一、E-钙黏蛋白在出生后小鼠牙齿发育中的表达和意义（论文文献综述）
曹丽华[1]（2021）在《ZO-1/2在猪卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的表达与功能研究》文中研究表明闭锁小带蛋白（ZO）-1和ZO-2（ZO-1/2）,又称为紧密连接蛋白（TJP）-1和TJP2,属于膜相关鸟苷酸激酶（MAGUKs）家族,参与上皮细胞极性维持、基因转录、细胞增殖和肿瘤细胞转移等生物学过程。小鼠的研究发现,下调ZO-1/2表达对早期胚胎发育不利,表明两者参与胚胎发育调控,但ZO-1/2在家畜的研究较少,特别是在家畜卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的表达和功能尚不清楚。为此,本研究以猪为研究对象,研究ZO-1/2在猪卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的表达模式,并通过正负调控其表达的方式,探讨它们在卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的作用及分子机制。研究结果可丰富对ZO-1/2生物学功能的认识,同时为阐明家畜卵泡发育和卵母细胞成熟的分子机理提供依据。1、ZO-1/2在不同大小猪卵泡中的表达水平及对颗粒细胞增殖的影响实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western Blot（WB）分析ZO-1/2在猪胎儿各组织的表达结果显示,ZO-1/2在猪胰腺、大脑、心、肝、肺、肾、膀胱、小肠、卵巢和睾丸组织均有表达,两者在睾丸组织中的表达均显着高于卵巢组织（P<0.05）。不同直径猪卵泡中ZO-1/2的表达分析结果显示,它们在不同大小卵泡中均有表达,且RNA和蛋白水平表达趋势一致。ZO-1在小卵泡（<2 mm）颗粒细胞中的表达显着高于大卵泡（5～8 mm）（P<0.05）,ZO-2在小卵泡颗粒细胞中的表达显着高于健康中卵泡（3～5 mm）和大卵泡（P<0.05）。ZO-1/2在闭锁卵泡颗粒细胞中的表达均显着高于健康的中卵泡和大卵泡（P<0.05）,与小卵泡无显着差异（P>0.05）。ZO-1/2在卵丘卵母细胞复合体（COCs）中的表达均显着高于同等大小卵泡中颗粒细胞的表达（P<0.05）,它们在小卵泡COCs中的表达显着高于中卵泡和大卵泡,在闭锁卵泡COCs中的表达显着高于健康卵泡（P<0.05）。构建猪ZO-1/2的慢病毒表达载体,探讨过表达ZO-1/2对猪颗粒细胞增殖以及细胞周期和凋亡相关基因表达的影响。结果发现,过表达ZO-1或ZO-2均显着抑制颗粒细胞增殖（P<0.05）。上调ZO-1表达颗粒细胞的Occludin表达增加（P<0.05）,Cyclin A2和Cyclin B的表达降低（P<0.05）,Cyclin D1表达没有显着变化（P>0.05）。上调ZO-2表达颗粒细胞中Cyclin A2和Cyclin D1的表达显着降低（P<0.05）,Cyclin B和Occludin的表达变化不大（P>0.05）。过表达ZO-1/2不影响颗粒细胞中Bcl-2和Bax的表达（P>0.05）,而Caspase3和Caspase9表达显着上调（P<0.05）。2、ZO-1/2在猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育过程中的功能研究qRT-PCR和WB方法分析ZO-1/2在猪卵母细胞体外成熟（IVM）和早期胚胎发育过程中的表达模式,结果显示,ZO-1/2在卵丘细胞、卵母细胞和早期胚胎中均有表达,ZO-1α+仅在卵丘细胞、桑葚胚和囊胚表达。ZO-1/2在生发泡（GV）期卵母细胞中的表达极显着高于卵丘细胞（P<0.01）,它们在GV期COCs中RNA表达水平最高,在体外成熟18 h时蛋白表达水平最高。筛选有效干扰ZO-1/2的sh RNA片段,构建慢病毒表达载体,研究下调ZO-1/2表达对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响。QRT-PCR结果显示,成熟液中添加ZO-1/2 sh RNA慢病毒显着降低了MII期卵母细胞、卵丘细胞以及囊胚中内源性ZO-1/2的表达（P<0.05）。与未处理组相比,ZO-1sh RNA1、ZO-2sh RNA2慢病毒单独感染或二者联合感染均不影响卵丘细胞扩展、卵母细胞核成熟以及孤雌胚胎卵裂率（P>0.05）;ZO-2sh RNA2感染显着抑制了卵母细胞皮质颗粒迁移（P<0.05）,ZO-1sh RNA1没有显着影响（P>0.05）。下调ZO-1表达降低了孤雌胚胎的囊胚率（P<0.05）,下调ZO-2表达未产生显着影响（P>0.05）;下调ZO-1/2表达均降低了囊胚总细胞数（P<0.05）。下调ZO-1/2表达抑制了成熟后卵丘细胞中Cx43、Cx45、PTX3和PTGS2,卵母细胞中Cx45、BMP15、ZP3和C-kit的表达,以及囊胚中Nanog的表达（P<0.05）,不影响卵丘细胞中HAS2和囊胚中Oct4的表达（P>0.05）。3、猪卵泡发育和卵母细胞成熟过程中ZO-1/2的调控机制研究首先,通过qRT-PCR或WB方法分析了PMSG/h CG、MG132对ZO-1/2表达的影响。结果显示,成熟培养液中所含的PMSG/h CG不影响ZO-1/2的表达（P>0.05）,添加5μM MG132显着上调体外成熟22 h时ZO-1/2的RNA和蛋白表达水平（P<0.05）。其次,探讨了雌二醇（E2）对猪卵母细胞体外成熟、ZO-1/2及缝隙连接的影响。结果显示,低浓度E2不影响猪卵母细胞核成熟（P>0.05）,当浓度大于100μM时卵母细胞核成熟受到显着抑制（P<0.05）。钙黄绿素红染色结果显示,E2处理促进了体外成熟24 h时的细胞间缝隙连接通讯（GJIC）。QRT-PCR结果显示,E2处理显着上调了体外成熟24 h时COCs中Cx43、Cx45、ZO-1和ZO-2的表达（P<0.05）,但不影响它们在卵母细胞中的表达（P>0.05）。最后,研究了E2对体外培养猪颗粒细胞增殖及ZO-1/2表达的影响。结果显示,当E2处理浓度大于50μM时,颗粒细胞增殖速度显着下降（P<0.05）,而雌激素受体拮抗剂ICI182780处理没有显着影响（P>0.05）。在含10%FBS的培养条件下,E2浓度为10μM时能显着下调颗粒细胞中ZO-1/2的表达,浓度为100μM时显着上调ZO-1/2的表达（P<0.05）;100μM ICI182780和100μM E2联合处理不影响颗粒细胞中ZO-1/2的表达（P>0.05）。以上结果表明:（1）ZO-1和ZO-2在猪卵泡中的表达均呈现随直径增大而降低的趋势,且闭锁卵泡中ZO-1/2表达高于健康卵泡;（2）过表达ZO-1/2抑制颗粒细胞增殖,下调细胞周期相关基因并上调凋亡相关基因的表达;（3）ZO-1和ZO-2在猪卵母细胞体外成熟过程中的表达模式相似,ZO-1/2表达会降低猪卵母细胞成熟和早期胚胎发育效率;（4）ZO-1/2的表达在猪卵母细胞成熟过程中受泛素-蛋白酶体通路和雌激素的调控。
谢新生[2]（2021）在《Arl13b调控VEGFR2信号促进神经胶质细胞瘤生长的分子机制》文中研究表明研究背景及目的:神经胶质细胞瘤简称胶质瘤,是发生于神经外胚层的肿瘤,为一种具高度侵袭性,增殖能力强,最具破坏性和致命性的肿瘤之一。目前传统的治疗手段包括手术切除、放疗和放疗。尽管通过手术、放疗和替莫唑胺化疗等多种方式进行治疗,但大多数脑胶质瘤患者的预后仍然不佳,中位生存期很少超过16个月,整个病程的生活质量较差。在对胶质瘤的研究中,人们发现胶质瘤患者中主要有TERT、PTEN、Tp53、EGFR、IDH、VEGF、TSC和CDKN2A等基因发生突变,但其发病的机制仍然不是很清楚。Arl13b为一个小分子GTP酶,被认定为纤毛的一个标志蛋白,高度富集于纤毛,它在个体的生长发育中发挥重要作用,其突变将导致Joubert综合征。近年来,研究还证实Arl13b在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。VEGFR2为血管内皮生长因子受体家族成员之一,主要功能是在各种生理病理情况下诱导内皮细胞的增殖及迁移,介导血管的新生。通过生物信息学分析以及对临床样本研究,我们发现Arl13b在胶质瘤中高表达且与患者预后呈负相关。通过酵母双杂交筛选与Arl13b相互作用蛋白发现Arl13b与VEGFR2具有相互作用。胶质瘤瘤体中血管异常丰富,近年来针对抗肿瘤血管生成这一治疗策略引起人们极大的关注,并且也取得不错的效果。Arl13b是否调控VEGFR2促进肿瘤血管生成进而促进肿瘤生长为本研究论证的重点。本次研究从生物信息学、分子细胞生物学、临床队列研究等多方位进行探索验证,试图阐明Arl13b调控VEGFR2的分子机制,并证明Arl13b-VEGFR2信号轴在调控胶质瘤恶性生长过程中的重要作用及靶点价值。本研究将有助于明确胶质瘤恶性增殖的分子机制,为未来胶质瘤的分子诊断和靶向治疗提供重要理论依据。研究方法与结果:第一部分:酵母双杂交寻找与Arl13b相互作用蛋白方法:1.利用酵母双杂交的方法筛选与Arl13b相互作用的蛋白分子,通过基因功能查询分析选取出感兴趣的基因,利用GST Pull-Down、CO-IP及免疫荧光等方法验证相互作用。2.对Arl13b与VEGFR2各自功能结构域进行分段,寻找它们之间各自结合的区段,以为后期临床转化提供理论基础。结果:1.我们钓取到VEGFR2这个蛋白,经GST Pull-Down、CO-IP、免疫荧光等实验证实它们之间具有相互作用。2.分别纯化Arl13b和VEGFR2后进行MBP Pull-Down实验进一步证实它们之间具有直接相互作用。3.分别对VEGFR2和Arl13b进行分段,CO-IP实验证实Arl13b与VEGFR2的胞内酪氨酸激酶区段结合,VEGFR2与Arl13b全长结合。第二部分:在动物水平探索Arl13b是否调控血管形成方法:1.我们分别将Arl13b条件敲入(Rosa26LSL-Arl13b/+)或条件敲除(Arl13bFL/FL)的转基因小鼠与血管内皮细胞特异表达Cre重组酶转基因小鼠Tie2-Cre/Tek-Cre杂交,分别构建在血管内皮细胞中特异高表达Arl13b和特异敲除Arl13b的转基因小鼠模型,运用视网膜血管染色技术检测Arl13b高表达或敲除的小鼠视网膜血管的形态、分布和密度等情况。2.进一步,我们分别将Arl13b条件敲入(Rosa26LSL-Arl13b/+)或条件敲除(Arl13bFL/FL)的转基因小鼠与诱导型Tek-Cre ERT2杂交,分别构建在血管内皮细胞中特异高表达Arl13b和特异敲除Arl13b的转基因小鼠模型,Tamoxifen诱导,运用免疫荧光技术检测Arl13b高表达或敲除的小鼠脑组织中血管的形态、分布和密度等情况。结果:1.在血管内皮细胞中特异高表达Arl13b,幼鼠眼球视网膜血管脉络前端血管微丝生成增多,同时动静脉血管面积增大;在血管内皮细胞中特异敲除Arl13b后幼鼠眼球视网膜血管脉络辐射半径减小,尖端血管微丝生成减少,动静脉血管面积减小。2.同样,在血管内皮细胞中特异高表达Arl13b后,小鼠脑组织血管数量、面积、分支及出芽数量均增加,内皮细胞之间的连接变松弛;相反,在血管内皮细胞中特异敲除Arl13b后,小鼠脑组织血管数量、面积、分支及出芽数量均减少,血管基膜、周皮覆盖度增加,内皮细胞之间的连接变紧密。第三部分:在动物水平研究Arl13b是否通过影响肿瘤血管生成调控肿瘤生长方法:1.我们将Arl13b条件敲入(Rosa26LSL-Arl13b/+)的转基因小鼠与诱导型Tek-Cre ERT2小鼠杂交,构建在血管内皮细胞中特异高表达Arl13b的转基因小鼠模型(Rosa26LSL-Arl13b/+;Tek-Cre ERT2+),将鼠源的表达荧光素酶的神经胶质瘤细胞GL261-Red-Fluc定位注射到Rosa26LSL-Arl13b/+;Tek-Cre ERT2+及对照小鼠的大脑纹状体区,小动物活体成像监测神经胶质瘤细胞的生长,观察小鼠的生存期。利用免疫荧光方法检测Rosa26LSL-Arl13b/+;Tek-Cre ERT2+和对照小鼠神经胶质瘤组织中血管的形态、分布和密度等情况。2.将Arl13b条件敲除(Arl13bFL/FL)的小鼠与Tek-Cre ERT2杂交,构建在血管内皮细胞中敲除Arl13b的小鼠模型(Arl13bFL/FL;Tek-Cre ERT2+),将鼠源的表达荧光素酶的神经胶质瘤细胞GL261-Red-Fluc定位注射到Arl13bFL/FL;Tek-Cre ERT2+及对照小鼠大脑纹状体区,小动物活体成像监测神经胶质瘤细胞的生长,观察小鼠的生存期。利用免疫荧光方法检测Arl13bFL/FL;Tek-Cre ERT2+和对照小鼠神经胶质瘤组织中血管的形态、分布和密度等情况。3.将Arl13b条件敲除(Arl13bFL/FL)的转基因小鼠与血管内皮细胞特异表达Cre重组酶转基因小鼠Tie2-Cre/Tek-Cre杂交,构建在血管内皮细胞中特异敲除Arl13b的转基因小鼠模型,在敲除Arl13b的小鼠及对照小鼠皮下移植黑色素瘤细胞,监测瘤体的生长情况并运用免疫荧光技术检测Arl13b敲除及对照小鼠瘤体组织中血管的形态、分布和密度等情况。结果:1.在血管内皮细胞中特异高表达Arl13b,小鼠脑部胶质瘤瘤体组织中血管数量、面积及血管芽体数量均增加,血管基膜覆盖度降低,瘤体生长速度快于对照组,小鼠生存期缩短。2.在血管内皮细胞中特异敲除Arl13b,小鼠脑部胶质瘤瘤体生长速度慢于对照组,小鼠生存期得到延长。3.在血管内皮细胞中特异敲除Arl13b后,小鼠皮下黑色素瘤瘤体组织生长速度慢于对照组。敲除Arl13b后,瘤体组织血管数量和面积均减少,血管基膜、周皮覆盖度增加,内皮细胞之间的连接变紧密。第四部分:在血管内皮细胞中研究Arl13b调控VEGFR2信号通路的分子机制方法:1.构建脐静脉内皮细胞ECV304干扰Arl13b的稳定细胞系,免疫荧光检测干扰Arl13b后Arl13b和VEGFR2在细胞纤毛中定位的变化。2.在HEK293T细胞中外转Flag-VEGFR2质粒,同时共转GFP-Arl13b或对照质粒,检测VEGFR2及其下游分子活化水平。3.检测过表达及干扰Arl13b的稳定细胞系中VEGFR2及其下游分子活化水平,同时检测干扰Arl13b后对ECV304细胞迁移、侵袭和血管形成能力的影响。4.在HEK293T细胞中外转Flag-VEGFR2质粒,同时共转HA-Arl13b或对照质粒,检测VEGFR2在细胞膜上定位的变化。结果:1.Arl13b和VEGFR2共定位于纤毛中,干扰Arl13b后VEGFR2在纤毛中的定位减少。2.Arl13b与VEGFR2相互作用,促进VEGF-VEGFR2通路活化。3.Arl13b影响VEGFR2的内吞,过表达Arl13b,细胞膜上VEGFR2量增多。第五部分:探索神经胶质瘤临床样本中Arl13b表达情况及其与患者预后关系方法:1.通过生物信息学方法对GEO数据库中神经胶质瘤相关数据进行分析,明确Arl13b在神经胶质瘤中表达水平。2.收集神经胶质瘤患者的临床组织样本,通过免疫组织化学染色分析Arl13b在人神经胶质瘤组织样本中表达情况。3.采用―德国半定量系统‖评分方法对免疫组织化学结果进行评分统计,通过Kaplan-Meier生存曲线及Log rank检验分析Arl13b表达水平与神经胶质瘤患者生存预后的关系。结果:1.生物信息学分析显示Arl13b在神经胶质瘤中的表达高于其他肿瘤。2.在GEO数据库神经胶质瘤单细胞测序数据中,Arl13b在神经胶质瘤细胞中表达水平高于正常脑组织细胞。3.免疫组织化学染色检测Arl13b在不同分级的人神经胶质瘤组织样本中的表达水平,结果显示Arl13b在神经胶质瘤患者瘤体组织中高表达,且Arl13b的表达水平与神经胶质瘤的分级相关。4.生存分析显示Arl13b在神经胶质瘤中表达水平与患者预后相关,Arl13b表达越高,患者总生存期和无病生存期越短。第六部分:在神经胶质瘤细胞中研究Arl13b促进肿瘤生长的分子机制方法:1.检测不同神经胶质瘤细胞株中Arl13b的表达情况,选取Arl13b低表达的细胞株用过表达Arl13b的慢病毒感染构建过表达Arl13b稳定细胞株。2.利用细胞增殖和迁移实验检测神经胶质瘤细胞过表达Arl13b后对细胞增殖和迁移的影响,以及用Hedgehog通路抑制剂GANT61处理后对细胞增殖和迁移的影响。3.检测过表达Arl13b的神经胶质瘤稳定细胞系中Hedgehog靶基因的表达量,同时检测VEGF-A的表达量变化。4.用慢病毒感染U118-MG和U87-MG细胞构建过表达Gli2激活形式（Gli2A）的稳定细胞系,检测Hedgehog靶基因的表达量,同时检测VEGF-A的表达量变化。同时利用Hedgehog通路抑制剂GANT61抑制通路活性,检测VEGF-A的表达量变化。5.构建VEGF-A启动子区荧光素酶报告基因质粒,双荧光素酶报告基因实验验证Gli2是否调控VEGF-A。6.免疫荧光检测过表达Arl13b的神经胶质瘤稳定细胞系中Arl13b在外泌体中定位情况。收集培养上清,提取上清中外泌体,检测Arl13b是否随外泌体分泌。7.用提取的外泌体培养血管内皮细胞ECV304,免疫荧光检测Arl13b是否随外泌体被ECV304细胞摄取,并检测ECV304细胞中VEGFR2及其下游分子活化水平。结果:1.在检测的4株神经胶质瘤细胞系中,U87-MG细胞系中Arl13b表达量最低,用过表达Arl13b慢病毒感染U87-MG细胞系后,细胞中Hedgehog通路被激活。2.过表达Arl13b后,U87-MG细胞的增殖能力增强,用GANT61抑制通路活性后,U87-MG细胞的增殖能力受到抑制。3.过表达Arl13b后,U87-MG细胞的迁移能力加强,用GANT61抑制通路活性后,U87-MG细胞的迁移能力受到抑制。4.过表达Arl13b后,U87-MG细胞中Hedgehog通路被激活促进VEGF-A的表达。5.在神经胶质瘤细胞U118-MG和U87-MG中,过表达Gli2A激活Hedgehog通路并促进VEGF-A的表达。用GANT61抑制通路活性后,VEGF-A表达下调。6.双荧光素酶报告基因实验证实Hedgehog通路能够调控VEGF-A的表达。7.在神经胶质瘤细胞中,异常高表达的Arl13b能够随外泌体分泌至胞外,并且能够被血管内皮细胞摄取,促进VEGF-VEGFR2通路活化。结论:1.Arl13b激活Hedgehog信号通路促进神经胶质瘤生长,活化的Hedgehog通路促进VEGF-A的表达促进瘤体血管生成。2.神经胶质瘤细胞中Arl13b以外泌体形式分泌至组织间隙中被血管内皮细胞摄取,摄取的Arl13b与VEGFR2结合激活VEGF-VEGFR2通路,促进瘤体血管生成。3.Arl13b与VEGFR2相互作用协同VEGF激活VEGF-VEGFR2通路,促进神经胶质瘤血管生成,促进瘤体的生长。
冉春枭[3]（2021）在《FAM20家族蛋白调控小鼠关节软骨发育过程的机制研究》文中指出背景及目的Fam20（family with sequence similarity 20）蛋白是磷酸化分泌蛋白和蛋白多糖的一种新型激酶家族,包括Fam20A,Fam20B,Fam20C三个家族成员,在胚胎发育过程中均有重要的作用。Fam20C作为蛋白磷酸化过程中重要的蛋白激酶,其缺失会引起成骨功能以及生物矿化功能的紊乱。Fam20B则是细胞外基质蛋白糖基化过程中调节糖胺聚糖装配的木糖激酶,其缺失会引起细胞外基质蛋白多糖的减少,进而影响细胞功能。目前在发育生物学的研究中,Fam20蛋白家族对生物发育的影响越来越被重视,Fam20B、Fam20C与长骨关节发育的关系的研究已经有一定的进展,都是通过对底物蛋白的磷酸化调控,间接的在组织细胞中发挥生物学功能。Fam20C已被证明是Raine综合征的致病基因,其表现为致死性硬化性骨骼发育不良以及非致死性低磷酸血盐综合征。学者已经研究证明Fam20C可以调节牙釉质、牙本质的形成以及促进骨骼的矿化。但对于Fam20C在关节软骨发育过程中的作用并没有被详细研究。同时,Fam20A作为促进Fam20C功能的假激酶,有研究认为Fam20A在骨形成过程中不是促进Fam20C发挥功能的重要因素,而Fam20A在软骨发育中是否发挥促进Fam20C功能的作用也从未被提及。因此,本研究的第一部分培育了四种不同点位突变的小鼠模型,分别为:Col1-cre;Fam20Cf/f（间充质中完全敲除Fam20C）、Col1-cre;Fam20C-D446N（Fam20C第446位天冬氨酸突变为天冬酰胺）、Col1-cre;Fam20C-D437N（Fam20C第437位天冬氨酸突变为天冬酰胺）、Col1-cre;Fam20C-G374R（Fam20C第374位甘氨酸突变为精氨酸）。通过Fam20C不同点位的突变的小鼠模型观察其关节软骨的表型,初步揭示Fam20C在软骨发育过程中可能发挥的作用。同时对比长骨关节与颞下颌关节,讨论其在原发性软骨与继发性软骨中发挥的功能是否相同。最后再通过观察Wnt1-cre;Fam20af/f,Osr2-cre;Fam20af/f以及Col1-cre;Fam20af/f小鼠的关节软骨表型探讨Fam20A在关节软骨发育中是否对Fam20C有促进的功能。Fam20B在发育过程中的作用在近些年逐渐成为研究热点。研究发现Fam20B通过其所装配的蛋白多糖能够影响脊柱、长骨以及关节多种组织的发育过程。有学者通过Fam20B条件性敲除小鼠发现,依赖Fam20B的蛋白多糖可以通过Wnt等多种信号通路影响长骨关节产后的软骨内骨化过程。然而,颅面部的颞下颌关节虽然同为滑膜关节,但不同于四肢长骨关节,由于颞下颌关节的发育时间在胚胎发育晚期,其细胞来源于已发育成型的下颌支骨膜以及缺乏次级骨化中心等原因,因此髁突软骨被认为是继发性软骨,其发育过程与原发性软骨有着很大的差异。因此,本研究的第二部分通过Wnt1-cre;Fam20Bf/f小鼠在路神经嵴间充质来源的细胞中特异性敲除Fam20B,通过观察其表型以及软骨细胞增殖、分化的改变,阐明Fam20B在颞下颌关节发育过程中的作用,并讨论在继发性软骨与原发性软骨中Fam20B装配的蛋白多糖可能发挥着怎样的不同的生物学功能。而在第三部分的研究中,本研究通过观察对Ihh、BMP等多种信号通路在Wnt1-cre;Fam20Bf/f小鼠中表达模式的改变,揭示了Fam20B装配的蛋白多糖可能通过何种途径对颞下颌关节髁突及关节盘发育产生影响,并进一步完善了颞下颌关节发育过程的分子机制。综上,本研究将分三个部分探讨Fam20蛋白家族对关节软骨发育机制的影响。第一部分将重点分析条件性敲除Fam20C以及Fam20A时,小鼠长骨关节软骨以及颞下颌关节软骨表型的改变;第二部分重点通过分析Wnt1-cre;Fam20Bf/f小鼠模型中颞下颌关节表型的改变,探讨Fam20B装配的蛋白多糖在颞下颌关节关节盘以及髁突软骨分化成熟过程中发挥的作用;第三部分通过观察Wnt1-cre;Fam20Bf/f小鼠中多种信号因子的改变,探究Fam20B装配的蛋白多糖影响颞下颌关节关节盘和髁突软骨分化成熟的机制。方法（1）将Fam20C-D437N小鼠与Wnt1-cre小鼠小鼠交配,可得到Wnt1-cre;Fam20C-D437N小鼠。将Fam20C-G374R小鼠与Wnt1-cre小鼠小鼠交配,可得到Wnt1-cre;Fam20C-G374R小鼠。首先将Fam20a f/+雄性与Wnt1-cre,Osr2-cre或2.3Kb Col1a1-cre雌性杂交以获得Wnt1-cre。Fam20a f/+,Osr2-cre;Fam20a f/+和2.3Kb Col1a1-cre;Fam20a f/+小鼠。然后,Wnt1-cre;Fam20a f/+,Osr2-cre;Fam20a f/+和2.3Kb Col1a1-cre;Fam20a f/+小鼠与Fam20a f/f小鼠交配得到Wnt1-cre;Fam20a f/f,Osr2-cre;Fam20a f/f和2.3Kb Col1a1-cre;Fam20a f/f小鼠。将Fam20Bf/f小鼠与Wnt1-cre;Fam20Bf/-小鼠进行交配,可获得Wnt1-cre;Fam20Bf/f小鼠胚胎。Fam20Bf/f小鼠与p Mes-Ihh小鼠进行交配,可获得Fam20Bf/-;p Mes-Ihh小鼠。再以同样方法将Fam20Bf/-;p Mes-Ihh与Wnt1-cre;Fam20Bf/-合笼交配,可获得Wnt1-cre;Fam20Bf/f小鼠以及Wnt1-cre;p Mes-Ihh小鼠。（2）X-gal/Lac Z染色观察Fam20A表达模式（3）Masson染色法观察小鼠组织学形态。（4）茜素红/阿尔新蓝染色法观察小鼠骨软骨结构变化。（5）X射线照片观察骨组织形态及密度改变。（6）Von-Kossa染色观察组织矿化程度。（7）番红-固绿染色观察组织酸性粘多糖含量及分布变化。（8）IHC法检测小鼠颞下颌关节组织中Col2、Col10、Aggrecan、MMP-13、p-smad1/5/8、p-Erk、osterix、Sox9等蛋白水平变化及分布情况。（9）Brd U标记法检测小鼠组织细胞增殖情况。（10）TUNEL法检测小鼠组织细胞凋亡情况。（11）原位杂交法检测小鼠髁突中Ihh、PThrp、Gli2以及Pthc1的m RNA表达及分布情况。（10）测量及计数等均采用Image J软件来进行分析;数据绘图（柱状图）采用Graph Pad Prism 5软件进行;样本间的数据比较均采用独立样本t检验进行统计学分析,以p<0.05（*）作为具有统计学差异的标准,p<0.01（**）及p<0.001（***）为具有高度统计学差异。结果1、FAM20C与FAM20A对出生后骨关节发育过程的影响（1）Col1-cre;Fam20Cf/f小鼠在出生后长骨关节发育过程中影响骺软骨细胞分化进程,大量软骨细胞停留在肥大软骨细胞阶段,抑制骺软骨矿化形成新的骨小梁。Col1-cre;Fam20Cf/f-D446N小鼠以及Col1-cre;Fam20Cf/f-D437N小鼠在出生后长骨关节发育过程中影响骺软骨细胞分化进程,大量软骨细胞停留在肥大软骨细胞阶段,但其次级骨化中心的矿化过程被促进,而在骨松质处形成了短小但密集的骨小梁。Col1-cre;Fam20Cf/f-G374R小鼠在出生后长骨关节发育过程中出现了骺软骨形态异常,大量形态不规则的软骨细胞入侵成骨区域。（2）Col1-cre;Fam20Cf/f小鼠与Col1-cre;Fam20Cf/f-D446N小鼠在出生后颞下颌关节髁突软骨中的表型相似,与野生型小鼠相比,有更多肥大软骨细胞存在,髁突下方骨化程度较低。Col1-cre;Fam20Cf/f-D437N小鼠在出生后颞下颌关节髁突软骨中,在髁突骨膜下有大量异性软骨细胞异常增生。Col1-cre;Fam20Cf/f-G374R小鼠在出生后颞下颌关节中,其髁突形态窄小,肥大软骨细胞过度增生入侵成骨区域。（3）Fam20A在出生后小鼠长骨关节的骨髓以及骨骺处存在,在软骨中没有表达。Fam20A在出生后小鼠下颌骨中弥漫大量存在,但在臼齿、切牙乳头以及软骨中没有Fam20A的出现。并且在长骨以及下颌骨中,Fam20A的分布随着小鼠的发育不断地减少。（4）在间充质中敲除Fam20A不会引起长骨关节、下颌骨以及颞下颌关节的发育异常。2、在神经嵴间充质细胞中敲除Fam20B抑制了颞下颌关节髁突软骨及关节盘的发育过程的表型分析（1）相比于野生型小鼠,Wnt1-cre;Fam20Bf/f小鼠颞下颌关节髁突软骨从E15.5天开始出现肥大软骨细胞较少,未成熟软骨细胞以及成熟的软细胞排列密集且混乱,在髁突软骨细胞中占比较高。髁突软骨间充质中多糖阴离子减少,肥大软骨细胞矿化能力减弱,骨领骨化异常。（2）相比于野生型小鼠,Wnt1-cre;Fam20Bf/f小鼠颞下颌关节不能形成正常关节盘结构,只有形态纤薄、内部细胞排列不整齐的松散的类关节盘结构。同时下关节腔存在大量细胞残留,不能完成关节腔空化过程,类关节盘结构最终不能脱离髁突头部。（3）相比于野生型小鼠,Wnt1-cre;Fam20Bf/f小鼠颞下颌关节髁突软骨间充质中蛋白多糖含量急剧减少,在髁突顶端的纤维软骨层、未成熟软骨细胞层以及成熟软骨细胞层中均已经没有Aggrecan的存在,而基质金属蛋白酶13在Wnt1-cre;Fam20Bf/f小鼠颞下颌关节髁突软骨细胞外基质中分布明显增多。（4）相比于野生型小鼠,Wnt1-cre;Fam20Bf/f小鼠髁突软骨中Col2和Col10的含量均明显减少,髁突软骨的分化过程被抑制（5）相比于野生型小鼠,Wnt1-cre;Fam20Bf/f小鼠髁突软骨细胞增殖能力减弱,骨领与肥大软骨细胞交界处的凋亡信号增强。其下关节腔的凋亡信号相较于野生型小鼠有所减少。3、在神经嵴间充质细胞中敲除Fam20B抑制了颞下颌关节髁突软骨及关节盘的发育过程的机制研究（1）Wnt1-cre;Fam20Bf/f小鼠髁突中Ihh信号异常激活,其表达范围增加,下游效应因子Ptch1和Gli2,相比于野生型小鼠,在Wnt1-cre;Fam20Bf/f小鼠髁突软骨中则与Ihh一样被明显被上调表达,但在野生型小鼠中在纤维软骨细胞层应被Ihh正向激活的PThrp信号,却在Wnt1-cre;Fam20Bf/f小鼠中的表达明显下调。这说明上调的Ihh因子在临近的软骨细胞中发挥其功能,但不能通过远程信号传递正向激活PTHr P信号因子。（2）在神经嵴间充质细胞中过表达Ihh并没有出现与Wnt1-cre;Fam20Bf/f小鼠相类似的表型,Wnt1-cre;p Mes-Ihh小鼠出现了肥大软骨细胞大量增多,髁突长度增加,关节盘增厚的表型。说明Ihh在TMJ中可能在软骨细胞增殖、分化以及软骨细胞肥大过程中起到了正向作用,这与Ihh在长骨软骨内成骨中的作用有一定不同。（3）在Wnt1-cre;Fam20Bf/f小鼠髁突软骨细胞中,BMP经典信号通路在髁突软骨生发层细胞以及软骨膜中被异常激活,提示我们髁突软骨细胞的分化模式可能被改变。而Wnt1-cre;Fam20Bf/f小鼠颞下颌关节盘中Sox9表达明显下降,提示我们在Wnt1-cre;Fam20Bf/f小鼠中形成的类关节盘组织缺少纤维软骨,因此不能形成真正的关节盘组织。（4）Wnt1-cre;Fam20Bf/f小鼠髁突中非经典BMP信号通路以及FGF信号通路异常变化,提示我们Fam20B装配的蛋白多糖在髁突发育中是调节多种信号通路共同影响髁突软骨的发育。结论（1）Fam20C不同点位的基因突变会引起软骨细胞不同形式的异常表现,而Fam20C在原发性软骨与继发性软骨中发挥这不同的功能。在关节软骨发育过程中,Fam20A没有起到关键性的作用。（2）Wnt1-cre;Fam20Bf/f小鼠中,蛋白多糖功能的丧失使髁突软骨细胞软骨细胞分化延迟,关节盘缺乏胶原纤维而不能形成,下关节腔凋亡被抑制导致关节盘不能分离。（3）在颞下颌关节髁突分化过程中,BMP、IHH信号通路共同作用调节髁突软骨细胞的分化。而蛋白多糖的缺失抑制Ihh了远程调控PThrp的功能,导致不能形成完整的关节盘组织,同时影响了关节下腔的空化。
吴洋[4]（2021）在《多囊卵巢综合征对于围着床期子宫中免疫细胞及细胞外基质的影响》文中研究指明2018年“多囊卵巢综合征国际循证医学指南”中报道8%-13%的女性患有多囊卵巢综合征（Polycystic Ovary Syndrome,PCOS）,其中80%以上育龄期PCOS患者饱受不孕症的困扰。正常妊娠需要具备着床能力的胚胎与处于容受性的子宫内膜相互作用,两者缺一不可。即使PCOS患者通过辅助生殖技术移植了高质量的胚胎,子宫内膜的异常仍然会导致着床失败或不良的妊娠结局。目前,对于PCOS子宫内膜异常的研究相对不足,其导致着床失败的确切机制也仍未阐明。对于围着床期PCOS子宫内膜变化的机制研究,可以帮助我们寻找潜在的治疗靶点、进一步提升胚胎种植成功率并改善妊娠丢失。本课题从小鼠PCOS模型、脱氢表雄酮短期干预等小鼠处理,以及人PCOS内膜标本补充研究三个层次,对围着床期PCOS子宫内膜容受性的改变进行了分析探究。本论文利用脱氢表雄酮（Dehydroepiandrosterone,DHEA）处理小鼠建立PCOS模型,这些小鼠成功地表现出卵巢多囊样改变、高雄激素血症、体重增加、不孕等PCOS特征。对PCOS小鼠妊娠第4天的子宫进行转录组测序显示,差异2倍以上的基因中有610个上调,91个下调。生物信息学分析显示:在细胞组分和分子功能方面,差异基因富集最多的是细胞外基质和多种与之相关的功能,如细胞粘附分子、基膜、细胞桥粒、细胞顶端质膜、微绒毛等;生物过程的富集分析显示,免疫反应相关生物学过程占比最高,包括细菌免疫反应和防御反应等。为进一步明确DHEA对小鼠子宫细胞外基质和免疫细胞的影响,本研究使用DHEA对小鼠进行了不同的处理:妊娠第3天DHEA处理小鼠1天,妊娠第1-3天DHEA处理正常妊娠小鼠3天,同样的方法处理假孕小鼠3天,卵巢切除后给予小鼠21天DHEA处理。基于上述预测分析以及DHEA不同处理,我们对小鼠子宫中的免疫细胞数量及定位进行了详细研究。（1）与对照组相比,PCOS小鼠围着床期子宫中性粒细胞增多并向腔上皮附近聚集,差异极为显着;妊娠第1-3天给予DHEA处理后,子宫中性粒细胞数量显着增多,同时向宫腔附近聚集,假孕小鼠同样给予3天DHEA处理后,中性粒细胞数量增多,但定位没有变化。（2）围着床期PCOS小鼠子宫中巨噬细胞显着增多并在子宫腔附近聚集,DHEA处理3天对巨噬细胞的数量和分布影响不大,但长期DHEA暴露可以增加内膜中的巨噬细胞数量,并促使其向宫腔附近聚集,围着床期胚胎对子宫中巨噬细胞的影响不大。（3）妊娠第4天PCOS小鼠子宫内膜基质中树突状细胞减少,肌层中树突状细胞数量无明显变化;围着床期使用DHEA分别处理正常妊娠小鼠和假孕小鼠3天,正常妊娠小鼠子宫中树突状细胞无明显改变,假孕小鼠子宫基质中树突状细胞数量大幅增加;卵巢切除小鼠DHEA处理21天后树突状细胞在子宫基质和肌层中的数量均显着增加。（4）与对照组相比,PCOS小鼠围着床期子宫肌层中肥大细胞增多,DHEA处理对子宫中肥大细胞数量影响不大。（5）围着床期PCOS小鼠子宫中B细胞显着增多,并向宫腔上皮附近聚集;DHEA处理3天可促使B细胞增多并向宫腔上皮聚集,宫腔中胚胎对B细胞的分布影响不大。此外,我们详细分析了DHEA对围着床期子宫细胞间连接和细胞外基质的影响。（1）与对照组相比,PCOS小鼠围着床期子宫中埃兹蛋白（Ezrin）在子宫腔上皮和腺上皮中表达明显增加,围着床期DHEA处理1天或3天都可以显着增加Ezrin在小鼠子宫上皮中的表达,并且影响其分布模式,胚胎对子宫中Ezrin表达的影响不明显。在人胚胎种植窗口期,PCOS患者子宫内膜腔上皮和腺上皮Ezrin表达均强于对照组,差异显着。（2）PCOS小鼠围着床期子宫腔上皮和腺上皮中钙粘蛋白的表达显着增加;DHEA处理3天对正常妊娠小鼠子宫中钙粘蛋白的表达影响不大,但假孕小鼠DHEA处理3天后子宫腔上皮和腺上皮钙粘蛋白的表达均增强。在人胚胎种植窗口期,PCOS患者子宫内膜腔上皮钙黏蛋白的表达明显强于对照组,腺上皮钙黏蛋白的表达无明显差异。（3）与对照组相比,PCOS围着床期子宫肌层中层粘连蛋白的表达显着增加,腔上皮基膜、腺上皮基膜和血管基膜中层粘连蛋白的沉积变薄,由正常的锯齿状变为细线状;围着床期DHEA处理3天可改变上皮基膜和血管基膜中层粘连蛋白沉积的形态,但对其厚度影响不大,同时子宫肌层中层粘连蛋白的表达显着增强,胚胎对围着床期子宫中层粘连蛋白的改变无明显影响。（4）围着床期PCOS小鼠子宫基质中层粘连蛋白γ1的表达随基质中血管数目的减少而下降,DHEA处理3天显着降低腺上皮基膜层粘连蛋白γ1的表达。在人胚胎种植窗口期,PCOS患者子宫内膜腔上皮和腺上皮层粘连蛋白γ1的表达无明显差异。（5）与对照组相比,围着床期PCOS小鼠子宫中胶原蛋白IV在腔上皮基膜或腺上皮基膜中的沉积变薄,并且随着子宫基质中血管的减少,胶原蛋白IV的表达显着减少;DHEA处理3天可产生与PCOS相似的变化。（6）CD31主要表达于血管内皮细胞质中,妊娠第4天小鼠子宫中CD31表达较为密集,但PCOS小鼠子宫中表达减少,差异极为显着;PCOS小鼠子宫中CD31显示切面呈圆环状的血管,其密度明显下降,更多的是切面管腔呈狭长状的血管,数量也较少;围着床期DHEA处理3天后子宫中血管显着减少;胚胎可能对围着床期小鼠子宫中血管的数量有影响。（7）妊娠第4天PCOS小鼠子宫腔上皮中荆豆凝集素（Ulex Europaeus Agglutinin,UEA）受体的表达强于对照组,腺上皮中UEA受体的表达无显着差异;围着床期DHEA处理小鼠1天,子宫腔上皮UEA受体于宫腔游离面顶端及邻近的细胞质中呈强表达;DHEA处理3天腔上皮UEA受体表达减少呈不均匀分布;卵巢切除后,子宫腔上皮和腺上皮中未见UEA受体的表达;围着床期子宫腔中的胚胎可能会诱导子宫上皮中UEA受体的表达增加。总之,PCOS小鼠与对照组小鼠妊娠第4天的子宫在m RNA层面存在显着差异,主要变化集中在免疫反应和细胞外基质等方面;DHEA对围着床期子宫中免疫细胞的数量和分布有较大影响,如中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞和肥大细胞等,这可能对其发挥正常的免疫作用有不良影响;细胞外基质是细胞通讯和细胞骨架的重要组分,DHEA对埃兹蛋白和钙黏蛋白的表达量都有较大改变,可能影响细胞的正常粘附和极性;DHEA对层粘连蛋白及其亚型、胶原蛋白IV以及CD31的影响,可能导致胚胎着床中细胞骨架的重构及细胞间沟通的异常。
李晓聪[5]（2020）在《Tβ4基因定点整合绒山羊的检测及该基因对绒毛生长促进作用的机制研究》文中指出羊绒是重要的高端纺织品原材料,随着世界范围内羊绒市场的日益扩大,对羊绒产量及质量的要求也日益提高。绒山羊作为我国优良的畜种,其羊绒品质优良,但多年来在绒山羊选育中为了提高羊绒产量盲目进行杂交,造成山羊平均产绒量和羊绒质量降低、传统良种和改良品种所占比例不高等问题。利用现代生物技术对绒山羊进行分子育种是今后绒山羊育种的重要方向。胸腺素β4具有多种生物学功能,其对毛发生长的促进作用已在很多研究中被证实,但作用机制还没有明确的定论。本研究在利用基因编辑技术获得Tβ4基因定点整合绒山羊的基础上,对Tβ4基因定点整合绒山羊进行鉴定及健康状况评价,观察Tβ4基因对绒山羊绒毛生长的影响,利用Tβ4基因定点整合绒山羊进行扩繁并对后代进行检测,进一步结合转录组学及蛋白组学分析探究Tβ4基因促进绒毛生长的机制,为今后利用基因编辑技术培育高产优质绒山羊提供理论依据。一、Tβ4基因定点整合绒山羊的检测1、Tβ4基因定点整合绒山羊的鉴定及健康状况评价本研究在利用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术获得了Tβ4基因在CCR5位点定点整合绒山羊的基础上,对该基因编辑绒山羊进行了southern blot检测、Real-time PCR检测及免疫细胞化学检测,检测结果表明我们获得的绒山羊实现了Tβ4基因在CCR5位点的定点整合。另外,对基因编辑绒山羊的安全问题及健康状况进行检测,检测指标主要包括脱靶分析、插入位点CCR5基因邻近基因mRNA水平的检测、生长状况监测及血常规检测,结果表明在所检测到的潜在脱靶位点中未出现脱靶现象,CCR5邻近基因的表达也未受到影响,绒山羊的生长状况及血液指标与对照相比均无显着差异。说明Tβ4基因的定点整合并未影响整合位点周围内源基因的表达,且获得的基因编辑绒山羊生长状况及健康状况良好。2、Tβ4基因定点整合绒山羊产绒性能的检测对绒山羊的产绒性能进行检测,检测指标主要包括绒纤维强伸度、细度、绒与毛的质量比及产绒量,检测结果表明,Tβ4基因定点整合绒山羊的绒纤维强伸度及细度与对照相比无显着差异,绒与毛的质量比与对照相比显着提高,产绒量与对照相比提高了74.5%。同时,还对绒山羊的皮肤组织进行了石蜡切片HE及免疫组织化学染色,结果表明Tβ4基因定点整合绒山羊的次级毛囊与初级毛囊的比（S/P）及次级毛囊处Tβ4基因的表达与对照相比显着提高。说明Tβ4基因主要作用于次级毛囊,并通过增加次级毛囊的数量进而提高产绒量。3、Tβ4基因定点整合绒山羊的扩繁及后代的检测对Tβ4基因定点整合绒山羊进行超数排卵处理,共获得20个2-8细胞期的胚胎,将这些胚胎分别移入4只受体羊中,共得到7只后代,其中有3只后代出生后不久死亡,经PCR鉴定,死亡的3只羔羊中有2只实现了Tβ4基因定点整合,存活的4只羔羊中有3只实现Tβ4基因定点整合。对4只存活羔羊的皮肤组织进行石蜡切片、HE染色、免疫组化及Tβ4基因的qPCR检测,发现Tβ4基因定点整合的羔羊表现出了更密集的次级毛囊分布及更高的S/P,并且Tβ4基因在次级毛囊处的表达量显着提高。对3只死亡羔羊进行解剖,取各内脏器官检测Tβ4基因mRNA表达情况,结果显示3只羔羊各脏器组织中Tβ4基因mRNA表达水平无显着差异,表明Tβ4基因的定点整合只会使其在皮肤组织中高表达而不会影响该基因在其它脏器中的表达,且利用基因编辑获得的Tβ4基因定点整合绒山羊可以将其优良性状稳定遗传给后代。二、Tβ4基因促进绒山羊绒毛生长的机制研究1、Tβ4基因定点整合绒山羊的转录组学分析将对照绒山羊与Tβ4基因定点整合绒山羊的皮肤组织进行高通量转录组测序,共筛选到差异基因1076个,其中上调基因463个,下调基因613个。上调差异基因在参与的生物学过程中主要富集在肽酶活性的负调控、皮肤屏障的建立、皮肤失水的调节;在实现的分子功能中主要富集在生长因子受体的结合。下调差异基因在参与的生物学过程中主要富集在多细胞生物过程的调控、细胞粘着;在实现的分子功能中主要富集在钙离子的结合。差异基因在KEGG富集分析中显着富集在了血管平滑肌收缩信号通路、cGMP-PKG信号通路、细胞黏附分子信号通路、肾素分泌信号通路、白细胞跨内皮细胞迁移信号通路。对差异基因富集的信号通路进一步分析,筛选了关键的差异基因,发现这些差异基因主要参与细胞间的连接,调节细胞间的运动并影响血管生成、血管舒张、血管通透性的改变及血管稳定性的维持等。对这些差异基因进行了实时定量PCR验证,结果与转录组测序相符。说明Tβ4可能通过影响细胞间的连接进而影响了细胞的运动,同时还影响了毛囊周围血管的生成及血管的舒张等,最终达到了促进绒毛生长的作用。2、Tβ4基因定点整合绒山羊的蛋白组学分析及关联分析利用iTRAQ技术,分析Tβ4基因定点整合绒山羊与对照绒山羊皮肤组织中的差异蛋白,共筛选到875个差异蛋白,其中上调蛋白666个,下调蛋白209个。上调的差异蛋白在参与的生物学过程中主要富集在离子跨膜运输;在实现的分子功能中主要富集在有机阴离子跨膜转运体活性。下调的差异蛋白在参与的生物学过程中主要富集在醛生物合成的过程和组蛋白mRNA代谢过程;在实现的分子功能中主要富集在锂离子结合和碱金属离子结合。在KEGG富集分析中,差异表达的蛋白显着富集在囊泡运输中的相互作用信号通路及TRP通道炎症介质调控信号通路,筛选了关键的差异蛋白包括MAPK、CAMK、PKC等。将蛋白组学分析与转录组学分析进行关联,发现共同上调或下调的差异基因/蛋白,结合信号通路,分析结果表明Tβ4的过表达使TIMPs的表达降低,进而MMPs的表达升高,促进了基底膜及细胞外基质的降解,释放出了与蛋白多糖以非共价键连接的VEGF,VEGF与VEGFR-2结合后激活了p38 MAPK信号通路,另外,Tβ4也激活了PKC信号通路。说明Tβ4通过MAPK及PKC信号通路影响肌动蛋白的组装,影响细胞的迁移、调节细胞的增殖与分化,最终促进了毛发的生长。
崔艺蕾[6]（2020）在《TGF-β2通过自噬调控EMT在后发性白内障中的作用及其机制研究》文中认为目的:探索TGF-β2通过自噬调控上皮间充质转化（EMT）在后发性白内障中的作用及其机制,为后发性白内障的防治提供新思路。方法:在人晶状体上皮细胞中,运用PCR、Western blot、免疫荧光法检测不同浓度TGF-β2对自噬相关蛋白LC3、P62、Atg5、Beclin-1表达的影响,运用透射电镜法观察自噬体的形成,从而探究TGF-β2对自噬及自噬流的影响。在加或不加入TGF-β2受体抑制剂SB431542后观察TGF-β2对自噬的改变。在运用雷帕霉素诱导自噬或3-MA抑制自噬的条件下检测EMT相关标记物的表达情况。结果:TGF-β2在人晶状体上皮细胞中特异性的诱导自噬及自噬流的发生,并且随着浓度增高,自噬水平增加,即出现自噬相关蛋白LC3、Atg5、Beclin-1表达增多、P62表达减少,同时电镜下观察到自噬体数量相对于对照组明显增多。自噬增强促进EMT的发生、自噬受阻抑制EMT的发生。结论:本研究首次发现TGF-β2在人晶状体细胞中诱导自噬发生,而自噬对EMT具有调控作用。因此,TGF-β2介导的自噬作为一个潜在的作用机制,为深入了解后发性白内障的发病机制提供了研究基础,为后发性白内障的预防及药物治疗提供新方向。
曹靓钰[7]（2019）在《MarvelD1对小鼠小肠上皮发育影响及其机制探究》文中研究指明本研究基于课题组前期利用Cre-LoxP系统结合交配方案建立的MarvelD1基因全身敲除型敲除鼠(MarvelD1-/-)模型,初步分析了MarvelD1对小鼠肠道发育的影响及其调控的分子机制,进而构建MarvelD1调控小鼠小肠上皮发育及功能细胞分化的信号网络。课题组前期原位杂交结果证实,在胚胎期E12.5和E15.5天两个时间点,MarvelD1在小鼠内胚层中高水平表达,说明在小鼠消化管发育以及小肠成熟过程中MarvelD1起到重要作用。在对出生当天小鼠小肠取样时发现,和MarvelD1基因野生型(MarvelD1+/+)小鼠相比,MarvelD1基因敲除型(MarvelD1-/-)小鼠出现小肠长度变短的缺陷表型。选择出生后各时间点对野生型和MarvelD1基因敲除型小鼠的体重进行称量发现,在出生早期MarvelD1基因敲除型小鼠体重和MarvelD1基因野生型小鼠体重相比具有显着性差异。本研究中选取出生当天P0,以及出生后1周、2周和6-8周几个不同发育时间点的小肠样品,分别进行了组织形态学和分子水平的检测分析。将MarvelD1基因杂合型(MarvelD1+/-)雄鼠和MarvelD1基因杂合型(MarvelD1+/-)雌鼠合笼后进行繁育,子代依据基因型鉴定结果收集小肠组织样本,分别进行石蜡包埋和液氮冻存处理用于后续实验分析。本研究获得的HE染色和免疫组化结果显示:在出生早期,与MarvelD1+/+小鼠相比,MarvelD1-/-小鼠小肠上皮组织存在明显的组织结构缺陷,上皮细胞分布杂乱无序,基底膜分离,功能型细胞数量减少、分布异常且细胞形态发生了改变。考虑到小肠作为内胚层发育器官具有终身持续更新的特征,并基于不同发育时间点的重要生物学过程,为进一步探究小肠组织缺陷表型产生的分子机制,本实验提取已收集到的出生前胚胎期小鼠的消化管及出生后各时间点的小鼠小肠组织的RNA,通过Real-time PCR测定分析各个时间点下小鼠肠道中Wnt和Hippo信号通路中关键调控分子的表达情况。实验结果表明,随着小鼠周龄的增加,出生后MarvelD1+/+小鼠小肠组织中Wnt5a、Dkk2、Lrp6、APC和Axin等Wnt信号通路中的调节分子以及Hippo信号通路中LATS1、SAV1、Tead2/4和Smad4的表达水平显着性下降,这些调控分子的表达水平随着发育进程的推进而表现出明显下调的趋势;而在MarvelD1-/-小鼠小肠中上述信号通路中的调控分子表达水平并未出现随小鼠周龄不同而发生改变。这一结果提示,MarvelD1通过影响Wnt信号通路和Hippo信号通路中关键调控分子的表达,进而发挥影响小肠发育及功能的生物学作用。综上所述,本研究结果初步确认在MarvelD1基因敲除型小鼠的小肠上皮组织结构表型存在异常改变;在出生后小鼠小肠上皮发育过程中,MARVELD1主要通过影响Wnt信号通路中相关分子的表达和Hippo信号通路中部分调节分子的表达,进而调控了小肠上皮的发育进程,并可能影响小肠功能的完善。整合出生前胚胎期样本检测分析结果,构建了MARVELD1调控小鼠小肠上皮发育及功能细胞分化的分子网络。为深入了解MARVELD1在小鼠内胚层器官发育过程中的作用提供了新思路。
孟凡兰[8]（2019）在《TGF-β/Smad3信号通路在后发性白内障形成中的作用和机制研究》文中认为目的后发性白内障（posterior capsule opacification,PCO）,是现代白内障超声乳化联合人工晶状体植入术后最常见的并发症,也是导致患者术后视力再次下降的主要原因。目前认为白内障术后残留的晶状体上皮细胞（lens epithelial cells,LECs）增殖、迁移、上皮间质转分化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）以及细胞外基质沉积是PCO发病的主要原因。目前最有效的治疗方法是利用Nd:YAG激光将后囊膜切开,但是此种方法可能引起黄斑水肿、视网膜脱离等并发症。本研究拟探讨PCO的发病机制,为PCO的诊疗策略提供新的思路。转化生长因子-β（Transforming growth factor-beta,TGF-β）被认为是诱导LECs转分化最强劲的细胞因子,通过抑制TGF-β信号通路从而抑制晶状体上皮细胞增殖和转分化,这可能为后发性白内障提供新的治疗方法。Smad3是TGF-β/Smad信号传导通路的关键分子,为阐明TGF-β/Smad3信号通路对于PCO发病过程中LECs生物学作用的精确调控,本项研究拟通过细胞实验及动物模型明确TGF-β/Smad3信号通路在LECs诱导PCO形成过程中的调控作用机制。方法第一部分:细胞实验,运用重组TGF-β2诱导活体外晶状体上皮细胞（HLE-B3）PCO模型,在培养基中分别加入/不加入Smad3抑制剂SIS3,运用CCK-8实验检测晶状体上皮细胞的存活率,以及Western blot验证SIS3对Smad3的抑制作用。实验分组:A:正常对照组;B:阴性对照组:添加DMSO;C:TGF-β2组;D:TGF-β2+SIS3组。运用RT-PCR技术检测EMT过程中α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、转录因子Snail1和Slug、上皮标记物E-钙黏蛋白、纤维连接蛋白（fibronectin,FN）以及collagen type I的mRNA的相对表达量;利用免疫荧光技术检测原位FN和E-钙黏蛋白的表达。第二部分:动物模型实验,采用26G皮下注射针头刺破C57BL/6J小鼠晶状体前囊膜来诱导晶状体上皮-间质转化,为下一步实验提供模型基础。1、组织学观察小鼠晶状体前囊膜损伤愈合情况。2、实时荧光定量PCR技术检测小鼠晶状体前囊膜损伤后α-SMA、CDH1（E-钙黏蛋白）、lumican、骨桥蛋白（osteopontin,OPN）、FN、collagen type I的mRNA的相对表达量。3、免疫荧光染色技术检测小鼠晶状体前囊膜损后α-SMA、lumican、FN原位蛋白的表达。第三部分:利用Smad3基因敲除鼠（Smad3 knocout,Smad3 KO/Smad3-/-）和野生型小鼠（wide type,WT/Smad3+/+）建立晶状体前囊膜损伤模型,进一步在活体内研究Smad3缺失对于晶状体上皮间质转化的影响。1、组织学观察比较Smad3 KO和WT小鼠晶状体前囊膜损伤愈合情况。2、实时荧光定量PCR技术检测Smad3 KO和WT小鼠晶状体损伤后α-SMA、Snail1、Slug、Twist1、SIP1、E-钙黏蛋白、lumican、OPN、透明质酸酶（Hyaluronidases,HASs）、FN、collagen type I的mRNA的相对表达量。3、Western blot方法检测Smad3 KO和WT小鼠晶状体损伤后α-SMA、lumican、OPN、FN蛋白水平的表达差异。4、免疫荧光染色技术检测Smad3 KO和WT小鼠晶状体损伤后Smad3 KO和WT小鼠中α-SMA、E-钙黏蛋白、lumican、OPN、透明质酸（hyaluronic acid,HA）、FN、collagen type I原位蛋白的表达差异。5、TUNEL法检测Smad3 KO和WT小鼠的细胞凋亡数量。结果1、体外实验显示,当SIS3终浓度为3μM时,SIS3能有效的抑制p-Smad3的表达,对Smad3的抑制作用最强。2、SIS3有效抑制转录因子Snail1和Slug的表达,下调α-SMA的表达,上调E-钙黏蛋白,抑制细胞外基质纤维连接蛋白和collagen type I的表达。3、利用26G针头刺破晶状体前囊膜实验,结果表明术后α-SMA、lumican、OPN、FN、collagen type I表达增加,E-钙黏蛋白表达下降,成功诱导小鼠晶状体上皮转分化,该方法具有操作简单、安全、可重复性高、成本低的特点,为下一步体内实验提供基础。4、体内动物实验结果显示,Smad3缺失可抑制α-SMA、转录因子Snaill、Slug、Twist1、SIP1表达,促进E-钙黏蛋白表达,抑制lumican、OPN、HA、FN、collagen type I等细胞外基质表达。结论本研究通过细胞实验和动物模型实验证明TGF-β/Smad3参与调控晶状体上皮细胞间质转分化;Smad3是TGF-β/Smad3信号通路的关键靶点;阻断Smad3可以抑制该信号通路对晶状体上皮细胞的转分化;Smad3可能是后发性白内障和前囊下白内障等纤维化疾病的潜在治疗新思路。
李丹[9]（2019）在《环孢素A对围着床期胚胎滋养细胞微泡及LIF、FGF相关因子的影响》文中提出目的:胚胎着床即准备好的胚胎在特定时间到达子宫内膜,滋养细胞完成粘附、迁移、侵袭、植入、包埋等一系列生物学行为,胚胎植入是胚胎着床的重要条件,是一个关键的多步骤过程,这一步骤涉及激素、细胞因子、粘附分子、免疫系统等的协同作用,而滋养细胞粘附和侵袭是胚胎着床的关键步骤。我们课题组前期对滋养细胞的相关研究发现,环孢素（Closphere A,CsA）可促进胚胎滋养细胞的粘附作用,而滋养细胞粘附、侵袭是胚胎着床的必要条件,因此,本课题主要通过观察滋养细胞迁移能力,滋养细胞顶端微泡大小和面积,相关因子的表达情况,研究CsA对围着床期胚胎滋养细胞粘附和侵袭的作用及滋养细胞顶端微泡及相关因子在此过程中的影响。方法:促排、胚胎收集:将饲养至3周的雌鼠超促排后合笼、查栓、收集胚胎,收集的2细胞胚胎行序贯培养即卵裂期胚胎用G1培养液培养至D3,再将不同浓度的CsA加入至G2囊胚期培养液,并设置分组:对照组为CsA浓度0umol/L、实验组为CsA浓度1umol/L;迁移实验:胚胎续贯培养至7.5dpc时显微镜下观察胚胎铺展面积。电镜实验:分别收集D5、D6胚胎经2.5%的戊二醛固定过夜,琼脂包埋、酒精梯度脱水、树脂包埋、切片、铅染、铀染、烘干后行电镜观察滋养细胞形态学变化及滋养细胞顶端微泡的变化情况。q-PCR:收集D5.5胚胎提总RNA,q-PCR测胚胎的LIF、FGF、Vim的mRNA表达量。免疫荧光:收集5.5dpc胚胎分别用LIF、FGF、Vim抗体孵育,用DAPI进行胚胎细胞核染色,激光共聚焦显微镜观察LIF、FGF、Vim表达情况并用软件分析其相对表达量后进行统计。结果:通过测量胚胎滋养细胞在LN包被的皿底的铺展面积,发现实验组的面积为对照组的1.75倍,有统计学差异;电镜观察D5胚胎滋养细胞顶端微泡,实验组的微泡数量为对照组的3.93倍,有统计学差异,实验组微泡平均面积为对照组的1.38倍;电镜观察D6胚胎滋养细胞顶端微泡,实验组胚胎滋养细胞顶端微泡的数量为对照组的1.33倍,实验组微泡平均面积为对照组的3.43倍,有统计学差异;比较D5-D6微泡数量和微泡平均面积的变化,对照组的微泡平均面积D5为D6的3.6倍,微泡个数D5与D6无变化;实验组的微泡平均面积D6为D5的8.93倍,微泡个数D5为D6的2.9倍。清晰可见微泡膜破裂,内容物释放的过程;q-PCR验证mRNA表达量,实验组LIF较对照组无明显差异,实验组FGF的mRNA表达量较对照组增加1.65倍,有统计学差异,实验组VIM较对照组无明显差异,有下降趋势;激光共聚焦发现LIF、FGF、VIM均在胞质中表达,软件测量相关因子的相对表达量,实验组LIF荧光亮度为对照组的4.72倍,实验组的FGF的荧光亮度较对照组增强3.828倍,实验组的VIM的荧光亮度较对照组增强3.8倍,无统计学意义,与q-PCR结果大致一致。结论:环孢素可增加围着床期胚胎绒毛前滋养细胞的侵袭和迁移能力;环孢素对围着床前滋养细胞侵袭性的影响与滋养细胞顶端微泡的活性有关;环孢素对围着床期滋养细胞侵袭性的影响与LIF、FGF、VIM等因子通路有关;
康媛媛[10]（2019）在《MicroRNA-300通过靶向骨膜蛋白参与成釉细胞瘤骨质破坏的研究》文中指出目的:成釉细胞瘤（ameloblastoma,AB）是口腔颌面部最常见的牙源性肿瘤,约占60%以上。AB虽属良性肿瘤,但具有交界性肿瘤的性质。AB多发于青壮年,以下颌体及下颌角部常见。初期患者多无自觉症状,随着病情进展,颌骨逐渐膨大,造成畸形,肿瘤最终可穿透骨质,周围软组织遭受侵犯。AB最重要的生物学特性是具有局部侵袭性。目前,针对AB仅限于外科手术治疗,但术后容易导致复发,复发多次还可能发生恶变甚至远处转移,患者的生存质量受到严重的影响。因此,准确揭示AB的发病机制,将会为AB的预防以及探寻新的治疗途径提供理论指导。微小RNA（microRNA,miRNA）是广泛存在于真核生物中的一组长度大概为22个核苷酸的非编码单链RNA家族,其通常在转录后水平调控基因的翻译表达。有报道表明miRNA广泛存在于各种真核细胞中,参与机体的生长发育、细胞凋亡、脂肪代谢等过程。同时,miRNA在肿瘤的发生发展中也发挥着至关重要的作用。miR-300是一类新发现的miRNA,目前对其研究较少,之前的文献对于miR-300的报道更多集中在血液病中。本实验将对miR-300的研究转移到肿瘤的发病机制中,探讨其在AB中的功能并进一步探索作用机制,具有十分重要的意义。本实验应用基因芯片及生物信息学技术,筛选在AB差异性表达的miRNA（miR-300）;通过细胞功能学实验研究其在AM-1细胞中发挥的作用;根据生物信息学预测,对其潜在的靶点进行验证,并通过靶点分子的敲除,探讨对靶点的调控意义;同时对miR-300发挥调控作用的通路进行初步探讨。本实验结果将为进一步探讨miR-300在AB发病中的作用及其分子调控机制提供科学依据。研究方法:1、应用Human miRNA表达谱芯片技术,筛选在AB中差异性表达的miRNA,通过生物信息学技术及应用荧光实时定量PCR（qRT-PCR）验证,最终确定miR-300为后续研究对象。2、采用qRT-PCR方法,检测15对AB及瘤旁组织中miR-300的表达情况,同时采用Western blot、qRT-PCR和免疫组化的方法检测Periostin在AB及瘤旁组织中的表达情况。3、选用成釉细胞瘤细胞系（AM-1）作为研究对象,采用转染技术,将miR-300化学合成模拟物转染至细胞中,应用MTS、流式细胞术、Transwell等实验方法,观察其对AM-1细胞增殖、凋亡、细胞周期、侵袭等生物学行为的影响。4、利用在线生物信息学预测网站对miR-300的作用靶点进行初步预测及筛选,采用Western blot、qRT-PCR的方法等证实靶基因mRNA和蛋白水平表达的变化,通过构建荧光素酶实验的靶向序列进行鉴定,并进一步使用RNA干扰等实验来明确靶向调控关系和其对Rankl/OPG信号通路的影响。结果:1、miRNA芯片结果发现,与对照组（NOM）相比,AB组miRNA表达量变化在2.0倍以上,且有统计学差异（P<0.05）的miRNA确定为差异表达的miRNA。miR-300在AB中的表达是对照组的0.29倍（P<0.05）,差异有统计学意义,最终确定miR-300为下一步研究的对象。2、qRT-PCR结果显示miR-300在15例AB中的相对表达量显着低于瘤旁组织（P<0.05）;qRT-PCR和Western blot结果显示Periostin在15例AB中的相对表达量显着高于瘤旁组织（P<0.05）;应用Pearson相关分析发现miR-300与Periostin在AB中的表达呈负相关;应用免疫组织化学染色检测Periostin在AB中的相对表达量显着高于NOM（P<0.05）,且与疾病的复发密切相关。3、通过对AM-1细胞转染miR-300 mimics来过表达细胞中的miR-300,MTS和Transwell侵袭实验显示与对照组相比,AM-1细胞的增殖和侵袭能力明显降低（P<0.05）;流式细胞仪检测显示转染miR-300 mimics到AM-1细胞中,引起细胞G1/G0期阻滞,但细胞凋亡率没有显着变化。4、根据生物信息学分析,我们预测Periostin可能是miR-300的主要靶基因。miR-300负向调控Periostin的表达;双荧光素酶活性检测实验证实miR-300可以与Periostin 3’UTR区特定的位点结合,过表达miR-300后,可抑制Periostin 3’UTR WT组相对荧光素酶活性。5、通过对AM-1细胞转染si-Periostin来降低细胞中的Periostin,MTS和Transwell侵袭实验显示与对照组相比,AM-1细胞的增殖和侵袭能力明显降低（P<0.05）;流式细胞仪检测显示转染si-Periostin到AM-1细胞中,引起细胞G1/G0期阻滞,但细胞凋亡率没有显着变化,这和miR-300 mimics在AB中的功能相一致。6、通过对AM-1细胞转染miR-300 mimics,miR-300 inhibitor和si-Periostin,qRT-PCR和Western blot结果显示与对照组相比,转入miR-300inhibitor+si-Periostin-2组Rankl、OPG、C-fos的表达无明显变化（P>0.05）;转入miR-300 mimics组和转入si-Periostin组的结果相同,Rankl、C-fos的表达都明显降低,而OPG的表达都明显升高（P<0.05）;相反,转入miR-300 inhibitor组Rankl、C-fos表达明显升高,而OPG mRNA的表达明显降低（P<0.05）,OPG蛋白的表达却无明显变化（P>0.05）。结论:1、结合Human miRNA表达谱芯片技术,我们发现了miR-300在AB中低表达,Periostin在AB中高表达,miR-300与Periostin的表达负相关,且Perisotin的表达与AB复发密切相关。2、过表达miR-300可以显着抑制AM-1细胞增殖和侵袭能力,使AM-1细胞发生细胞周期阻滞,但对AM-1细胞的凋亡无明显影响。3、Periostin是miR-300作用的靶基因。4、MiR-300通过靶向Periostin调控Rankl/OPG信号通路。
二、E-钙黏蛋白在出生后小鼠牙齿发育中的表达和意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、E-钙黏蛋白在出生后小鼠牙齿发育中的表达和意义（论文提纲范文）
（1）ZO-1/2在猪卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的表达与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词(中英文对照表) |
| 第一章 文献综述 |
| 1 卵泡发育和卵母细胞成熟 |
| 1.1 卵泡发育过程 |
| 1.2 颗粒细胞在卵泡发育和卵子发生过程中的作用 |
| 1.3 雌激素对卵泡发育的影响 |
| 1.4 卵母细胞体外成熟 |
| 1.5 雌激素对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 2 ZO-1/2基因研究进展 |
| 2.1 紧密连接 |
| 2.2 ZOs基因的发现 |
| 2.3 ZOs的结构 |
| 2.4 ZOs的分布 |
| 2.5 ZOs的功能及其作用机制 |
| 2.6 ZOs的调控因素 |
| 研究目的和意义 |
| 第二章 ZO-1/2在猪卵泡发育过程中的表达模式及作用初步研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 ZO-1/2基因在猪组织中的表达情况 |
| 2.2 ZO-1/2在猪卵泡发育过程中的表达模式 |
| 2.3 猪ZO-1/2ORF的扩增与序列分析 |
| 2.4 pGC-ZsGreen1-ZO-1/2慢病毒表达载体验证 |
| 2.5 过表达ZO-1/2对颗粒细胞增殖的影响 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 ZO-1/2在猪组织及卵泡发育过程中的表达规律 |
| 3.2 过表达ZO-1/2对猪颗粒细胞增殖的影响 |
| 4 小结 |
| 第三章 ZO-1/2在猪卵母细胞成熟过程中的表达规律及功能研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 ZO-1/2在猪卵母细胞体外成熟过程中的表达模式 |
| 2.2 ZO-1/2在猪早期胚胎发育过程中的表达模式 |
| 2.3 ZO-1/2sh RNA表达载体构建及筛选 |
| 2.4 下调ZO-1/2表达对猪卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3 讨论与分析 |
| 3.1 ZO-1/2基因在猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育过程的表达模式 |
| 3.2 下调ZO-1/2基因表达对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响 |
| 4 小结 |
| 第四章 ZO-1/2在猪卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的调控机制 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪卵母细胞体外成熟过程中ZO-1/2表达的调控因素 |
| 2.2 E_2对猪卵母细胞体外成熟和ZO-1/2表达的影响 |
| 2.3 ZO-1/2及Cx43 基因间的相互作用分析 |
| 2.4 E_2对颗粒细胞增殖的影响 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 体外成熟过程中ZO-1/2表达的调控方式 |
| 3.2 E_2对猪卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.3 E_2对颗粒细胞中ZO-1/2表达的影响 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
（2）Arl13b调控VEGFR2信号促进神经胶质细胞瘤生长的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 Arl13b与 VEGFR2 相互作用 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 免疫共沉淀和Pull-Down实验证实Arl13b与 VEGFR2 之间存在相互作用 |
| 3.2 Arl13b与 VEGFR2的C端酪氨酸激酶区段(834-1162aa)相互作用 |
| 4.结论 |
| 5.讨论 |
| 第二部分 Arl13b促进小鼠体内血管生成 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 血管内皮细胞中敲入Arl13b促进小鼠视网膜血管生成 |
| 3.2 血管内皮细胞中敲除Arl13b抑制小鼠视网膜血管生成 |
| 3.3 血管内皮细胞中敲入Arl13b促进小鼠脑部血管生成 |
| 3.4 血管内皮细胞中敲除Arl13b抑制小鼠脑部血管生成 |
| 4.结论 |
| 5.讨论 |
| 第三部分 Arl13b调控肿瘤血管生成从而促进肿瘤生长 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 血管内皮细胞中敲入Arl13b促进小鼠胶质瘤生长 |
| 3.2 血管内皮细胞中敲除Arl13b抑制小鼠胶质瘤生长 |
| 3.3 血管内皮细胞中敲除Arl13b抑制小鼠黑色素瘤皮下细胞移植瘤生长 |
| 4.结论 |
| 5.讨论 |
| 第四部分 Arl13b促进血管内皮细胞中VEGF-VEGFR2 通路活化 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 Arl13b促进VEGF-VEGFR2 通路活化 |
| 3.2 Arl13b增加VEGFR2 在细胞膜上的定位 |
| 3.3 血管内皮细胞中干扰Arl13b抑制内皮细胞增殖、迁移、侵袭和血管形成能力 |
| 4.结论 |
| 5.讨论 |
| 第五部分 Arl13b在神经胶质瘤中高表达并与预后相关 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 生物信息学分析Arl13b在神经胶质瘤中表达情况 |
| 3.2 Arl13b在神经胶质瘤组织中的表达情况 |
| 3.3 Arl13b在神经胶质瘤组织中的表达对患者预后的影响 |
| 4.结论 |
| 5.讨论 |
| 第六部分 Arl13b调控细胞间通讯促进血管形成 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 Arl13b激活Hedgehog通路促进胶质瘤细胞增殖和迁移 |
| 3.2 Arl13b激活Hedgehog通路促进VEGF-A表达分泌 |
| 3.3 Arl13b促进胶质瘤细胞中外泌体生成并随外泌体分泌至血管内皮细胞 |
| 4.结论 |
| 5.讨论 |
| 第七部分 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 Arl13b与纤毛研究进展 |
| 参考文献 |
（3）FAM20家族蛋白调控小鼠关节软骨发育过程的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 FAM20C与FAM20A调节出生后小鼠骨关节发育过程 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.2.1 材料 |
| 1.2.1.1 动物模型构建 |
| 1.2.1.2 主要仪器 |
| 1.2.1.3 主要试剂 |
| 1.2.2 方法 |
| 1.2.2.1 小鼠胚胎样本的收集及处理 |
| 1.2.2.2 组织学Masson染色 |
| 1.2.2.3 X-gal/LacZ染色(胚胎组织) |
| 1.2.2.4 X-gal/LacZ染色(骨组织) |
| 1.2.2.5 组织大体照和X射线照片 |
| 1.2.2.6 数据分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 Fam20C在不同点位突变在长骨关节处引发不同骨质缺陷 |
| 1.3.2 Fam20C在不同点位突变引起颞下颌关节髁突软骨分化异常 |
| 1.3.3 Fam20A在长骨和关节中的表达模式 |
| 1.3.4 在间充质中敲除Fam20A未导致长骨和关节的异常表型 |
| 1.3.5 Fam20A在产后下颌骨的表达模式 |
| 1.3.6 在下颌间充质中敲除Fam20A未引起异常表型 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 Fam20C不同点位的基因突变引起不同的长骨形成异常 |
| 1.4.2 Fam20C不同点位的基因突变导致颞下颌关节出现引起TMJ出现不同的异常表型 |
| 1.4.3 Fam20A生物学功能在成骨过程中是不必要的 |
| 1.5 结论 |
| 1.6 参考文献 |
| 第二部分 在神经嵴间充质细胞中敲除Fam20B抑制颞下颌关节髁突软骨及关节盘的发育过程的表型分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.1.1 动物模型构建 |
| 2.2.1.2 主要仪器 |
| 2.2.1.3 主要试剂 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.2.1 小鼠胚胎样本的收集及处理 |
| 2.2.2.2 茜素红/阿尔新蓝染色法检测骨/软骨变化 |
| 2.2.2.3 组织学Masson染色 |
| 2.2.2.4 Von-Kossa染色 |
| 2.2.2.5 番红-固绿染色 |
| 2.2.2.6 免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)法检测蛋白水平 |
| 2.2.2.7 BrdU标记法检测细胞增殖水平 |
| 2.2.2.8 TUNEL法检测细胞凋亡 |
| 2.2.2.9 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Wnt1-cre;Fam20B~(f/f)小鼠颞下颌关节组织学表型 |
| 2.3.2 Wnt1-cre;Fam20B~(f/f)小鼠髁突软骨细胞外间充质的改变 |
| 2.3.3 Wnt1-cre;Fam20B~(f/f)小鼠颞下颌关节髁突软骨分化延迟 |
| 2.3.4 Wnt1-cre;Fam20B~(f/f)小鼠颞下颌关节中细胞增殖、凋亡活性的改变 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 Wnt1-cre;Fam20B~(f/f)小鼠模型是研究蛋白多糖调控TMJ发育过程的理想动物模型 |
| 2.4.2 Fam20B装配的蛋白多糖调控髁突软骨的分化过程 |
| 2.4.3 Fam20B装配的蛋白多糖调控关节盘的形成和分离 |
| 2.5 结论 |
| 2.6 参考文献 |
| 第三部分 在神经嵴间充质细胞中敲除Fam20B抑制颞下颌关节髁突软骨及关节盘的发育过程的机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.1.1 动物模型构建 |
| 3.2.1.2 主要仪器 |
| 3.2.1.3 主要试剂 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.2.2.1 小鼠胚胎样本的收集和处理 |
| 3.2.2.2 原位杂交实验 |
| 3.2.2.3 组织学Masson染色 |
| 3.2.2.4 免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)法检测蛋白水平 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 Wnt1-cre;Fam20B~(f/f)小鼠髁突中Ihh信号通路异常激活 |
| 3.3.2 通过Wnt1-cre;pMes-Ihh小鼠探究Wnt1-cre;Fam20B~(f/f)小鼠髁突软骨分化延迟的机制 |
| 3.3.3 在Wnt1-cre;Fam20B~(f/f)小鼠髁突软骨细胞中,BMP经典信号通路被异常激活 |
| 3.3.4 蛋白多糖在TMJ关节盘形成过程中发挥关键作用 |
| 3.3.5 蛋白多糖的缺乏在髁突发育过程中引起多种信号通路网路紊乱 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 3.6 参考文献 |
| 综述 Fam20蛋白家族在滑膜关节发育中作用机制的研究进展 |
| 1 前言 |
| 2 Fam20蛋白激酶在细胞外基质蛋白磷酸化修饰中发挥生物学功能 |
| 2.1 Fam20C调节细胞外蛋白磷酸化修饰 |
| 2.2 Fam20A可以通过Fam20C发挥生物学功能 |
| 2.3 Fam20B调节细胞外基质蛋白多糖的装配 |
| 3 白多糖分类及功能 |
| 3.1 细胞外蛋白多糖 |
| 3.2 基底膜蛋白多糖 |
| 3.3 细胞表面蛋白多糖 |
| 3.4 细胞内蛋白多糖 |
| 4 滑膜关节概述 |
| 4.1 滑膜关节生理结构及胚胎期发育过程 |
| 4.2 滑膜关节的基因调控 |
| 4.3 细胞外基质蛋白对软骨发育中信号传导的调节作用 |
| 5 颞下颌关节胚胎期发育过程中的生物学特点 |
| 5.1 颞下颌关节的生理结构及功能 |
| 5.2 颞下颌关节的细胞及生化成分 |
| 5.2.1 颞下颌关节髁突软骨 |
| 5.2.2 颞下颌关节关节盘 |
| 5.2.3 颞骨关节窝 |
| 5.3 颞下颌关节胚胎期发育过程 |
| 5.4 颞下颌关节胚胎发育阶段的基因调控 |
| 5.4.1 调控髁突形态发生和分化成熟的基因 |
| 5.4.2 调控关节盘形态发生和分化成熟的基因 |
| 5.4.3 调控颞骨关节窝形态发生和分化成熟的基因 |
| 6 展望 |
| 7 参考文献 |
| 附录A 常用试剂的配制方法 |
| 附录B 表5 缩略词表(A-Z顺序) |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（4）多囊卵巢综合征对于围着床期子宫中免疫细胞及细胞外基质的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 多囊卵巢综合征流行病学 |
| 1.2 多囊卵巢综合征的诊断和病理生理 |
| 1.2.1 PCOS的诊断标准 |
| 1.2.2 PCOS的病理生理 |
| 1.3 多囊卵巢综合征与不孕症 |
| 1.4 妊娠早期子宫中免疫细胞的研究现状 |
| 1.4.1 妊娠早期免疫耐受 |
| 1.4.2 各类免疫细胞在妊娠早期子宫中的变化 |
| 1.4.2.1 巨噬细胞 |
| 1.4.2.2 树突状细胞 |
| 1.4.2.3 中性粒细胞 |
| 1.4.2.4 肥大细胞 |
| 1.4.2.5 B细胞 |
| 1.5 围着床期细胞间连接和细胞外基质的变化 |
| 1.5.1 细胞黏着分子-钙粘蛋白 |
| 1.5.2 膜细胞骨架连接蛋白-埃兹蛋白 |
| 1.5.3 细胞外基质-层粘连蛋白 |
| 1.5.4 细胞外基质-胶原蛋白IV |
| 1.5.5 细胞质膜表面的粘多糖—糖萼 |
| 1.6 多囊卵巢综合征动物模型的构建 |
| 1.7 本论文的研究目的、意义及技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 动物模型的构建 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 药物配制 |
| 2.1.3 动物材料收集 |
| 2.1.4 PCOS小鼠模型 |
| 2.1.5 早期妊娠 |
| 2.1.6 围着床期DHEA短期处理早期妊娠小鼠 |
| 2.1.7 围着床期DHEA处理假孕小鼠 |
| 2.1.8 DHEA处理卵巢切除小鼠 |
| 2.2 PCOS小鼠模型子宫中m RNA表达谱的研究 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 样品总RNA提取 |
| 2.2.3 样品RNA检测 |
| 2.2.4 RNA文库的构建与质量检测 |
| 2.2.5 上机测序 |
| 2.2.6 数据分析 |
| 2.3 人子宫内膜收集 |
| 2.4 免疫组织化学 |
| 2.4.1 试剂配制 |
| 2.4.2 免疫组化中使用的抗体 |
| 2.4.3 石蜡包埋及切片 |
| 2.4.4 具体操作步骤 |
| 2.5 免疫荧光 |
| 2.5.1 试剂配制 |
| 2.5.2 免疫荧光中使用的抗体 |
| 2.5.3 具体操作步骤 |
| 2.6 卵巢组织苏木精-伊红染色 |
| 2.6.1 石蜡切片脱蜡复水 |
| 2.6.2 染色步骤 |
| 2.7 甲苯胺蓝染色 |
| 2.7.1 染色试剂配制 |
| 2.7.2 甲苯胺蓝染色步骤 |
| 2.8 Western Blot |
| 2.8.1 所用试剂配制 |
| 2.8.2 制备蛋白样品 |
| 2.8.3 测定蛋白浓度并制备上样液 |
| 2.8.4 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.8.5 蛋白条带转膜 |
| 2.8.6 免疫印迹 |
| 2.9 Real-time PCR |
| 2.9.1 样品总RNA提取 |
| 2.9.2 反转录 |
| 2.9.3 qPCR引物设计 |
| 2.9.4 qPCR具体步骤 |
| 2.9.5 数据分析 |
| 2.10 统计学分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 PCOS模型的成功建立 |
| 3.1.1 表观及着床结局指标 |
| 3.1.2 病理学指标 |
| 3.1.3 血清生化指标 |
| 3.1.4 子宫中雄激素受体测定 |
| 3.2 PCOS模型小鼠子宫的m RNA表达谱测序结果 |
| 3.2.1 RNA质量评估 |
| 3.2.2 原始测序数据过滤及质量评估 |
| 3.2.3 参考基因组比对 |
| 3.2.4 基因表达分布和样本间相关性 |
| 3.2.5 差异基因的筛选 |
| 3.2.6 富集分析 |
| 3.3 DHEA对子宫免疫细胞数量及定位的影响 |
| 3.3.1 中性粒细胞 |
| 3.3.2 巨噬细胞 |
| 3.3.3 树突状细胞(DC) |
| 3.3.4 肥大细胞 |
| 3.3.5 B细胞 |
| 3.4 DHEA对子宫细胞间连接和细胞外基质的影响 |
| 3.4.1 埃兹蛋白 |
| 3.4.2 钙黏蛋白 |
| 3.4.3 细胞外基质-层粘连蛋白 |
| 3.4.4 胶原蛋白IV |
| 3.4.5 CD31 |
| 3.4.6 UEA受体 |
| 第四章 全文讨论 |
| 4.1 PCOS小鼠模型的成功构建 |
| 4.2 PCOS小鼠妊娠第4 天子宫m RNA表达谱的启示 |
| 4.3 PCOS围着床期子宫中免疫细胞异常变化 |
| 4.4 PCOS 围着床期子宫上皮细胞间连接的改变 |
| 4.5 PCOS围着床期子宫细胞外基质的变化 |
| 4.6 PCOS围着床期子宫上皮细胞质膜表面糖萼的变化 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）Tβ4基因定点整合绒山羊的检测及该基因对绒毛生长促进作用的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 Tβ4基因促进毛发生长的研究进展 |
| 1.1 Tβ4的分子和生化特性 |
| 1.2 Tβ4在细胞内的定位 |
| 1.3 Tβ4的功能研究进展 |
| 1.3.1 肌动蛋白结合蛋白 |
| 1.3.2 角膜修复及抗炎 |
| 1.3.3 加速皮肤伤口愈合 |
| 1.4 Tβ4促进毛发生长的研究进展 |
| 1.4.1 Tβ4通过激活毛囊干细胞促进毛发生长 |
| 1.4.2 过表达Tβ4促进牙齿异常发育及促进毛发生长 |
| 1.4.3 Tβ4 激活P38/ERK/AKT信号通路促进毛发生长 |
| 1.4.4 Tβ4 激活Wnt/β-catenin/ Lef-1 信号通路 |
| 1.4.5 Tβ4过表达增加绒山羊次级毛囊个数 |
| 1.5 结语 |
| 第二章 Tβ4基因定点整合绒山羊的检测 |
| 前言 |
| 第一节 Tβ4基因定点整合绒山羊的鉴定及健康状况评价 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 仪器设备 |
| 2.1.2 试剂耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Southern blot检测 |
| 2.2.2 Real-time PCR检测 |
| 2.2.3 免疫细胞化学检测 |
| 2.2.4 脱靶分析 |
| 2.2.5 基因位点检测 |
| 2.2.6 生长状况监测 |
| 2.2.7 血常规检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Southern blot检测 |
| 2.3.2 Real-time PCR检测 |
| 2.3.3 免疫细胞化学检测 |
| 2.3.4 脱靶分析 |
| 2.3.5 基因位点检测 |
| 2.3.6 生长状况监测 |
| 2.3.7 血常规检测 |
| 2.4 讨论 |
| 第二节 Tβ4基因定点整合绒山羊产绒性能的检测 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 仪器设备 |
| 3.1.2 试剂耗材 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 石蜡切片及HE染色 |
| 3.2.2 免疫组织化学 |
| 3.2.3 绒样检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 石蜡切片及HE染色 |
| 3.3.2 免疫组织化学 |
| 3.3.3 绒样检测 |
| 3.4 讨论 |
| 第三节 Tβ4基因定点整合绒山羊的扩繁及后代的检测 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 仪器设备 |
| 4.1.2 试剂耗材 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 Tβ4基因定点整合绒山羊的超数排卵 |
| 4.2.2 胚胎移植 |
| 4.2.3 子一代PCR检测 |
| 4.2.4 子一代Real-time PCR检测 |
| 4.2.5 皮肤组织石蜡切片及HE染色 |
| 4.2.6 免疫组化 |
| 4.2.7 绒山羊各组织器官Tβ4 基因m RNA表达水平的检测 |
| 4.2.8 血常规检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 超数排卵 |
| 4.3.2 胚胎移植 |
| 4.3.3 子一代PCR检测 |
| 4.3.4 子一代Real-time PCR检测 |
| 4.3.5 石蜡切片及HE染色 |
| 4.3.6 免疫组化 |
| 4.3.7 绒山羊各组织器官Tβ4 基因m RNA表达水平的检测 |
| 4.3.8 血常规检测 |
| 4.4 讨论 |
| 第三章 Tβ4基因促进绒山羊绒毛生长的机制研究 |
| 前言 |
| 第一节 Tβ4基因定点整合绒山羊的转录组学分析 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 绒山羊皮肤样本RNA的提取 |
| 5.2.2 质控数据统计 |
| 5.2.3 序列比对分析 |
| 5.2.4 转录组质量评估 |
| 5.2.5 转录本组装 |
| 5.2.6 转录组功能注释 |
| 5.2.7 表达量分析 |
| 5.2.8 表达量差异统计 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 绒山羊皮肤样本RNA的提取 |
| 5.3.2 质控数据统计 |
| 5.3.3 序列比对分析 |
| 5.3.4 转录组质量评估 |
| 5.3.5 转录本组装 |
| 5.3.6 表达量差异统计 |
| 5.3.7 差异表达基因的分析 |
| 5.3.8 差异表达基因的验证 |
| 5.4 讨论 |
| 第二节 Tβ4基因定点整合绒山羊的蛋白组学分析及关联分析 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 仪器设备 |
| 6.1.2 试剂耗材 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 皮肤组织总蛋白提取 |
| 6.2.2 总蛋白质浓度测定 |
| 6.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 6.2.4 还原烷基化和酶解 |
| 6.2.5 iTRAQ标记 |
| 6.2.6 高p HUPLC第一维分离 |
| 6.2.7 液相串联质谱 |
| 6.2.8 数据质控评估 |
| 6.2.9 全蛋白功能注释 |
| 6.2.10 差异蛋白分析 |
| 6.2.11 蛋白组与转录组关联分析 |
| 6.2.12 关联分析的验证 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 蛋白浓度测定 |
| 6.3.2 数据质控评估 |
| 6.3.3 差异蛋白统计 |
| 6.3.4 差异蛋白分析 |
| 6.3.5 蛋白组与转录组关联分析 |
| 6.3.6 关联分析的验证 |
| 6.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及发明专利 |
（6）TGF-β2通过自噬调控EMT在后发性白内障中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略语 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料和试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 TGF-β2在人晶状体上皮细胞中诱导自噬发生 |
| 3.2 TGF-β2在人晶状体上皮细胞内促进自噬流进行 |
| 3.3 在人晶状体上皮细胞中探究自噬与EMT的关系 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 转化生子因子β在后发性白内障的发病机制及其防治中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（7）MarvelD1对小鼠小肠上皮发育影响及其机制探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题来源 |
| 1.2 课题研究背景及研究目的和意义 |
| 1.3 国内外在该方向的研究现状及分析 |
| 1.3.1 MarvelD1 研究进展 |
| 1.3.2 胚胎期小鼠小肠发育时间轴及成熟小鼠的小肠上皮细胞 |
| 1.3.3 Wnt信号通路与小肠发育 |
| 1.3.4 Hippo信号通路与小肠发育 |
| 1.4 论文研究内容 |
| 1.5 技术路线 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 小鼠模型 |
| 2.1.2 引物序列 |
| 2.1.3 实验试剂与抗体 |
| 2.1.4 主要实验仪器 |
| 2.1.5 主要试剂配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠鼠尾基因组DNA提取 |
| 2.2.2 小鼠基因型鉴定 |
| 2.2.3 小鼠小肠组织固定及石蜡包埋 |
| 2.2.4 小鼠小肠组织石蜡切片及苏木素-伊红染色(HE染色) |
| 2.2.5 Alcian Blue染色 |
| 2.2.6 免疫组化染色 |
| 2.2.7 小鼠小肠组织RNA提取 |
| 2.2.8 小鼠小肠组织c DNA合成 |
| 2.2.9 实时定量PCR(Real-time PCR) |
| 2.2.10 数据分析及处理 |
| 第3章 MarvelD1基因敲除对出生后小鼠体重的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 MarvelD1 敲除鼠的获取与鉴定 |
| 3.3 MarvelD1 杂合鼠各基因型子代体重分析 |
| 3.4 MarvelD1 敲除鼠子代体重情况分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 出生后早期MarvelD1 敲除鼠小肠表型及功能细胞差异研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 出生当天MarvelD1 敲除鼠小肠表型以及小肠功能细胞差异 |
| 4.3 出生后一周MarvelD1 敲除鼠小肠表型以及小肠功能细胞差异 |
| 4.4 出生两周后MarvelD1 敲除鼠小肠表型以及小肠功能细胞差异 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 MarvelD1 调控小鼠小肠上皮发育及功能细胞分化分子机制探究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 MarvelD1的敲除对小鼠小肠组织中Wnt信号通路的影响 |
| 5.3 MarvelD1的敲除对小鼠小肠组织中Hippo信号通路的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）TGF-β/Smad3信号通路在后发性白内障形成中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、TGF-β/Smad3 信号通路对晶状体上皮细胞调控作用的体外研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 主要的试剂和耗材 |
| 1.1.3 主要的仪器和设备 |
| 1.1.4 主要试剂以及溶液的配制 |
| 1.1.5 其他实验耗材 |
| 1.1.6 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 CCK-8 法检测SIS3对HLE存活率的影响 |
| 1.2.2 Smad3 特异性抑制剂SIS3 能有效地抑制p-Smad3 的表达 |
| 1.2.3 SIS3 抑制Snail1及Slug在 TGF-β2 诱导的晶状体上皮细胞间质转分化中的表达 |
| 1.2.4 SIS3 抑制上皮间质转化过程中α-SMA的表达 |
| 1.2.5 SIS3 抑制上皮间质转化过程中E-钙黏蛋白的丢失 |
| 1.2.6 SIS3 抑制上皮间质转化过程中细胞外基质纤维连接蛋白和Ι型胶原蛋白的表达 |
| 1.2.7 免疫荧光染色检测SIS3对E-钙黏蛋白和Fibronectin表达的影响 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、小鼠晶状体上皮-间质转化模型的建立与验证 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要的试剂和耗材 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 实验所需主要试剂及溶液的配制 |
| 2.1.5 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 小鼠晶状体上皮-间质转分化模型建立并观察模型效果 |
| 2.2.2 小鼠晶状体前囊膜损伤后上皮间质转化相关指标检测 |
| 2.2.3 免疫荧光检测晶状体损伤后α-SMA、Lumican、Fibronectin原位蛋白的表达水平 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、TGF-β/Smad3 信号通路在外伤诱导的晶状体上皮-间质转化中的作用 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂和耗材 |
| 3.1.3 主要仪器和设备 |
| 3.1.4 实验所需试剂及溶液的配制 |
| 3.1.5 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 组织学检测WT和 Smad3 KO小鼠晶状体前囊膜损伤愈合情况 |
| 3.2.2 Smad3 的缺失抑制小鼠晶状体上皮细胞α-SMA表达 |
| 3.2.3 Smad3 的缺失增加小鼠晶状体上皮细胞E-cadherin表达 |
| 3.2.4 Smad3 的缺失抑制小鼠晶状体上皮细胞EMT过程中Snail1、Slug、SIP1和Twist1 转录因子的表达 |
| 3.2.5 Smad3 的缺失会减少细胞外基质lumican的产生 |
| 3.2.6 Smad3 的缺失会减少细胞外基质骨桥蛋白(OPN)的产生 |
| 3.2.7 Smad3 的缺失会减少细胞外基质透明质酸HA的产生 |
| 3.2.8 Smad3 的缺失会减少细胞外基质Fibronectin的产生 |
| 3.2.9 Smad3 的缺失会减少细胞外基质I型胶原蛋白的产生 |
| 3.2.10 Smad3 的缺失会促进晶状体细胞凋亡 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 TGF-β信号通路在后发性白内障中的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）环孢素A对围着床期胚胎滋养细胞微泡及LIF、FGF相关因子的影响（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 实验材料、设备 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 试剂配制 |
| 1.3 耗材 |
| 1.4 设备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 实验动物的饲养 |
| 2.2 鼠胚收集与培养 |
| 2.2.1 超促排与合笼 |
| 2.2.2 鼠胚收集前准备 |
| 2.2.3 鼠胚收集 |
| 2.2.4 鼠胚培养 |
| 2.2.5 鼠胚评估 |
| 2.3 小鼠胚胎滋养细胞铺展面积的测定 |
| 2.4 胚胎滋养细胞顶端微泡的测定 |
| 2.4.1 电镜实验胚胎的准备 |
| 2.4.2 电镜观察 |
| 2.5 小鼠胚胎滋养细胞相关因子mRNA的测定 |
| 2.6 小鼠胚胎滋养细胞相关因子定位与相对表达量的测定 |
| 二、数据处理与统计分析 |
| 三、结果 |
| 1.鼠胚培养质量评估 |
| 2.CsA对小鼠胚胎滋养细胞伸展面积的影响 |
| 3.CsA对滋养细胞顶端微泡的影响 |
| 4.CsA对小鼠胚胎滋养细胞相关因子的表达的影响 |
| 4.1 CsA对小鼠胚胎滋养细胞LIF、FGF、VIM的mRNA转录的影响 |
| 4.2 LIF、FGF、VIM在胚胎滋养细胞的表达位置及相对表达量 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 综述 围着床期母胎间的交流对话及其分子机制 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（10）MicroRNA-300通过靶向骨膜蛋白参与成釉细胞瘤骨质破坏的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:miRNA-300、Periostin在临床成釉细胞瘤组织中的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 组织标本 |
| 2.1.2 芯片 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 实验设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 miRNA芯片分析 |
| 2.2.2 茎环实时定量PCR方法 |
| 2.2.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法 |
| 2.2.4 Western Blot方法 |
| 2.2.5 免疫组织化学染色SP法 |
| 2.3 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 miRNA芯片结果分析 |
| 3.2 qRT-PCR检测miR-300、Periostin的表达 |
| 3.3 Western blot检测Periostin的表达 |
| 3.4 免疫组化检测Periostin的表达 |
| 4 讨论 |
| 第二部分:miR-300、Periostin对成釉细胞瘤细胞生物学特性的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 所用细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养、传代、冻存、复苏 |
| 2.2.2 miR-300 mimics、miR-300 inhibitor的设计和合成 |
| 2.2.3 Periostin si RNA的设计和合成 |
| 2.2.4 脂质体转染法转染 |
| 2.2.5 MTS法 |
| 2.2.6 平板克隆形成实验 |
| 2.2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.2.8 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 2.2.9 Transwell侵袭实验 |
| 2.2.10 双荧光素酶活性检测 |
| 2.3 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 miR-300对AM-1细胞功能的影响 |
| 3.1.1 miR-300 mimics、inhibitor转染效率的检测 |
| 3.1.2 miR-300对AM-1细胞增殖的影响 |
| 3.1.3 miR-300对AM-1细胞凋亡的影响 |
| 3.1.4 miR-300对AM-1细胞周期的影响 |
| 3.1.5 miR-300对AM-1细胞侵袭的影响 |
| 3.2 miR-300靶向调控Periostin的研究 |
| 3.2.1 miR-300与Periostin靶向关系生物学信息预测 |
| 3.2.2 过表达miR-300对AM-1细胞表达Periostin的影响 |
| 3.2.3 抑制miR-300对AM-1细胞表达Periostin的影响 |
| 3.2.4 双荧光素酶活性检测实验验证miR-300与Periostin 3'UTR结合情况 |
| 3.3 Periostin对AM-1细胞功能的影响 |
| 3.3.1 Periostin转染效率的检测 |
| 3.3.2 si-Periostin对AM-1细胞增殖的影响 |
| 3.3.3 si-Periostin对AM-1细胞凋亡的影响 |
| 3.3.4 si-Periostin对AM-1细胞周期的影响 |
| 3.3.5 si-Periostin对AM-1细胞侵袭的影响 |
| 4 讨论 |
| 第三部分:miR-300调控Periostin参与成釉细胞瘤骨质破坏的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 所用细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.3 实时定量PCR |
| 2.2.4 Western-blot |
| 2.3 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 miR-300 在各组细胞中的表达 |
| 3.2 OPG、Rankl、C-fos在各组细胞中的表达 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、E-钙黏蛋白在出生后小鼠牙齿发育中的表达和意义（论文参考文献）
- [1]ZO-1/2在猪卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的表达与功能研究[D]. 曹丽华. 广西大学, 2021(01)
- [2]Arl13b调控VEGFR2信号促进神经胶质细胞瘤生长的分子机制[D]. 谢新生. 南昌大学, 2021(01)
- [3]FAM20家族蛋白调控小鼠关节软骨发育过程的机制研究[D]. 冉春枭. 大连医科大学, 2021(01)
- [4]多囊卵巢综合征对于围着床期子宫中免疫细胞及细胞外基质的影响[D]. 吴洋. 兰州大学, 2021(09)
- [5]Tβ4基因定点整合绒山羊的检测及该基因对绒毛生长促进作用的机制研究[D]. 李晓聪. 内蒙古大学, 2020(01)
- [6]TGF-β2通过自噬调控EMT在后发性白内障中的作用及其机制研究[D]. 崔艺蕾. 浙江大学, 2020(02)
- [7]MarvelD1对小鼠小肠上皮发育影响及其机制探究[D]. 曹靓钰. 哈尔滨工业大学, 2019(02)
- [8]TGF-β/Smad3信号通路在后发性白内障形成中的作用和机制研究[D]. 孟凡兰. 天津医科大学, 2019(02)
- [9]环孢素A对围着床期胚胎滋养细胞微泡及LIF、FGF相关因子的影响[D]. 李丹. 海南医学院, 2019
- [10]MicroRNA-300通过靶向骨膜蛋白参与成釉细胞瘤骨质破坏的研究[D]. 康媛媛. 中国医科大学, 2019