术检测结果显示,HIBD组CD4+CD25+T细胞为11.4%,比正常对照组（8.69%）略有升高,细胞治疗后,成纤维细胞治疗组CD4+CD25+T细胞15.1%, PD-MSCs治疗组CD4+CD25+T细胞则显着升高,达18.0%。Western Blot检测大鼠脾脏Foxp3的蛋白含量,结果发现HIBD组脾脏Foxp3蛋白含量虽高于正常对照组,但无显着性差异,经过PD-MSCs治疗后,大鼠脾脏Foxp3的蛋白表达明显增多,与HIBD组比较具有统计学意义。5.缺氧缺血损伤后,脑组织中IFN-γ、TNF-α、IL-17和IL-10mRNA的动态变化结果：HIBD组TNF-α,IFN-γ和IL-17mRNA表达大幅上调,TNF-a mRNA在损伤后3h表达开始增加,在24h时表达大幅度升高,明显高于对照组。IFN-γ mRNA、IL-17mRNA表达升高时间较TNF-α有所延迟,其二者的表达高峰在HI损伤后3d。IL-10mRNA的表达在6h开始上调,在3d后达高峰。PD-MSCs治疗前后IFN-γ、TNF-α、IL-17和IL-10细胞因子水平比较：RT-PCR法检测PD-MSCs治疗组TNF-α, IFN-γ和IL-17mRNA表达明显低于HIBD组和成纤维细胞组,在HIBD组、成纤维细胞组和PD-MSCs治疗组三个实验组,IL-10mRNA的表达与对照组比较均明显上调,在PD-MSCs治疗组升高尤为明显,明显高于HIBD组和成纤维细胞组。6.ELISA法检测结果：HIBD组血清IFN-γ TNF-α、IL-17和IL-10水平均高于正常对照组,PD-MSCs治疗后,大鼠血清IFN-γ、TNF-α和IL-17水平较HIBD组、成纤维细胞治疗组均明显有所下降,而IL-10水平则显着有所升高,HIBD组与成纤维细胞治疗组之间IFN-γ、TNF-α、IL-17和IL-10水平没有显着差异。7. HIBD中HO-1、Nrf2的动态变化：HIBD组HO-1和Nrf2mRNA的表达与对照组相比较在6h开始上调、48h达高峰,其后HO-1和Nrf2mRNA的表达虽然逐渐下降,但在72h和5d仍保持在较高的水平。PD-MSCs治疗前后HO-1、Nrf2表达的比较：RT-PCR法检测HIBD组、成纤维细胞组和PD-MSCs治疗组三个实验组的HO-1和Nrf2mRNA的表达均高于正常对照组,而PD-MSCs治疗组则显着高于HIBD组和成纤维细胞组。Western blot分析表明HO-1和Nrf2在HIBD组、PD-MSCs治疗组和成纤维细胞治疗组均比对照组明显增多,其中PD-MSCs治疗组较HIBD组、成纤维细胞治疗组均明显增高。8.MDA水平动态变化及治疗前后对比：缺氧缺血性损伤后,脑组织MDA水平在HI后6h时开始显着升高,72h达峰值水平,随之MDA水平开始逐渐降低,5d时MDA水平虽显着降低,但仍然高于正常水平。PD-MSCs治疗组MDA水平与缺氧缺血组、成纤维细胞治疗组相比明显降低,具有显着性差异。结论1.从行为学、神经运动功能、病理改变等方面证实改良Rice法建造的HIBD模型是可行的、成功的。2.组织块贴壁法可以成功培养大鼠PD-MSCs。3. PD-MSCs干预不但能改善HIBD大鼠近期的神经运动功能,而且能改善HIBD大鼠的远期学习记忆功能。4. HIBD的发病机制之一是：促炎性细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-17和抗炎性细胞因子IL-10之间的失衡,同时存在CD4+CD25+Treg细胞功能紊乱。5. HIBD的发病机制之一是：抗氧化（Nrf2/HO-1）／氧化（MDA）水平之间的失衡。6. PD-MSCs治疗HIBD有效的机制之一可能是通过调节Th17/Treg细胞失衡。7.PD-MSCs治疗HIBD的作用靶点之一可能是上调Keap1-Nrf2/ARE/HO-1通路。
黄定强[8]（2004）在《骨髓间充质干细胞定向诱导分化的实验研究》文中研究表明目的 近年来,基于组织工程和基因工程技术发展起来的细胞或组织替代治疗和基因治疗是医学领域,甚至整个生命领域中的研究热点和前沿,为人类征服多种疾病提供了新的途径和希望。其中一个关键问题是要选择能满足要求和易于操作的靶细胞。这种理想的种子细胞应具备取材容易,对机体损伤小,体外培养时增殖力强、易稳定表达目的基因的表型,植入体内后能耐受机体免疫,快速产生功能活动,无致瘤性等特点。目前,在异体细胞移植免疫未根本解决之前,要实际应用的种子细胞就只能是自体细胞。骨髓来源的间充质干细胞（mesenchymal stemcells derived from bone marrow, MSC）是一小群存在于骨髓中的非造血细胞,在适宜的条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、甚至神经星状细胞等,因其具有高度自我更新能力和多向分化潜能等优点,符合上述标准,是细胞治疗和基因治疗可能的理想靶细胞。为此本研究以兔的骨髓间充质干细胞为研究对象从以下4个方面进行研究,认识并建立骨髓间充质干细胞的分离及体外培养条件,认识其生物学特性,认识并建立成骨、成软骨、成脂等多方向分化诱导的条件,为骨髓间充质干细胞应用于组织工程提供理论基础。
二、Dynamic Expression of bFGF and TGFβ2 in Glomus Cell Grafts of Carotid Body in Rat Model of Parkinson Disease（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Dynamic Expression of bFGF and TGFβ2 in Glomus Cell Grafts of Carotid Body in Rat Model of Parkinson Disease（论文提纲范文）
（1）Dental stem cells: The role of biomaterials and scaffolds in developing novel therapeutic strategies（论文提纲范文）
| INTRODUCTION |
| DIFFERENT TYPES OF SCAFFOLD FORMULATIONS |
| DSCS IN COMBINATION WITH SCAFFOLDS FOR TISSUE RESTORATION |
| TOOTH RECONSTRUCTION |
| BONE RECONSTRUCTION |
| NEUROLOGICAL DISORDERS |
| THE IMPACT OF DIFFERENT SCAFFOLDS USED IN DSCS CELL THERAPY |
| CONCLUSION |
（2）GDNF基因修饰的嗅鞘细胞对帕金森病的治疗作用及其机理（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明及缩略语 |
| 背景和目的 |
| 参考文献 |
| 第一部分 嗅鞘细胞的培养、纯化和鉴定和生物学特征 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 GDNF基因修饰的嗅鞘细胞的构建和生物学鉴定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 GDNF基因修饰嗅鞘细胞移植对帕金森病大鼠模型的治疗作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 GDNF基因修饰嗅鞘细胞移植对帕金森病大鼠模型的Bcl-2/Bax表达影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文及出版的着作 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 附件1 |
| 附件2 |
（3）中药抗呆Ⅰ号对脑缺血再灌注星形胶质细胞因子的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 综述一 星形胶质细胞 |
| 1. 星形胶质细胞的起源和分化 |
| 2. 星形胶质细胞的特异性标志物 |
| 3. 星形胶质细胞的形态和结构 |
| 4. 星形胶质细胞的功能 |
| （1） 生理功能 |
| （2） 在中枢神经系统发育，再生和脑移植中的作用 |
| （3） 在缺血性脑损伤中的可能作用 |
| 5. 星形胶质细胞与神经系统疾病 |
| 综述二 神经营养因子 |
| 1. 神经营养素家族 |
| 2. 睫状神经营养因子家族 |
| 3. 胶质细胞源性神经营养因子家族 |
| 4. 成纤维细胞生长因子家族 |
| 5. 其它 |
| 综述三 缺血性中风的中医药辩治概述 |
| 1. 病因 |
| 2. 病机 |
| 3. 治则治法 |
| 4. 方药 |
| 5. 问题与展望 |
| 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一.抗呆Ⅰ号对脑缺血后小鼠海马星形胶质细胞GFAP、BDNF和bFGF蛋白表达的动态变化影响的实验研究 |
| 实验二.抗呆Ⅰ号对脑缺血后小鼠海马星形胶质细胞bcl-2和bax蛋白表达的动态变化影响的实验研究 |
| 实验三.抗呆Ⅰ号对体外模拟脑缺血后星形胶质细胞BDNF、bFGF蛋白及BDNFmRNA动态变化影响的实验研究 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述二参考文献 |
| 综述三参考文献 |
| 实验一参考文献 |
| 实验二参考文献 |
| 实验三参考文献 |
| 综述一参考文献 |
| 照片 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）参芪复方的靶点网络构建及改善胰岛微循环障碍的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 1 选题背景 |
| 2 研究内容 |
| 3 技术路线 |
| 第一部分 网络药理学研究 |
| 1 资料 |
| 1.1 数据来源 |
| 1.2 数据分析 |
| 2 方法 |
| 2.1 技术路线 |
| 2.2 参芪复方活性化合物提取及筛选 |
| 2.3 参芪复方“组分—靶点”可视化分析 |
| 2.4 2型糖尿病“疾病—靶点”筛选 |
| 2.5 2型糖尿病—参芪复方的共表达网络 |
| 2.6 参芪复方治疗T2DM的 PPI分析 |
| 2.7 参芪复方治疗T2DM的GO分析 |
| 2.8 参芪复方治疗T2DM的 KEGG富集分析 |
| 3 研究结果与分析 |
| 3.1 参芪复方“组分—靶点”构建 |
| 3.2 参芪复方治疗T2DM的靶点构建 |
| 3.3 参芪复方治疗T2DM的 PPI分析 |
| 3.4 参芪复方治疗T2DM的GO分析 |
| 3.5 参芪复方治疗T2DM的 KEGG分析 |
| 3.6 参芪复方改善胰岛微循环的靶点与通路预测 |
| 4 小结 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 参芪复方改善糖尿病血糖波动大鼠胰岛微循环的疗效评价研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 饲养环境及饲料 |
| 1.3 实验药品 |
| 1.4 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 造模剂配制 |
| 2.2 造模及分组 |
| 2.3 干预方法 |
| 2.4 标本采集与处理 |
| 2.5 观察指标及检测 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3 实验结果及分析 |
| 3.1 一般情况观察 |
| 3.2 血糖波动比较 |
| 3.3 胰岛病理形态学比较 |
| 3.4 胰岛α细胞、β细胞含量比较 |
| 3.5 胰岛细胞凋亡情况比较 |
| 3.6 胰岛微循环情况比较 |
| 3.7 血清ELISA检测比较 |
| 4 小结 |
| 实验二 参芪复方改善糖尿病血糖波动大鼠胰岛微循环分子机制研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 饲养环境及饲料 |
| 1.3 实验药品 |
| 1.4 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 造模剂配制 |
| 2.2 造模与分组 |
| 2.3 干预方法 |
| 2.4 标本采集与处理 |
| 2.5 激光捕获显微切割 |
| 2.6 胰岛微血管Affymetrix WT芯片 |
| 2.7 Real-time PCR验证 |
| 2.8 Western blot验证 |
| 3 实验结果及分析 |
| 3.1 芯片杂交扫描图 |
| 3.2 组间数据分布集中趋势 |
| 3.3 组间数据差异表达情况 |
| 3.4 非监督层次聚类分析 |
| 3.5 差异基因筛选结果 |
| 3.6 差异基因GO分析 |
| 3.7 差异基因KEGG富集分析 |
| 3.8 胰岛ACE2、IRS-1、AKT1 mRNA表达水平比较 |
| 3.9 胰岛ACE2、Mas1、IRS-1、pan-AKT蛋白表达水平比较 |
| 4 小结 |
| 4.1 差异基因筛选结果 |
| 4.2 差异基因GO及KEGG分析 |
| 4.3 RT-PCR及WB验证结果 |
| 第三部分 讨论 |
| 1 消渴“从脾论治”的理论探讨 |
| 1.1 消渴理论探源 |
| 1.2 消渴从脾论治 |
| 1.3 参芪复方方义 |
| 2 糖尿病胰岛微循环的西医认知 |
| 2.1 糖尿病是一种慢性复杂性代谢紊乱性疾病 |
| 2.2 血糖波动是导致糖尿病及其并发症的重要因素 |
| 2.3 胰岛微循环障碍是血糖波动的关键环节 |
| 3 关于本研究中动物实验方案的设计 |
| 3.1 立题依据 |
| 3.2 动物模型的建立 |
| 3.3 检测方法的确定 |
| 3.4 评价指标的选择 |
| 4 参芪复方治疗T2DM的网络药理学研究 |
| 4.1 参芪复方治疗T2DM的靶点及通路验证 |
| 4.2 参芪复方治疗T2DM的靶点及通路预测 |
| 4.3 参芪复方改善胰岛微循环的靶点及通路预测 |
| 5 参芪复方改善胰岛微循环的作用探讨 |
| 5.1 参芪复方改善胰岛微循环的疗效评价 |
| 5.2 参芪复方改善胰岛微循环的机制探讨 |
| 6 参芪复方改善胰岛微循环的中医解读 |
| 6.1 糖尿病相关因素的中医学考辨 |
| 6.2 参芪复方改善胰岛微循环的探讨 |
| 7 中医药防治糖尿病的优势 |
| 7.1 执中致和,阴阳平衡 |
| 7.2 务虚求衡,整体辨证 |
| 7.3 养正徐图,调气为先 |
| 第四部分 结论 |
| 创新与特色 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件一:综述 胰岛微循环的中西医研究进展与述评 |
| 参考文献 |
| 附件二:在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（6）Klotho通过NF-κB p65通路调节BAG3表达对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 血管紧张素Ⅱ诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移及NF-κB通路促进血管紧张素Ⅱ诱导BAG3的表达及其作用机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 主要实验药品及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养与分组 |
| 2.2.2 AngⅡ的配制 |
| 2.2.3 BAG3-shRNA设计合成与转染 |
| 2.2.4 细胞计数法评估AngⅡ对血管平滑肌细胞增殖的影响 |
| 2.2.5 MTS评估AngⅡ对血管平滑肌细胞增殖能力影响 |
| 2.2.6 流式细胞术检测AngⅡ对VSMCs细胞周期分布变化的影响 |
| 2.2.7 细胞形态学观察 |
| 2.2.8 细胞培养及药物作用 |
| 2.2.9 RT-PCR检测AngⅡ对VSMCs增殖相关标志因子的影响 |
| 2.2.10 WesternBlot法检测AngⅡ对VSMCs增殖相关标志因子的影响 |
| 2.2.11 BAG3质粒的扩增、抽提及鉴定 |
| 2.2.12 Transwell实验检测VSMCs迁移 |
| 2.2.13 伤口愈合实验 |
| 2.2.14 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 AngⅡ诱导VSMCs增殖呈量-效及时-效关系 |
| 3.2 AngⅡ对VSMCs细胞周期的影响 |
| 3.3 AngⅡ对VSMCs迁移的影响 |
| 3.4 AngⅡ对VSMCs分化标志性基因SM22α和增殖标志基因PCNA表达的影响 |
| 3.5 AngⅡ通过上调BAG3表达促进VSMCs增殖和迁移 |
| 3.6 AngⅡ激活VMSCs中NF-κBp65信号通路 |
| 3.7 抑制NF-κBp65信号通路的活性可以下调AngⅡ诱导的VSMCs中BAG3的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 大鼠重组Klotho蛋白抑制血管紧张素Ⅱ诱导大鼠平滑肌细胞增殖、迁移及其对NF-κBp65/BAG3信号通路的作用及机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 主要药品和试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养与分组 |
| 2.2.2 AngⅡ的配制 |
| 2.2.3 大鼠重组Klotho蛋白的配制 |
| 2.2.4 实验分组 |
| 2.2.5 细胞计数法检测Klotho对AngⅡ对培养大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响 |
| 2.2.6 MTS评估AngⅡ对血管平滑肌细胞增殖影响 |
| 2.2.7 流式细胞术检测Kloth对AngⅡ诱导VSMCs细胞周期分布变化的影响 |
| 2.2.8 细胞形态学观察 |
| 2.2.9 WesternBlot法检测AngⅡ对VSMCs增殖相关标志因子的影响 |
| 2.2.10 鬼笔环肽染色检测VSMCs肌丝结构,骨架变化 |
| 2.2.11 Transwell实验检测VSMCs迁移 |
| 2.2.12 伤口愈合实验 |
| 2.2.13 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Klotho蛋白对AngⅡ诱导VSMCs细胞MTS代谢率的影响 |
| 3.2 Klotho蛋白对AngⅡ诱导VSMCs计数的影响 |
| 3.3 Klotho对AngⅡ诱导VSMCs细胞周期的影响 |
| 3.4 Klotho对AngⅡ诱导的VSMCs周期调控蛋白表达的影响 |
| 3.5 Klotho抑制AngⅡ诱导的VSMCs迁移能力 |
| 3.6 Klotho降低AngⅡ诱导的VSMCs内迁移相关蛋白的表达 |
| 3.7 Klotho抑制AngⅡ诱导的VSMCs的形态、面积变化及肌丝、骨架重排 |
| 3.8 Klotho对AngⅡ诱导VSMCs分化标志性基因SM22α和增殖标志基因PCNA表达的影响 |
| 3.9 Klotho通过调节NF-κBp65/BAG3信号通路抑制AngⅡ诱导的VSMCs增殖、转移 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）胎盘间充质干细胞输注在缺氧缺血脑损伤模型中的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分：胎盘间充质干细胞输注在缺氧缺血性脑损伤模型中治疗效果观察 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 创新性和局限性 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分：胎盘间充质干细胞有效治疗缺氧缺血性脑损伤作用机制的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 创新性和局限性 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）骨髓间充质干细胞定向诱导分化的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩写 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验一 兔骨髓MSC生物学特性 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 实验二 兔骨髓MSC向软骨细胞诱导分化的实验研究 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 实验三 兔骨髓MSC向类软骨组织诱导分化的实验研究 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 实验四 兔骨髓MSC向成骨与成脂的诱导分化的实验研究 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 图表与说明 |
| 正文参考文献 |
| 文献综述 |
| 综述一 |
| 综述一的参考文献 |
| 综述二 |
| 综述二的参考文献 |
| 致谢 |
四、Dynamic Expression of bFGF and TGFβ2 in Glomus Cell Grafts of Carotid Body in Rat Model of Parkinson Disease（论文参考文献）
- [1]Dental stem cells: The role of biomaterials and scaffolds in developing novel therapeutic strategies[J]. Cornelia Larissa Granz,Ali Gorji. World Journal of Stem Cells, 2020(09)
- [2]GDNF基因修饰的嗅鞘细胞对帕金森病的治疗作用及其机理[D]. 冯蕾. 山东大学, 2008(01)
- [3]中药抗呆Ⅰ号对脑缺血再灌注星形胶质细胞因子的影响[D]. 宋锐锋. 北京中医药大学, 2002(02)
- [4]参芪复方的靶点网络构建及改善胰岛微循环障碍的实验研究[D]. 周秀娟. 成都中医药大学, 2019(04)
- [5]Dynamic Expression of bFGF and TGFβ2 in Glomus Cell Grafts of Carotid Body in Rat Model of Parkinson Disease[J]. 曹学兵,孙圣刚,刘洪涛,童萼塘,夏穗生. 华中科技大学学报(医学英德文版), 2003(04)
- [6]Klotho通过NF-κB p65通路调节BAG3表达对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移的作用机制[D]. 于莎莎. 中国医科大学, 2018(01)
- [7]胎盘间充质干细胞输注在缺氧缺血脑损伤模型中的研究[D]. 丁红芳. 山东大学, 2014(04)
- [8]骨髓间充质干细胞定向诱导分化的实验研究[D]. 黄定强. 四川大学, 2004(11)