一、浅析致癌机制及癌的基因治疗（论文文献综述）
方佳成[1]（2021）在《泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用》文中提出癌症已经成为危害人类健康的主要疾病,据世卫组织国际癌症研究机构数据显示,2020年,全球男性和女性将合计出现约1930万和1000万的新发病例和癌症死亡病例,其中的1800万例和930万例将来自实体瘤。然而,对肿瘤治疗的系统评估数据显示,欧洲药物管理局在2009-2013年度批准的大多数抗癌药物未能对患者的整体生命质量产生重大改善。因此,需要继续提高抗肿瘤药物的临床疗效。抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugates,ADC）和嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor,CAR）T细胞疗法是发展迅速的肿瘤靶向治疗技术,它们通过特异性识别在恶性细胞和正常组织细胞之间差异过表达的靶标抗原,达到辨识肿瘤和消融肿瘤的目的。ADC和CAR-T实现安全性与有效性的关键,在于其所识别的靶标抗原是否具备足够的肿瘤特异性。因而,鉴别出理想的靶标抗原至关重要。理想的靶标抗原由恶性细胞特异性表达,然而肿瘤特异性抗原屈指可数。肿瘤相关抗原在肿瘤细胞上表达升高,在正常细胞上限制性表达,这一特性使得它们亦能够作为有效定位恶性肿瘤的靶标分子。目的:以发现理想的肿瘤相关抗原为出发点,着力于打造肿瘤相关抗原发现新平台,构建全面的泛实体瘤肿瘤相关抗原图谱,为癌症研究人员和广泛的科学与医药界科研工作者提供研究便利。方法:1.使用经统一处理的TCGA和GTEx的RNA序列数据,对19种类型实体瘤中的20242个HUGO基因进行差异分析;通过将阈值设置为Benjamini-Hochberg adjusted p值为0.01,log2Fold Change为1.0,保留那些在肿瘤细胞群中显着差异表达的HUGO基因;结合蛋白质亚细胞定位信息,排除不具备胞外结构域的蛋白;使用集成了GTEx,HPA和FANTOM5的m RNA表达信息和HPA和HPM的蛋白质丰度信息的数据集,获取在正常组织中受限表达的蛋白分子;使用公开的Blood Spot平台,发现那些在骨髓Lin-CD34+CD38-CD90+CD45RA-HSCs和Lin-CD34+CD38-CD90-45RA-MPPs中限制性表达的蛋白分子。2.将RNA测序的读段计数数据转换为TPM格式,并将每个基因在其配对适应症和正常组织中的TPM值作为差异表达分析的输入数据。采用非参数Mann-Whitney U检验分析,计算并绘制每个候选靶标分子在特定适应症中的表达相比其在各个人体正常组织中的表达的差异表达谱。3.提取并整理TCGA中泛癌表型数据中的癌组织学分级,病理分级和TNM分期信息;通过挖掘MC3（“多中心多癌种突变识别”）TCGA MAF（“突变注释格式”）数据,确定靶标基因的非沉默体细胞突变（SNP和INDEL）。结合m RNA表达数据,汇编用于评价靶标基因的异质表达模式的综合数据集。4.从TCGA下载并提取靶标基因组变异数据,从Onco KB收集致癌或功能性基因组变异信息,注释并统计靶标基因的变异类型及发生频率,确定在临床上有应用价值的携带特异性驱动变异的功能性靶标。5.通过杂交瘤技术制备CDH17特异性单克隆抗体,进而运用流式细胞术、过表达共定位分析、结合亲和力检测、抗体测序和可变区序列进化关系分析等,多重表征抗体的各项指标。通过偶联mc-Val Cit PABC-MMAE,制备CDH17靶向型ADC。结合体外杀伤实验与细胞内化评估,完成效应分子的初筛验证。6.通过构建KM12SM和COLO205结肠癌细胞系CDX动物模型,综合评估chi2E21-MMAE和chi2F12-MMAE的体内抗肿瘤活性。通过制备和人鼠CDH17蛋白交叉反应的ADC分子,并对给药的荷瘤小鼠的心/肺/肝/肾/结肠/直肠/脾脏进行HE染色,评估CDH17靶向型ADC对小鼠的组织毒性。7.通过慢病毒载体感染CD3+T细胞,制备LYPD3靶向型CAR-T细胞。通过对CAR-T细胞进行分化检测,确定其向效应细胞持续分化的能力。通过体外细胞杀伤实验和细胞因子分泌检测,研究LYPD3靶向型CAR-T细胞对肿瘤细胞的的特异性杀伤作用。通过对荷瘤小鼠循环血中的CAR-T细胞进行计数和检测肿瘤组织中的T细胞浸润水平,揭示LYPD3靶向型CAR-T细胞在小鼠体内发挥持久抗肿瘤作用的机制。结果:1.开发专门的算法和汇编整合有泛实体瘤和正常组织的大型转录组、蛋白质组和基因组信息的综合数据集。2.系统地识别肿瘤相关抗原。通过我们的肿瘤相关抗原发现平台,筛选得到75个潜在的肿瘤相关抗原分子。特别是BACE2、CDH17、CELSR1、CELSR2、COL17A1、COL23A1、CRIM1、DSC3、GPR87、LYPD3、MUC17、NOX1、PTPRN2、SCTR、TRPM8、VCAM1等分子值得做进一步的临床前研究。3.基于CDH17蛋白定向开发的ADC分子可以在体内显着消融KM12SM和COLO205异种移植瘤,并对高表达CDH17蛋白的结肠癌病人来源的异种移植瘤表现出一定的肿瘤抑制效果。chi2F12-MMAE在体外对高药敏度的COLO205显示高水平的细胞毒性（IC50=60.9p M）,chi2E21-MMAE和chi1A13-MMAE对COLO205的抑瘤水平相当（IC50:925.8 p M vs.998.3 p M）。两次单药静脉注射（Q2W）chi2E21-MMAE或chi2F12-MMAE,均能以剂量依赖性的方式抑制KM12SM在小鼠体内的生长,但无法完全清除肿瘤。在COLO205 CDX模型中,按同样的给药方式静注chi2F12-MMAE,1.5 mg/kg剂量的第一针治疗可以起到平缓异种移植肿瘤增长的效果,且两周后的第二针治疗亦能继续起到溶瘤效果;3 mg/kg的中剂量治疗组有部分小鼠的肿瘤在后期出现反弹;6 mg/kg的高剂量治疗可以根治异种移植瘤。4.CDH17靶向型ADC在小鼠体内具有相对可控的组织毒性。制备了能和人鼠CDH17蛋白交叉反应的ADC分子677-MMAE,观察到在677-MMAE给药组小鼠的结直肠的局部组织中有炎症反应,聚集了大量的淋巴细胞;但在其它组织中没有出现炎症反应。此外,在观察期内,小鼠对chi2E21-MMAE、chi2F12-MMAE或677-MMAE的体内耐受良好,用药期间未有小鼠死亡个例出现,亦没有观察到10%以上的减重。5.LYPD3靶向型CAR-T细胞能够在小鼠体内对PC9异种移植肿瘤发挥持久的抗肿瘤作用。且小鼠对LYPD3-CAR-T的耐受良好,在观察期内未有小鼠死亡个例出现,亦没有观察到10%以上的减重。进一步调查发现,LYPD3-CAR-T细胞不仅在小鼠外周血中大量存在,还在高响应LYPD3-CAR-T治疗的PC9异种移植瘤组织中大量浸润。此外,LYPD3-CAR-T治疗组的小鼠脾脏内出现大量CD3+T细胞,但在对照组中却没有。CAR-T细胞的记忆表型对于激发持久的免疫应答至关重要。数据显示,LYPD3-CAR-T细胞在输注前,其中的Tn/Tscm细胞和Tcm细胞比例分别高达52.4%和21.7%,具有良好的向效应细胞分化的潜能。结论:通过开发肿瘤相关抗原识别算法和整合来自19种实体瘤和正常组织的大型转录组、蛋白质组和基因组数据,完成了泛实体瘤相关抗原的探索。通过考察CDH17靶向型ADC和LYPD3靶向型CAR-T细胞在模型小鼠中的抗肿瘤活性,例证了CDH17和LYPD3蛋白分别作为ADC和CAR-T靶标开发的可行性。
姜菊玲[2]（2021）在《晚期胰腺癌中医方证特征地域差异及临床研究》文中研究指明研究目的:1.通过检索数据库文献,阐述近现代医家对胰腺癌证型分类的认识,归纳总结晚期胰腺癌常见证型及证素分布规律,分析讨论各医家对晚期胰腺癌病机及其演变规律的认识;2.基于数据挖掘技术回顾性探析不同地域（南方、北方）晚期胰腺癌证候、病机和遣方用药规律,为中医治疗胰腺癌提供重要的数据支撑;3.前瞻性观察分析中西医联合治疗晚期胰腺癌的临床疗效,以期为提高胰腺癌病证辨治的准确率和临床疗效提供参考。研究方法:1.根据检索策略手工检索中文数据库自建库至2020年11月26日符合纳排标准的文献,经整理核对、数据提取和规范后,运用频数及频率分析统计胰腺癌常见中医证候类型,并拆分进行病性、病位证素分析,探讨总结胰腺癌核心病机。2.多中心、回顾性收集2016年1月至2020年11月期间符合纳入条件的晚期胰腺癌患者的一般资料、病史信息及中医四诊资料,建立EpiData数据库进行数据录入,运用 IBM SPSS Statistics 26.0 和 IBM SPSS Modeler 18.0 进行描述统计、Apriori法关联规则分析、因子分析、可视化等,对中医药治疗晚期胰腺癌的核心病机、方药及药物配伍规律进行挖掘探究,提炼不同地域（南方、北方）晚期胰腺癌的核心病机与遣方用药规律。3.采用多中心、前瞻性队列研究设计,收集2019年1月至2020年11月符合纳入条件的Ⅲ-Ⅳ期胰腺癌病例,填写病例报告表,建立EpiData数据库,汇总患者的一般情况资料、病史资料、治疗用药、生存状况、生活质量以及检验检查等信息,根据分组标准划分西医组和中西医联合治疗组,运用SAS 9.4和IBM SPSS Statistics 26.0统计软件包进行分析,评价两组患者的生存状况、生活质量和肿瘤标志物升降趋势。研究结果:1.基于文献的研究结果显示:晚期胰腺癌病位主要在脾、肝,目前临床常见证型为湿热蕴结型、气滞血瘀型、脾虚湿阻型、阴虚内热型、脾虚气滞型,最常见的病性证素为湿、热、气滞、血瘀,脾虚为主的病机观点居多,是胰腺癌发病和治疗的关键。结论:晚期胰腺癌病位主要在脾、肝,核心病位在脾,脾虚是其发病和治疗的关键。晚期胰腺癌病性证素包括湿、热、气滞、血瘀、阴虚、毒、气虚、血虚、阳虚、寒、痰、气逆。其中,湿、热、气滞、气虚与血瘀是胰腺癌主要的病理变化。湿热蕴结型、气滞血瘀型、脾虚湿阻型、阴虚内热型、脾虚气滞型是晚期胰腺癌最常见的复合证型。2.基于256例患者的回顾性临床研究结果显示:晚期胰腺癌病位主要在脾、肝、胃、胆,尤其责之于脾、肝,可涉及肾、肺、心,脾是发病的核心病位。南北方病位均以脾、肝为主,其中,脾、胃为病在南方频次较高,肝、胆、肾、肺为病在北方频次较高。常见病性证素有气滞、气虚、湿、热、痰、血瘀、阳虚、血虚、水停、阴虚、寒,气虚和气滞分别是南北方主要的虚性证素和实性证素,脾虚（脾气虚）与气滞是发病的核心病机,脾虚气滞、脾虚湿阻、脾虚痰凝、湿热蕴结、气滞血瘀证是常见的证型。气滞、气虚病机特点在南方出现频次较高,湿、血瘀、阳虚、寒、夹痰、夹热病机特点在北方出现频次较高。通过药物关联规则分析可以看出晚期胰腺癌最常用方为四君子汤、异功散、六君子汤、香砂六君子汤的加减。通过关联强度绘制核心药物网络图,得到核心处方用药为:白术、茯苓、陈皮、黄芪、半夏、鸡内金、麦芽、白芍、党参。诸药合用,共奏益气健脾、理气消食之效。治法上,南方、北方均注重益气健脾、理气消食,但北方又注重清热利湿、化痰散结、活血化瘀。结论:晚期胰腺癌的核心病位在脾,脾、胃为病多见于南方,肝、胆、肾、肺为病多见于北方;脾虚（脾气虚）与气滞是发病的核心病机,气滞、气虚病机特点多见于南方,北方病机特点在此基础上又表现为湿、血瘀、阳虚、寒、夹痰、夹热;晚期胰腺癌最常用方为四君子汤、异功散、六君子汤、香砂六君子汤的加减,核心处方用药为:白术、茯苓、陈皮、鸡内金、黄芪、半夏、白芍、山药、麦芽;治法上,南方、北方均注重益气健脾、理气消食,但北方又注重清热利湿、化痰散结、活血化瘀;“三因制宜”学说在肿瘤临床辨治中的指导作用及其合理性,填补了晚期胰腺癌方证特征地域差异研究的空白。3.基于138例患者的前瞻性临床研究结果显示:组别是影响胰腺癌生存的独立因素（P<0.05）。相较于西医组,中西医联合治疗可延长晚期胰腺癌患者总生存期（390.00天vs 340.00天,P=0.0485）,组间差异有统计学意义（P<0.05）。分层分析结果显示:中西医联合治疗可延长病理分级为高中分化的患者总生存期（408.00天vs228.00天,P=0.0232）、分期为Ⅳ期的晚期患者总生存期（408.00天vs 308.00天,P=0.0370）、有区域淋巴结转移的患者总生存期（423.00天vs 349.00天,P=0.0297）以及无确诊后治疗史的患者总生存期（390.00天vs255.00天,P=0.0412）,组间差异均有统计学意义（P<0.05）。中西医联合治疗后肿瘤标志物CA50降低,组内差异有统计学意义（P<0.05）。中西医联合治疗组患者神疲乏力、恶心呕吐、疼痛、失眠症状改善优于西医组。中西医联合治疗能够改善患者的情绪功能、认知功能、总健康状况、疲乏、恶心呕吐、疼痛、失眠症状。结论:组别是影响晚期胰腺癌生存期的独立因素,中西医联合治疗可延长晚期胰腺癌患者总生存期;降低晚期胰腺癌肿瘤标志物水平;改善晚期胰腺癌患者神疲乏力、恶心呕吐、疼痛、失眠症状;改善晚期胰腺癌患者的情绪功能、认知功能、总健康状况;验证了中西医联合治疗晚期胰腺癌的临床疗效,为临床提供了扎实可靠的数据支撑。
李海霞[3]（2021）在《hsa-miR-6887-3p/Mex3a轴通过RAP1/MAPK通路对结直肠癌恶性生物学行为的影响》文中研究指明研究背景:结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）的发病率和死亡率已上升至全球恶性肿瘤的第三位,其预后较差,死亡率高。CRC的发生发展涉及多种机制,包括肠道菌群紊乱、遗传、基因突变和肠道炎症等,且其形成与发展过程中伴随着大量的原癌基因激活和抑制基因失活。目前,CRC最有效的治疗方法是以外科手术切除为主,辅以放化疗、分子靶向治疗和免疫治疗等。虽然辅助药物显着改善了晚期CRC患者的预后,但仅对15-25%的患者有疗效。此外,在能够接受外科手术切除的患者中,约有20%的患者术后5年内出现局部或远处复发。因此,寻找与CRC发展相关的致癌基因对进一步改进CRC的治疗、改善CRC患者的预后至关重要。Mex3 RNA结合蛋白家族成员A（Mex3a）最初发现于秀丽隐杆线虫（caenorhabditiselegans,C elegans）中,是一种翻译调节蛋白,有助于维持生殖系统的全能性,在人类中,Mex3家族有四个同源蛋白Mex3a、b、c和d。有研究表明Mex3a在肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、膀胱尿路上皮癌、Wilm’s肿瘤和多形性胶质母细胞瘤中起关键致癌作用。在肠道中,多项研究表明Mex3a主要影响肠道分化、极性和干性,有助于维持肠道稳态。这促使我们研究Mex3a在CRC中的作用和调控机制。微小RNA（microRNA,miRNA）是由19-23个核苷酸组成的短链非编码RNA。miRNAs通过与靶基因mRNA的3’非翻译区（3’-UTR）序列特异性相互作用而抑制靶基因表达,导致mRNA降解和抑制蛋白翻译。大量研究表明miRNAs在肿瘤的分化、侵袭、增殖和凋亡等过程中发挥重要作用。越来越多的miRNAs与CRC发生有关,并被认为是CRC预后和治疗的标记物。例如,miR-214通过调节成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）抑制CRC的生长和肝转移。miR-143、miR-18a*、miR-145均可通过抑制增殖核心信号通路MAP激酶途径的一个关键蛋白RAS的表达而抑制CRC的发生发展。因此,我们拟进一步探究与Mex3a表达相关的miRNA在CRC增殖调控中的作用。本研究首先在人CRC临床样本中检测Mex3a的表达情况,然后通过公共数据库进一步验证了 Mex3a的表达情况,随后,分析其与CRC临床病理参数的关系。接着,通过体、内外功能实验探索Mex3a对CRC细胞增殖、侵袭、迁移等能力的影响,并通过寻找与Mex3a直接结合的miRNA,探究其调控的下游信号通路,为CRC发病机制提供新的视角。研究方法:1.通过免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）发现,相比于癌旁组织,CRC组织中Mex3a蛋白表达水平明显上调,同样Western blot也证实了该蛋白在癌和癌旁中的表达情况,随后使用高通量基因表达数据库（gene expression omnibus,GEO）和癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库再次验证了Mex3a在癌和癌旁组织中的表达情况。根据IHC的打分结果,分析Mex3a的表达与CRC患者临床病理特征的关系。对CRC患者的随访资料整理分析,通过Kaplan-Meier法绘制出Mex3a的表达与CRC患者生存率的关系。2.通过实时定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）及Western blot检测Mex3a在CRC细胞系中的表达,筛选出内源性高、低表达Mex3a的细胞系。选择高表达Mex3a的细胞系SW620和SW480转染Mex3a小干扰。选择Mex3a低表达的细胞系HCT116转染Mex3a过表达质粒。通过5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,EDU）、血管形成、化疗药物敏感性和Transwell实验分别检测Mex3a对CRC细胞增殖能力、血管形成能力、化疗药物敏感性、侵袭和迁移能力的影响。3.采用慢病毒构建稳定敲低Mex3a的SW620和SW480细胞系及稳定过表达Mex3a的HCT116细胞系,将经过嘌呤霉素筛选后的Mex3a稳定敲低及过表达的CRC细胞系及对照细胞系,通过皮下注射接种到裸鼠体内,观察Mex3a对CRC细胞体能成瘤能力的影响。4.通过转录组学测序及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）分析筛选出Mex3a影响CRC发展的下游信号通路:RAP1 GTPase 激活蛋白（RAP1 GTPase activatingprotein,RAP1GAP）/丝裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen activated protein kinase kinase,MEK）/细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase,ERK）/缺氧诱导因子 1 亚单位 α（hypoxia-inducible factor 1 subunit alpha,HIF-1α）,并通过 Western blot 探究了 Mex3a 对RAP1GAP/MEK/ERK/HIF-1α信号通路的影响。采用MEK抑制剂（U0126）检测Mex3a是否通过MEK/ERK/HIF-1α信号通路影响CRC细胞的增殖、侵袭和迁移能力。通过 Western blot 检测使用 U0126 后,RAP 1 GAP/MEK/ERK/HIF-1α 通路活性的变化。5.通过蛋白质免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）检测Mex3a与RAP1 GAP的相互作用。通过对CRC组织及癌旁组织进行IHC染色及打分,探究Mex3a和RAP1GAP在CRC中的表达情况及两者的相关性。利用TCGA数据库进一步验证RAP 1 GAP在CRC组织和癌旁组织中的表达情况,并通过Kaplan-Meier法分析RAP1GAP的表达与CRC患者生存时间的关系。通过Western blot实验证明RAP 1 GAP可以逆转Mex3a对RAP1GAP/MEK/ERK/HIF-1α通路的影响。6.通过 TargetScan（www.targetscan.org）和 miRDB（mirdb.org）预测调控 Mex3a的miRNA,并得到hsa-miR-6887-3p在Mex3a mRNA 3’-UTR上的结合位点及突变位点序列。通过荧光素酶报告基因实验检测hsa-miR-6887-3p对Mex3amRNA 3’-UTR的荧光素酶活性的影响。通过TCGA数据库验证hsa-miR-6887-3p在CRC组织和癌旁组织中的表达情况,并通过Kaplan-Meier法分析hsa-miR-6887-3p的表达与CRC患者生存时间的关系。通过qRT-PCR检测hsa-miR-6887-3p在CRC细胞系中的表达,筛选出内源性低表达hsa-miR-6887-3p和高表达hsa-miR-6887-3p的细胞系。选择高表达hsa-miR-6887-3p的CRC细胞系HCT116转染hsa-miR-6887-3p inhibitor,选择低表达 hsa-miR-6887-3p 的 CRC 细胞系 SW620 转染 hsa-miR-6887-3p mimics,并通过 qRT-PCR 检测 hsa-miR-6887-3p mRNA 表达情况。通过 qRT-PCR 及 Western blot 检测 hsa-miR-6887-3p 对 Mex3a mRNA 及蛋白表达水平的影响。7.通过Western blot检测在SW620细胞系中转染Mex3a小干扰、过表达hsa-miR-6887-3p及Mex3a后,对SW620细胞株中Mex3a表达的影响。通过功能性回复实验探究了 hsa-miR-6887-3p对CRC细胞体外增殖和侵袭能力的影响。8.采用慢病毒构建稳定过表达hsa-miR-6887-3p的SW620细胞系,将经过嘌呤霉素筛选后的稳定过表达hsa-miR-6887-3p的CRC细胞系及对照细胞系,通过皮下注射接种到裸鼠体内,观察hsa-miR-6887-3p在体内条件下对CRC细胞裸鼠皮下成瘤能力的影响。结果:1.Mex3a在CRC组织中高表达且与临床不良预后相关通过IHC染色分析101例CRC组织和79个正常癌旁组织中Mex3a的蛋白表达水平,结果显示CRC组织中Mex3a高表达,而在癌旁组织中Mex3a几乎不表达。通过Western blot检测Mex3a的蛋白表达情况,发现Mex3a在CRC组织中的蛋白表达水平高于邻近癌旁组织。通过GEO（GSE39582数据集）和TCGA数据库发现在CRC组织中Mex3amRNA的表达明显高于癌旁组织。根据101例CRC患者的随访资料进行临床病理参数相关性分析显示,在CRC组织中,Mex3a的高表达与T分期（P=0.025）、病理分级（P=0.035）及患者的存活状态（P=0.012）等临床病理参数呈正相关,而与年龄（P=0.134）、性别（P=0.392）、N分期（P=0.919）、M分期（P=1）及TNM等级（P=0.325）无明显相关性。Kaplan-Meier生存分析发现,在101例CRC患者中,与Mex3a低表达组相比,高表达Mex3a患者组总生存率（OS）明显降低（P=0.003）。其次,对GSE39582数据集进行生存分析也发现,与Mex3a低表达患者相比,高表达Mex3a的CRC患者组OS明显缩短（P=0.022）,无复发存活率（RFS）也明显降低（P=0.048）。2.Mex3a促进CRC细胞的致瘤特性qRT-PCR 及 Western blot 结果显示 Mex3a 在 CRC 细胞系 SW620 和 SW480中表达相对较高,在HCT116细胞系中表达相对较低。Western blot结果显示,与对照组相比,转染Mex3a小干扰（Mex3asiRNA）和过表达质粒（Mex3a-flag）组与对照组相比,分别能够有效降低和增加Mex3a在CRC细胞中的表达。EDU实验表明,干扰Mex3a表达后CRC细胞增殖能力明显减弱,而过表达Mex3a后,CRC细胞的增殖能力则显着增强。血管形成实验表明,干扰Mex3a表达后CRC细胞促进血管形成能力明显减弱,而过表达Mex3a后,CRC细胞促进血管形成能力增强。Tanswell结果表明,干扰Mex3a表达可抑制CRC细胞的侵袭和迁移能力,而过表达Mex3a则显着促进CRC细胞的侵袭和迁移能力。化疗药物敏感性实验显示,干扰Mex3a后CRC细胞抗化疗药物能力明显减弱,而过表达Mex3a后,CRC细胞抗化疗药物能力增强。3.Mex3a促进CRC细胞体内成瘤能力首先构建Mex3a稳定敲低（Mex3aKD）和对照（Control KD）CRC细胞株,Mex3a稳定过表达（OEMex3a）和对照（OEControl）CRC细胞株。并用稳定转染的细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型,结果显示Mex3a KD种植细胞组,肿瘤体积和瘤重显着小于对照细胞组。Ki-67染色显示,Mex3a KD种植细胞组,Ki-67阳性细胞数显着少于对照细胞组,表明敲低Mex3a后肿瘤细胞的增殖能力显着降低。而OEMex3a种植细胞组肿瘤体积、瘤重及Ki-67染色则有相反的结果。4.Mex3a为CRC细胞中RAP1GAP/MEK/ERK/HIF-1α信号通路的激活因子通过对稳定转染的SW480 Mex3a KD及SW480 Control KD CRC细胞株进行转录组学测序来寻找Mex3a的下游靶基因和相关信号通路,结果显示敲低Mex3a引起MAPK和Rap1在内的众多信号通路发生改变。考虑到参与该通路的差异表达基因,我们推测Mex3a可能通过RAP1GAP/MEK/ERK/HIF-lα通路影响CRC表型。Western blot结果显示,与对照组相比,在SW620和SW480细胞系中敲低Mex3a后,RAP1GAP蛋白表达水平显着升高,p-MEK1/2、p-ERK1/2及HIF-1α蛋白表达水平显着降低。功能性回复实验显示,MEK抑制剂U0126可以逆转Mex3a对CRC细胞的增殖、侵袭和迁移能力的促进作用。Western blot结果显示,U0126可逆转Mex3a对RAP1GAP/MEK/ERK/HIF-1α通路活性的影响。5.RAP1GAP是CRC细胞中Mex3a的下游靶基因Co-IP检测发现,CRC细胞中Mex3a可与RAP1GAP相互作用。对100例CRC组织和6例癌旁组织进行IHC染色,分析Mex3a及RAP1GAP的蛋白表达情况,结果显示在CRC组织中Mex3a高表达,而RAP1GAP则在CRC组织中低表达,且RAP1GAP与Mex3a的表达负相关。Western blot结果显示,RAP1GAP可逆转Mex3a对RAP1GAP/MEK/ERK/HIF-1α通路活性的影响。通过TCGA数据库发现,CRC组织中RAP1GAP mRNA的表达水平明显低于癌旁组织,且Kaplan-Meier生存曲线分析显示,与高表达RAP1GAP的CRC患者组相比,RAP1GAP低表达的CRC患者组OS明显缩短（P=0.032）。6.hsa-miR-6887-3p是CRC细胞中Mex3a的上游靶点通过TargetScan和miRDB预测调控Mex3a的miRNA,并得到其在Mex3a mRNA3’-UTR上的结合位点及突变位点序列,荧光素酶报告基因实验显示过表达 hsa-miR-6887-3p 能够显着减弱 Mex3a mRNA 非突变端 3’-UTR（3’-UTR WT）的荧光素酶活性。通过Starbase（starbase.sysu.edu.cn）分析发现,与肿瘤周围正常组织相比,hsa-miR-6887-3p在CRC组织中低表达。且Kaplan-Meier生存分析结果显示,与高表达hsa-miR-6887-3p患者组相比,hsa-miR-6887-3p低表达组患者生存时间明显缩短（P=0.047）。qRT-PCR检测发现hsa-miR-6887-3p在SW620中相对低表达,在HCT116细胞系中相对高表达。qRT-PCR结果显示,与对照组相比,转染hsa-miR-6887-3p mimics组和hsa-miR-6887-3p inhibitor分别能够有效地增加和降低CRC细胞中hsa-miR-6887-3p 的表达。qRT-PCR及 Westernblot 检测结果显示,hsa-miR-6887-3p能够调控CRC细胞中Mex3a的mRNA及蛋白表达水平。7.hsa-miR-6887-3p通过抑制Mex3a的表达而抑制CRC细胞的致瘤特性Western blot 结果显示,过表达 Mex3a 可以逆转 hsa-miR-6887-3p 对 Mex3a的抑制作用。EDU和基质胶Transwell检测结果表明,过表达hsa-miR-6887-3p组与干扰Mex3a表达组均可抑制CRC细胞的增殖和侵袭,且同时过表达Mex3a和hsa-miR-6887-3p组可以逆转过表达hsa-miR-6887-3p对CRC细胞的增殖和侵袭能力的抑制作用。在HCT116细胞中进行的反向验证也证明了以上结论。8.hsa-miR-6887-3p抑制CRC细胞的体内成瘤能力构建 hsa-miR-6887-3p 稳定过表达（LV-miR-6887-3p）组和对照（LV-miR-NC）组CRC细胞株,并用稳定转染的CRC细胞株构建裸鼠皮下移植瘤模型,结果显示LV-miR-6887-3p种植细胞组,肿瘤体积和瘤重均小于对照细胞组。Ki-67染色显示,与对照组相比,LV-miR-6887-3p种植细胞组肿瘤细胞的增殖能力显着减弱。结论:1.Mex3a在CRC中表达量增高且与临床不良预后相关。2.体内、外实验表明Mex3a提高CRC细胞的恶性生物学行为。3.RAP1 GAP是Mex3a的下游靶分子,可逆转Mex3a对MEK/ERK/HIF-1 α信号通路活性的影响。4.hsa-miR-6887-3p通过调控Mex3a的表达,抑制CRC细胞的生物学行为。
石怡[4]（2021）在《PTEN相关ceRNA网络的构建及肝癌发病机制的初步研究》文中认为肝细胞癌（HCC）的恶性程度高,发病率高且存活率低,是全球范围内与癌症相关的死亡的主要原因之一。但是,肝癌发生的背后机制尚不是非常清楚。大量研究表明竞争性内源RNA（ceRNA）调控网络在许多人类癌症的多种生物学过程中发挥关键作用。因此筛选ceRNA调控网络并研究其作用机制,对HCC的诊断和预后具有重要意义。在本研究中,利用生物信息学筛选出与磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）相关的ceRNA调控网络。通过相关性分析、Cox回归分析鉴定出HCC临床预后模型,并且利用免疫组化实验进行验证。运用甲基化分析和免疫浸润分析探讨预后模型在肝癌的发生和发展过程中的分子机制,为肝癌发生机制研究提供了新的方向和策略。具体研究内容如下:1.从TCGA数据库获得mRNA,lncRNA和miRNA的表达谱。总共在HCC样品和邻近的正常样品中筛选出3371个DElncRNA,422个DEmiRNA和8294个DEmRNA,而在PTENhigh和PTENlow表达的HCC样品之间鉴定出860个DElncRNA,54个DEmiRNA和1871个DEmRNA。然后,通过计算机分析将总共5个DElncRNA,4个DEmiRNA和372个DEmRNA纳入InRNA-miRNA-mRNA三重调控网络。此外,利用Cytoscape插件cytohubba,基于得分>2,筛选出三重调控网络中的十三个关键RNA。最后,通过生物信息学分析获得了与肝癌预后有关的DLEU2L-hsa-miR-100-5p/hsa-miR-99a-5p-TAOK1过度表达的ceRNA网络。2.通过相关性分析在ceRNA调控网络中鉴定了DLEU2L/TAOK1轴,并且利用Cox回归分析表明DLEU2L/TAOK1轴可能是肝癌临床应用中潜在的预后模型。运用GEO数据库和免疫组化实验对预后模型DLEU2L/TAOK1轴中的TAOK1进一步数据分析和实验验证,结果发现相比于正常组织,TAOK1在肝癌组织中高表达,与前面分析结果一致。3.甲基化分析表明DLEU2L/TAOK1轴异常上调可能是由于甲基化不足引起的。免疫浸润分析表明,DLEU2L/TAOK1轴可能对肿瘤免疫微环境的变化和肝癌的发展有影响。当前的研究构建了基于ceRNA的DLEU2L/TAOK1轴,可能是与HCC诊断和预后相关的新型重要预后因素。
蔡启轩[5]（2021）在《长链非编码RNA LINC01614通过miR-520a-3p/SNX3调控轴促进骨肉瘤进展的分子机制》文中提出骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发恶性骨肿瘤,侵袭性强且易早期转移,以至于患者病程快、预后差,往往造成致命的威胁。尽管近些年肿瘤的治疗手段有了长足的提升,但因骨肉瘤复杂的致病机制难以被攻破,治疗效果很难实现突破性的进展。因此深入探究骨肉瘤致病的分子机制,寻找骨肉瘤中关键的功能分子对骨肉瘤的早期诊断及有效治疗具有极其重要的意义。长链非编码RNA（Lnc RNAs）是构成非蛋白质编码RNA的一类大分子。Lnc RNAs可以通过与不同分子的相互作用,参与多种细胞生物过程（信号、诱饵、引导、支架）。另外lnc RNAs不仅在调节一些正常的生理过程中发挥作用,还参与调控肿瘤的发生、发展及远处转移等,一些lnc RNAs已被证实可以作为生物标志物（预后指标、治疗靶点）,甚至可以调节患者对化疗药物的敏感性。目前已经证明了lnc RNAs在骨肉瘤的发生发展中起到重要的调控功能,因此,继续探寻尚未“解锁”的lnc RNAs,系统多维地探究lnc RNAs在骨肉瘤中扮演的角色,筛选具有关键作用的lnc RNAs,深入挖掘其在骨肉瘤中具体的调控作用,不仅有助于发现骨肉瘤相关的致病机制,还可以为骨肉瘤的精准治疗提供理论基础,为医疗的发展做出贡献。本研究中通过对骨肉瘤癌及癌旁组织样本进行全转录组测序分析,检测差异表达的lnc RNAs、miRNAs及m RNAs分子表达谱数据,运用计算生物学研究方法,获取三种差异基因之间的分子调控网络数据,通过GO功能注释及KEGG代谢通路分析,对差异lnc RNAs/miRNAs/m RNAs共调控网络的靶基因及筛选出的核心lnc RNAs的靶基因进行功能分析,并通过细胞学及组织学对LINC01614（核心lnc RNAs）进行验证。验证无误后,对其调控骨肉瘤的生物学功能（增殖、迁移、侵袭、凋亡等）进行实验探究,结合LINC01614/miR-520a-3p/SNX3三者之间的调控关系,进一步对该调控轴进行验证并确定其在骨肉瘤中的调控功能,从而明确LINC01614可以通过miR-520a-3p/SNX3调控轴促进骨肉瘤进展的机制。第一部分骨肉瘤中以lnc RNAs为核心的调控网络构建及关键基因的筛选我们利用三组骨肉瘤癌及癌旁组织样本进行全转录组测序以获取其分子表达谱数据,通过对比分析共筛选得到163个差异表达lnc RNAs（67个上调表达,96个下调表达）,207个差异表达miRNAs（92个上调表达,115个下调表达）及4247个差异表达m RNAs（2019个上调表达,2228个下调表达）。综合应用LNCipedia、DAVID、STRING等多种数据库,结合生物信息统计学分析方法,获取lnc RNAs/miRNAs/m RNAs共调控网络关系并对差异表达lnc RANs的靶基因进行功能分析,发现骨肉瘤中差异表达lnc RNAs可能具有调控骨细胞分化、蛋白结合和生物大分子合成的功能,并可能参与了PI3K-Akt、AMPK等与肿瘤发生发展密切相关的代谢通路。另外我们通过差异表达显着情况选取了LINC01614、MALAT1两种lnc RNAs,分别构建了以两者为核心的lnc RNAs/miRNAs/m RNAs调控网络,并对调控网络中的靶基因进行了功能分析及蛋白互作网络分析,发现LINC01614的靶基因可能参与调控Wnt信号通路、细胞迁移等致癌生物学过程;MALAT1的靶基因可能参与了调控成骨分化、蛋白质转运等生物学过程。我们进一步利用骨肉瘤细胞和正常成骨细胞及骨肉瘤癌和癌旁组织标本对选取的这两种lnc RNAs的表达情况进行了q RT-PCR检测,发现两者在多种骨肉瘤细胞及骨肉瘤癌组织中均呈现高表达,这与我们之前生信分析的结果一致,同时也为我们进一步深入挖掘lnc RNAs在骨肉瘤中的调控功能及相关分子机制提供了方向。第二部分LINC01614在骨肉瘤中的调控功能研究通过第一部分的分析及验证,我们选取了LINC01614为本研究的突破口,旨在探究其在骨肉瘤中的相关调控功能。首先我们利用从“TARGET”数据库获得的骨肉瘤患者的临床数据进行了生存分析研究,发现LINC01614与患者生存率呈负相关,且与骨肉瘤病理分期呈正相关,提示了LINC01614可能在骨肉瘤的发生发展中起到不利作用。接下来体外实验,通过CCK-8实验检测细胞增殖情况,结果提示沉默LINC01614可以明显抑制骨肉瘤细胞的增殖能力;通过transwell细胞侵袭实验和细胞划痕实验检测细胞侵袭及迁移能力,发现沉默LINC01614可以抑制骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力;通过Western Blot检测沉默LINC01614骨肉瘤细胞内的PCNA、caspase-3以及E-cadherin的蛋白表达情况,再次验证沉默LINC01614可抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭及迁移能力,并提示LINC01614可能与骨肉瘤细胞凋亡有关;通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况,发现沉默LINC01614可以促进骨肉瘤细胞的凋亡。体内实验中,通过小鼠移植瘤实验,发现沉默LINC01614可以有效降低骨肉瘤在体内的成瘤速度及体积。总而言之,体内与体外实验均可证明LINC01614具有促进骨肉瘤进展的作用。第三部分LINC01614调控骨肉瘤发生发展的分子机制研究通过对第一部分中LINC01614调控网络的分析,结合第二部分LINC01614在骨肉瘤中的调控作用,我们提出了LINC01614可能通过miR-520a-3p/SNX3调控轴来促进骨肉瘤进展的假设。接下来,我们通过q RT-PCR及Western Blot等实验对三者结合关系进行了验证;并应用生物信息学数据库预测miR-520a-3p与LINC01614以及miR-520a-3p与SNX3的结合位点,再通过荧光素酶报告基因实验对结合位点进行了验证;在此基础上,我们又补充了Ago2 RIP实验进一步验证三者结合方式,结果提示LINC01614可通过竞争性结合miR-520a-3p来调控SNX3的表达。而后通过对沉默和过表达miR-520a-3p、沉默SNX3以及各自空白对照的骨肉瘤细胞进行CCK8细胞增殖实验、transwell细胞侵袭实验、细胞划痕实验以及流式细胞凋亡实验,实验结果提示miR-520a-3p、SNX3可影响骨肉瘤细胞的增殖、侵袭、迁移及凋亡过程;再通过对共转染miR-520a-3pinhibitor+sh RNA-NC、miR-520a-3p-inhibitor+sh RNA-LINC01614及miR-520a-3pinhibitor+sh RNA-SNX3等多组细胞进行CCK8细胞增殖实验、transwell细胞侵袭实验、细胞划痕实验以及流式细胞凋亡实验,发现LINC01614及SNX3均可影响miR-520a-3p对骨肉瘤细胞功能的调控作用,结果提示LINC01614可通过竞争性结合miR-520a-3p来调控SNX3的表达,从而对骨肉瘤的发生发展起到一定的调控作用。最后,我们通过Western Blot检测沉默LINC01614、沉默SNX3、沉默及过表达miR-520a-3p骨肉瘤细胞内的β-catenin及Wnt1蛋白表达情况,结果提示LINC01614/miR-520a-3p/SNX3调控骨肉瘤的生物功能有可能与其参与调控Wnt信号通路相关,这也为今后的研究提供了一定思路。
叶美洁[6]（2021）在《LncRNA H19在香烟烟雾暴露促食管鳞状细胞癌发生发展的作用及机制研究》文中提出背景及目的:食管癌是人类最为常见的消化道恶性肿瘤之一。近年来,食管癌在临床治疗方面有了较大的进展,但其五年生存率仍然较低,预后较差。虽然吸烟已经被证明可促使食管癌的发生,但香烟烟雾如何诱导细胞发生恶性转化,其涉及的机制尚未明确。本课题通过构建细胞模型,初步探索香烟烟雾致食管癌发生的分子机制,为食管癌防治以及精准治疗提供科学的理论依据。材料和方法:（1）香烟烟雾慢性暴露细胞模型的建立:制备香烟烟雾提取物（CSE）后,采用CCK-8实验检测CSE急性染毒对SHEE细胞的毒性剂量,确定CSE慢性染毒的浓度,构建不同代数CSE慢性染毒SHEE细胞模型。对处理30代的SHEE细胞（P30-CSE和P30-DMSO）进行平板克隆形成实验、裸鼠皮下成瘤实验、transwell实验检测细胞恶性转化程度,并用RT-q PCR检测上皮-间质转化（EMT）相关m RNA的表达水平。（2）高通量芯片筛选相关lncRNAs:提取P30-CSE和P30-DMSO细胞株RNA,利用Human LncRNA Expression Microarray V4.0检测lncRNA的水平改变,结合生物信息学分析筛选出差异表达的lncRNA,采用RT-q PCR实验在不同代数染毒的细胞和患者组织中进行验证。（3）分析lncRNA H19与患者临床病理特征的联系:通过非参数检验分析H19的相对表达水平与患者临床病理特征的关系,用Spearman相关分析探讨H19的相对表达水平与患者肿瘤大小的相关性。（4）分析H19启动子区的DNA甲基化改变:通过焦磷酸测序技术检测慢性染毒细胞和患者组织的H19 CTCF6甲基化水平,并通过Spearman相关分析探讨H19表达水平与H19 CTCF6甲基化水平的相关性,t检验分析其甲基化水平与患者临床病理特征的关系。结果:（1）通过SHEE细胞急性染毒确定慢性染毒浓度为15mg/m L。相比于对照组（P30-DMSO）,染毒组（P30-CSE）的成瘤能力显着提高,细胞恶性程度增加,表明CSE慢性暴露的体外细胞模型已成功构建。（2）高通量芯片检测结果发现,相对于正常成瘤细胞,香烟烟雾慢性暴露可引起不同的表达谱改变,并筛选出一批差异表达lncRNAs。进一步筛选和验证发现,在不同染毒代数（10、20、30、40代）细胞中,H19在CSE慢性暴露过程中表达水平逐渐升高,而LINC02582、LINC01133表达逐渐下降,LINC00342表达水平改变无明显趋势。（3）在食管鳞癌患者的组织样本中,在吸烟者中,H19在癌组织中的表达明显高于正常组织（P=0.003）,而在非吸烟患者中无明显变化（P=0.395）,这两组人群的相对表达改变水平有统计学差异（P=0.015）。其他三个lncRNAs（LINC02582、LINC01133和LINC00342）则无明显差别。在进一步分析中,我们发现,在吸烟者中,H19的相对表达水平在较高的TNM分期（III-IV期）患者中表达较高（P=0.045）;在吸烟者中H19的相对表达水平与肿瘤大小呈正相关（rs=0.373,P=0.039）,而非吸烟者则无相应趋势（P=0.212）。（4）在香烟烟雾慢性暴露细胞模型中,可以发现H19启动子区CTCF6结合位点的DNA甲基化水平下降,但未能观察到吸烟者与非吸烟者的食管癌患者组织甲基化水平的改变,且DNA甲基化水平与患者临床病理特征无显着相关。结论:香烟烟雾慢性暴露能够促使食管上皮细胞的恶性转化能力显着增强。香烟烟雾慢性暴露的食管成瘤细胞与自然成瘤细胞有显着不同的基因表达谱。LncRNA H19可能参与了香烟烟雾慢性暴露促食管鳞状细胞癌的成瘤作用,但H19的表达不受DNA甲基化的调控。
梁至[7]（2021）在《海洋候选药物PA/GPA抗肾癌机制和早期ADMET研究》文中研究说明肾细胞癌（renal cell carcinoma,RCC）组织中高水平的活性氧（ROS）使其对传统的放疗和化疗药物均不敏感,迫切需要寻找针对新靶点、具有新结构的肾癌治疗药物。海洋微生物天然产物是新颖药源分子的重要来源,本论文从海洋天然产物中筛选抗肾癌新药,并遵从新药研发“Fail early,Fail cheap”这一原则,将ADMET研究引入药物研发过程,对药物进行早期成药性评价,形成一个从海洋候选药物抗肾癌新靶标筛选、新机制研究到成药性评价的完整研究体系。抗肾癌新靶标筛选:本课题组与合作者从两株海洋放线菌中发现了 33个粉蝶霉素类（Piericidins）候选化合物,包括21个新结构化合物,其中PA三糖糖苷是首次报道。PA及其单糖苷GPA作为产量最大的粉蝶霉素类（PAs）化合物,对ACHN肾癌细胞的IC50分别达0.4 μM和0.2μM,抗肾癌活性显着优于索拉菲尼（P<0.001）。因此,挖掘PA/GPA抗肾癌新靶点是开发PAs抗肾癌候选药物的首要任务。本研究首先利用蛋白配体垂钓技术发现ACHN细胞中过氧化物氧化还原酶蛋白1（PRDX1）与PA有直接相互作用。PRDX1在体内主要发挥清除ROS从而维持机体稳态的功能;当胞内ROS水平异常升高或PRDX1蛋白浓度增加时,PRDX1形成二聚体或十聚体,作为功能调节蛋白调控NF-κB等蛋白的活性,或发挥分子伴侣作用,同时失去氧化还原酶活性。据文献报道,PRDX1在不同肿瘤组织中的高表达促进肿瘤的发生发展,而与大部分实体瘤相反,PRDX1在肾癌组织中低表达,因此阐明PRDX1与ROS的关系对挖掘PA/GPA抗肾癌新机制至关重要。抗肾癌新机制研究:利用临床人肾细胞癌样本,联合2个队列的肾细胞癌与癌旁组织转录组数据证实PRDX1在肾癌组织中低表达（P<0.0001）。PA对ACHN细胞转录组数据分析发现PA能上调PRDX1的表达。对此我们设计并构建了 PRDX1敲低ACHN稳转细胞株用于考察上调的PRDX1对ROS水平的影响。实验结果表明,PA/GPA能显着下调ACHN细胞内ROS水平,当PRDX1蛋白表达被抑制后,PA/GPA下调ROS的作用消失。由此,我们确认PRDX1是PA/GPA的作用靶标。作为一类多功能蛋白,PRDX1的酶活性和蛋白调节功能在维持机体稳态中起关键作用。我们检测了 PRDX1蛋白Tyr194磷酸化,发现PA/GPA能抑制蛋白磷酸化,使PRDX1总蛋白水平增加。为了进一步探讨PRDX1蛋白浓度的升高是否影响其过氧化物酶活性,我们检测了PRDX1的总体酶活性,发现500 nM PA/GPA处理后PRDX1酶活性分别提高至1.36倍和1.60倍（P<0.01）。利用表面等离子共振技术（SPR）发现PA/GPA与PRDX1蛋白可直接结合,这可能是抑制Tyr194磷酸化保持过氧化物酶活性的原因。此外,细胞共定位技术发现PA/GPA能促使PRDX1入核,抑制NF-κB的表达,发挥功能调节蛋白的作用。由此,我们证明了 PA/GPA抗肾癌新机制与靶向PRDX1增强其ROS清除能力相关,这一新机制的发现为抗肾癌天然产物的研发提供了新的研究思路。ADME/T成药性评价:为了进一步证实PA/GPA的抗肾癌效果,我们构建了 ACHN细胞荷瘤裸鼠,在PA/GPA给药三周后,肿瘤体积明显下降,分别减少至50%（P<0.01）和41%（P<0.001）,同时伴随着肝毒性的发生。因此,我们继续通过ADME/T研究挖掘PA/GPA肝毒性靶点,探讨PAs化合物的毒效关系。结合PA对ACHN细胞的定量蛋白质组和转录组数据分析发现,PA对胆汁分泌通路具有显着影响。SPR研究发现PA直接结合肝脏核受体LXRα,调控CYP7A1和LDLR,增加胆固醇吸收并抑制其代谢,加剧肝脏胆固醇堆积,引起肝细胞的线粒体毒性导致细胞凋亡。PA/GPA的药动学结果表明PA可聚集在肝脏产生肝毒性（肝脏药物浓度达血浆29倍）,而GPA在肝脏内转化为PA（转化率高达29.6%）。我们将5个PA类苷元和12个糖苷PA类似物与LXRα做SPR和分子对接实验,发现糖基的存在阻碍化合物与LXRα蛋白结合。这极大可能是GPA无LXRα结合活性,但在肝脏转化为苷元产生肝损伤的重要原因。同时,我们利用人肝微粒体酶和重组人CYP/UGT纯酶孵育体系证实PA主要发生Ⅱ相代谢,UGT1A7、1A8、1A9和1A10是其主要代谢酶（代谢率均>40%）。综上,本研究联合多组学技术,基于药物ADMET特性阐明了粉蝶霉素类候选化合物的抗肾癌新机制和药物毒效关系,证实GPA 比 PA具有更优的成药性,为寻找成药性更好的抗肾癌候选药物奠定了基础。我们立足于本论文的研究结果,通过对PA类候选化合物进行结构优化,以期提高PA类候选化合物的肾癌靶向性和生物利用度,同时显着降低肝毒性,进一步推动我国具有自主知识产权的抗肾癌原创靶向药物的研发。
叶善平[8]（2021）在《miR-557通过靶向RAB10调控Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌进展的机制研究》文中研究表明背景:肝癌是国内外严重威胁人类健康的主要癌症之一,其发病率和死亡率在全球所有恶性肿瘤中排第六和第四,其中肝细胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）占原发性肝癌的75%-85%,世界范围内每年可致75万患者死亡。HCC的发病率具有较大的地域异质性,大约有85%的HCC发生在发展中国家和欠发达地区,而其中有50%发生在中国。早期肝癌预后较好,但多数患者在首诊时已处于进展期,而这部分患者的发病率和死亡率比值接近100%。尽管近些年来HCC的治疗取得了一定的进展,但高复发率和高转移率使其预后仍不理想。因此,研究HCC的诱发因素及影响HCC侵袭和转移的过程,进而寻找肝癌的预后生物标记物及潜在治疗靶标是当下重要研究领域。MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性的,短而高度保守,长度约为18-25个核苷酸的小RNA,呈单链状,不能编码蛋白质,在有核生物中表达较广。miRNA在体内主要起调控作用,通过与m RNA的3’端非编码序列发生碱基配对而起抑制作用,从而实现在转录后阶段调控基因表达。自从第一个miRNA被报道以后,陆续发现并研究了许多miRNA,但对于理解肿瘤发生发展的机制仍是冰山一角。许多研究表明miRNAs与HCC的起病、侵袭、转移及预后关系紧密。其中部分miRNAs在HCC中高表达,起着癌基因的作用,部分miRNAs在HCC中低表达,起着抑癌基因的作用。miR-557是近年来新发现的miRNA,它在胰腺癌、三阴乳腺癌、肺癌中均呈低表达,作为肿瘤抑制基因参与肿瘤侵袭、转移等多种生物学过程的调控。而miR-557在肝癌中的生物学功能尚不清楚。我们首先通过生物学信息学发现miR-557在肝癌中低表达。因此,我们推测miR-557在肝癌的起病和进展中存在重要影响,其在肝癌中的功能和分子机制有待深入探索。据此,本课题首先检测了miR-557在肝癌组织及不同肝癌细胞中的表达水平,分析其与HCC患者临床病理参数及生存的关系;然后运用体内体外实验研究了miR-557对肝癌细胞株生物学行为的影响;再通过生物信息学预测并在实验中验证了miR-557通过靶向抑制RAB10的表达而影响肝癌细胞增殖、体内成瘤、迁移、侵袭、上皮间充质转化（Epithelial mesenchymal transition,EMT）、克隆形成的能力和影响细胞周期的分布;Wnt/β-catenin信号通路是HCC起病发展中极为重要的一条途径,研究表明许多miRNA影响HCC进展是通过Wnt/β-catenin信号途径实现的,最后我们初步探讨了miR-557能否调控Wnt/β-catenin信号途径。本研究具体包括以下三部分:第一部分:miR-557在HCC中的表达及其与患者临床病理特征及预后关系;第二部分:探讨miR-557对肝癌细胞体内外生物学行为的影响;第三部分:miR-557通过靶向RAB10抑制Wnt/β-catenin信号的研究。第一部分:miR-557在HCC中的表达及其与患者临床病理特征及预后关系目的:探讨miR-557在肝癌中的表达水平及其与患者临床病理特征及预后的关系。方法:1、生物信息学分析miR-557在HCC瘤组织中的表达。2、运用实时荧光定量PCR（Real Time Quantitative PCR,RT-qPCR）检测肝癌组织及对应癌旁非瘤组织中miR-557的表达水平。3、分析miR-557表达水平与HCC患者临床病理参数及生存之间的关系。4、运用RT-qPCR检测HCC细胞株和人正常肝细胞L02中miR-557的表达水平。结果:1、生物信息学分析GSE108724数据集发现,与癌旁非肿瘤组织相比,miR-557在HCC中低表达;分析GSE26323数据集发现,与原位HCC相比,肺转移性HCC中miR-557表达水平更低。2、miR-557在HCC瘤组织中的表达水平显着低于配对的癌旁非瘤组织。3、34例HCC组织标本中,miR-557在低分化患者中的表达水平低于中高分化患者,在>5cm的HCC患者中的表达水平低于≤5cm的HCC患者,在TNM III/IV的HCC患者中的表达水平低于I/II期HCC的患者,在低分化的HCC患者中的表达水平低于高中分化的HCC患者;miR-557低表达的HCC患者的总生存时间更短。4、相比正常肝细胞L02,miR-557在肝癌细胞株MHCC-97H、MHCC-97L、Huh7、Hep G2、SMMC-7721中表达均下调,其中MHCC-97H细胞表达最低,Huh7细胞表达最高。结论:miR-557在肝癌组织及细胞系中均呈低表达,且与患者恶性生物学特征及不良的预后显着相关。第二部分:探讨miR-557对肝癌细胞体内外生物学行为的影响目的:探讨干扰或促进miR-557的表达是否影响肝癌细胞的生物学行为。方法:1、在体外运用miR-557 mimics/mimic-NC或慢病毒Lv-miR-557/Lv-vector转染MHCC-97H细胞,运用inhibitors/inhibitor-NC或Lv-sponge-miR-557/Lvsponge-NC转染Huh7细胞,并用RT-qPCR验证转染效率。2、CCK-8实验、细胞克隆形成实验检测miR-557对HCC细胞增殖潜能的影响;划痕实验、Transwell实验检测miR-557对HCC细胞迁移和侵袭能力的影响。3、RT-qPCR及蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）实验检测miR-557对HCC细胞上皮间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的影响。4、运用流式细胞仪检测miR-557对HCC细胞周期分布的影响。5、裸鼠皮下成瘤实验检测miR-557对HCC细胞体内成瘤潜能的影响。结果:1、运用miR-557 mimics或Lv-miR-557可以显着升高MHCC-97H细胞中miR-557的表达水平,运用inhibitors或Lv-sponge-miR-557可以显着降低Huh7细胞中miR-557的表达水平,细胞可用于下一步实验。2、CCK-8实验、细胞克隆形成实验、划痕实验和Transwell实验表明,上调miR-557表达后可抑制MHCC-97H细胞的增殖、迁移和侵袭能力,下调miR-557表达后可促进Huh7细胞的增殖、迁移和侵袭能力。3、与NC组相比,上调miR-557的表达水平后可增加MHCC-97H细胞中E-cadherin的表达而减少N-cadherin和Vimentin的表达;下调Huh7细胞miR-557的表达水平后则出现相反的结果。4、细胞周期实验表明,上调miR-557表达后可使MHCC-97H细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期;下调miR-557可促使Huh7细胞的细胞周期从G0/G1向G2/M过渡。5、体内实验表明,上调miR-557表达后会抑制MHCC-97H细胞在裸鼠皮下成瘤的能力;下调miR-557后使得Huh7细胞的裸鼠皮下成瘤能力进一步加强。结论:上调miR-557的表达会抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮间充质转化、体内生长及诱导细胞周期阻滞在G0/G1期。抑制miR-557的表达则呈相反趋势。第三部分:miR-557通过靶向RAB10抑制Wnt/β-catenin信号的研究目的:探讨miR-557在肝癌中的潜在作用机制及下游信号通路。方法:1、通过在线生物信息学软件Targetscan、miRDB、mi Walk和miRTar Base初步预测了miR-557的靶基因。2、双荧光素酶基因报告实验验证miR-557与RAB10的靶向调控关系。3、在上调miR-557表达的MHCC-97H细胞和下调miR-557表达的Huh7细胞中,运用RT-qPCR和WB实验检测RAB10在m RNA和蛋白表达水平的变化。4、免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）检测肝癌组织及癌旁组织中RAB10蛋白的表达水平,RT-qPCR检测34例HCC患者癌组织和配对癌旁非瘤组织中RAB10 m RNA的表达水平,并分析与miR-557的相关性。5、共转染miR-557 mimics+pc DNA3.1-RAB10或miR-557 inhibitors+si RAB10,分析促进/干扰RAB10的表达能否逆转miR-557 mimics/inhibitors对HCC细胞生物学行为的影响。6、在上调miR-557表达的MHCC-97H细胞和下调miR-557表达的Huh7细胞中,运用WB实验检测Wnt/β-catenin信号通路中重要分子GSK-3β、pGSK-3β、β-catenin、Non-p-β-catenin的变化。7、共转染miR-557 mimics+pc DNA3.1-RAB10或miR-557 inhibitors+si RAB10,运用WB实验检测Wnt/β-catenin信号通路中重要分子GSK-3β、pGSK-3β、β-catenin、Non-p-β-catenin的变化。结果:1、通过生物信息学软件Targetscan、miRDB、mi Walk和miRTar Base初步预测miR-557的靶基因为RAB10。2、双荧光素酶基因报告实验验证了miR-557能够靶向抑制RAB10的表达3、RT-qPCR检测miR-557表达上调的MHCC-97H细胞和miR-557表达下调的Huh7细胞中潜在靶基因的变化,其中RAB10变化显着,WB实验验证了RAB10的变化。4、IHC检测了34例HCC患者癌组织和配对癌旁非瘤组织中RAB10的表达水平,结果提示癌组织中RAB10的表达水平高于癌旁非瘤组织;RT-qPCR得出同样的结果,并与miR-557呈负相关。5、促进/干扰RAB10的表达能部分逆转miR-557 mimics/inhibitors对HCC细胞生物学行为的影响。6、上调miR-557的表达可减少GSK-3β磷酸化、增加β-catenin磷酸化和减少Non-p-β-catenin入核,从而抑制Wnt/β-catenin信号;下调miR-557的表达则出现相反的结果;促进/干扰RAB10的表达能部分逆转miR-557mimics/inhibitors对HCC中Wnt/β-catenin信号的影响。结论:miR-557通过靶向抑制RAB10的表达来调节Wnt/β-catenin信号通路的活性进而影响肝癌细胞的生物学行为。
崔爽[9]（2021）在《肿瘤中EphA2超级增强子的识别及其功能与机制的研究》文中提出超级增强子（Super-enhancer,SE）是由连续排列的增强子串联形成的增强子簇,能够促进关键基因的表达,这些关键基因在机体发育和疾病发生过程中定义了细胞的身份。与增强子相比,超级增强子在基因组上跨度范围更广、转录因子结合密度更大以及诱导转录的能力更强。大量研究表明超级增强子在多种肿瘤中被异常激活,调控癌症中的关键癌基因,促进肿瘤的发生与发展。本文通过生物信息学方法,识别了一个在10种不同肿瘤细胞中活性高于正常组织或细胞中的超级增强子,EphA2-SE。本研究首次揭示了EphA2-SE在肿瘤中的功能以及对靶基因EphA2的转录调控机制。本研究首先在超级增强子数据库内识别了一个新的超级增强子并进行了实验验证。以本实验室前期开发的SEA超级增强子数据库为基础,结合其它三个超级增强子数据库,以组蛋白H3K27ac为识别标志在十种不同肿瘤细胞中识别出了一个超级增强子,EphA2-SE。ChIP实验结果表明活性组蛋白修饰H3K27ac富集在超级增强子的三个组分增强子上。染色质互作关系网站分析结果显示EphA2-SE的靶基因为邻近的上下游基因ARHGEF19和EphA2。BRD4抑制剂JQ1能够抑制超级增强子驱动基因的表达,实验结果表明JQ1能够以浓度依赖性和时间依赖性的方式降低EphA2-SE靶基因EphA2的表达。生物信息学分析发现EphA2在宫颈癌、结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、胸腺癌和胃癌中的表达高于正常组织,并且高表达的EphA2与结直肠癌、肺癌、乳腺癌和胰腺癌肿瘤患者的不良预后密切相关。以上结果表明,EphA2-SE在10种不同肿瘤细胞中均具有活性,主靶基因为EphA2,EphA2对BRD4抑制敏感并与多种肿瘤患者的生存期降低相关。本研究进一步解析了EphA2-SE在肿瘤细胞中对EphA2的调控机制,明确了EphA2-SE的核心成分及主转录因子。通过双荧光素酶报告系统确认了EphA2-SE的组分增强子活性,在HeLa、HCT-116和MCF-7三种肿瘤细胞中E1组分增强子活性远高于另外两个组分增强子并且是最小的核心活性单元。结合生物信息学分析与siRNA实验明确了结合在EphA2-SE上的转录因子,FOSL2和TCF7L2结合在E1组分增强子的不同位置共同促进E1组分增强子的活性。FOSL2和TCF7L2在E1增强子上结合位点的缺失导致E1增强子活性的显着下调。siRNA介导的FOSL2的TCF7L2的表达下调导致EphA2表达的降低。这些结果表明E1组分增强子通过招募FOSL2和TCF7L2转录因子发挥增强子活性并将转录因子募集到EphA2启动子处促进EphA2的强烈转录。本研究最后明确了EphA2-SE在肿瘤细胞中的功能。通过RNA-seq高通量测序以及体内外细胞生物学特性分析发现EphA2-SE通过促进EphA2的表达推动肿瘤的发展进程。利用Crispr/Cas9技术在HeLa、HCT-116和MCF-7三种肿瘤细胞建立了EphA2-SE敲除细胞系。在三种细胞中EphA2-SE缺失后EphA2的表达均明显下调,表明在三种细胞中EphA2-SE的靶基因为EphA2。KEGG和GO分析显示EphA2-SE参与肿瘤细胞的生长和迁移。EphA2-SE的缺失阻断了PI3K/AKT和WNT信号通路进而影响细胞的生物学特性。EphA2-SE缺失导致肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力的降低,细胞周期进程的改变。但EphA2的回复能够挽救EphA2-SE缺失带来的影响。裸鼠体内成瘤实验结果表明EphA2-SE的缺失导致EphA2的表达降低,并在体内影响肿瘤的生长与血管形成。以上结果表明EphA2-SE通过驱动靶基因EphA2介导PI3K/AKT和WNT信号通路影响细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移。综上所述,EphA2-SE是一个位于人类1号染色体并且在10种肿瘤细胞中活性高于正常组织或细胞的超级增强子,靶基因之一为EphA2,EphA2对BRD4抑制敏感并与多种肿瘤患者的不良预后相关。阐明了EphA2-SE的核心成分E1增强子通过招募转录因子FOSL2和TCF7L2驱动靶基因EphA2表达的分子机制。EphA2-SE通过驱动靶基因EphA2介导PI3K/AKT和WNT信号通路影响HeLa、HCT-116和MCF-7细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移,并且在体内影响肿瘤生长与瘤内新生血管的形成。这些结果表明EphA2-SE在今后有望成为肿瘤治疗的潜在靶点。
张川[10]（2021）在《基于生信方法对皮肤恶性黑色素瘤中免疫相关分子的鉴定及分析》文中认为背景:皮肤恶性黑色素瘤是一种高度异质性和高度侵袭性的恶性肿瘤,进展快,致死率高,严重危害人类健康。进展期黑色素瘤的治疗主要包括免疫检验点阻断治疗（Immune checkpoint blockade,ICB）和BRAFi/MEKi等分子靶向治疗。不同风险的黑色素瘤患者,选择的一线治疗方案有所不同。风险较低的进展期黑色素瘤患者通常选择BRAFi/MEKi靶向治疗,而风险较高的进展期黑色素瘤患者通常选择ICB疗法。因此,准确预测患者的死亡风险对治疗方案的选择尤为关键,但目前尚缺乏有效的预测患者死亡风险的模型。如何准确的预测患者的死亡风险,选择合理的治疗方案,这是一个难题。恶性黑色素瘤治疗面临的另一个难题是,不同个体对同一种治疗的药物敏感性不尽相同,每个方案都有不同的敏感或耐药人群。不适宜的治疗方案将会造成原发性耐药,延误患者的最佳治疗时机,造成难以挽回的损失。如何准确的预测患者的药物敏感性,制定精准的个体化治疗方案,这也是一个难题。恶性黑色素瘤治疗还面临的一个难题是,超过一半的患者会出现原发性或继发性耐药。患者一旦发生耐药,现有的治疗手段往往效果甚微,缺乏有效的治疗手段。解决这个问题的一个关键途径是,寻找新的分子治疗靶点。然而,在成千上万的分子中,准确鉴定出有效的分子靶点,这同样是一个难题。基于以上三个难题,本研究主要有三个目的:1.构建诺模图预测模型,为准确预测皮肤恶性黑色素瘤患者的死亡风险提供工具;2.鉴定药物敏感性相关分子,为制定个体化精准治疗方案提供理论依据。3.鉴定黑色素瘤发病过程中关键的驱动基因,为黑色素瘤的治疗提供新的分子靶点。方法:第1部分从TCGA数据库（the Caner Genomic Atlas）下载472例皮肤黑色素瘤患者的RNA测序数据,将其中449例有完整生存资料的黑色素瘤患者随机分为训练集I（n=224）和验证集I（n=225）。从GEO数据库（Gene Expression Omnibus）的GSE65904数据集中获取214例黑色素瘤患者RNA测序数据和生存数据,将其中210例具有完整的生存数据的患者作为独立的外部测试集。这些数据集用于鉴定和验证预后标志物。472例TCGA数据库来源的黑色素瘤患者中,有379例患者的年龄、性别、总生存期、生存状态和临床分期等数据没有缺失值。将这379例患者随机分配到训练集II（n=189）和验证集II（n=190）,用于建立和验证综合临床因素和预后标志物的诺模图预后模型。单变量Cox回归分析、LASSO回归分析（least absolute shrinkage and selection operator,LASSO）和多变量Cox回归模型用于构建预测模型。接收者操作特征曲线下面积（Area under the ROC curve,AUC）、一致性指数（Concordance-index,C-index）、预后模型矫正曲线（Calibration curve）和P值（logrank test）用于评估预后模型的预测能力。Kaplan-Meier分析和logrank检验用于评价某个因素（如基因m RNA标志、模型评分、肿瘤免疫负荷）对预后的影响。诺模图用于计算每个患者预后的风险值,实现风险分层。第2部分TCGA数据库来源的每个黑色素瘤患者的免疫评分、间质评分和肿瘤评分从ESTIMATE数据库中下载。5559个人类免疫基因从Innate DB数据库下载。R包limma包和edge R包用于对基因的RNA表达矩阵进行差异表达分析计算差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）,DEGs的筛选标准是|log FC|>1,P<0.05。加权基因共表达网络分析（weighed gene coexpression network analysis,WGCNA）可基于黑色素瘤RNA测序数据,鉴别出各个功能相关的基因子集,并通过与外部性状（如免疫功能、肿瘤突变负荷等）关联,鉴定出与某个性状最相关的基因子集。JAVA软件GSEA（Gene Set Enrichment Analysis,version 4.1.0）和在线功能注释工具DAVID（The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,version 6.8）用于对基因集进行功能注释,鉴定出该基因集参与的生理功能和信号通路。在线数据库STRING（version 11.0）和JAVA软件Cytoscape用于构建蛋白质-蛋白质相互作用网络（Protein-protein network analysis,PPI analysis）。CCLE数据库（Cancer Cell Line Encyclopedia）的黑色素瘤细胞RNA测序数据和GDSC数据库（Genomics of Drug sensitivity in Cancer）的细胞药敏反应数据,用于分析免疫相关基因与多种药物治疗反应的关系。第3部分人体恶性黑色素瘤的组织样本来源于吉林大学中日联谊医院医院组织标本库,人体正常上皮成纤维细胞系BJ1来自吉林大学中日联谊医院科研中心馈赠,两株黑色素瘤细胞系A375和A875来自于吉林大学基础医学院分子生物学实验室馈赠。RT-PCR用于检测黑色素瘤组织和黑色素瘤细胞系中目标基因的相对表达量。si RNA用于敲低黑色素瘤细胞系中靶基因的表达。划痕实验用于检测黑色素瘤细胞的迁移能力,Cell Counting Kit-8（CCK-8）实验用于检测黑色素瘤细胞的增殖能力。TCGA数据库用于分析靶基因的临床意义。单细胞测序数据用于分析靶基因与免疫微环境的关系。结果:第1部分利用单因素Cox回归分析和LASSO回归分析,从训练集I中鉴定出四个免疫相关基因CLEC7A、CLEC10A、HAPLN3和HCP5,用多因素Cox回归模型构建了黑色素瘤预后标志物。该标志物的预测能力在训练集、验证集和测试集均表现良好,预测5年生存率的AUC值分别为0.68（训练集I）、0.64（验证集I）和0.64（测试集）,高危组和低危组之间存在显着的生存差异（P<0.05）。综合预后标志物和临床特征（免疫评分、年龄、临床分期、肿瘤状态、Breslow深度和Clark分级）的诺模图预后模型具有更好的预测黑色素瘤患者生存的能力。训练集Ⅱ和验证集Ⅱ的一致性指数分别为0.853和0.736,AUC值分别为0.862和0.832,均明显高于0.5,表现出良好的预测能力。训练集Ⅱ和验证集Ⅱ的预测模型矫正曲线与45°参考线几乎重叠,提示模型预测的生存率和真实生存率之间有很高的一致性。根据诺模图计算每个患者的风险评分,将训练集Ⅱ和验证集Ⅱ分别分为低风险组和高风险组,利用logrank检验对两组人群进行生存分析。分析结果提示,低风险组比高风险组的生存期更长,组间具有显着性差异。这些检验指标均证明,本研究建立的诺模图预测模型具有良好的预测能力。第2部分通过黑色素瘤患者的体细胞突变数据计算每个患者的肿瘤突变负荷（Tumor Mutation Burden,TMB）,各个患者间的TMB值离散程度很大,反应出黑色素瘤异质性很高。TMB水平的升高与生存结果的改善显着相关。FLNC、NEXN和TNNT3被鉴定为与TMB相关的关键基因,同时构建了它们的ce RNA网络,包括5个mi RNAs（HAS-mi R-590-3P、HAS-mi R-374B-5P、HAS-mi R-3127-5P、HAS-mi R-1913和HAS-mi R-1291）和31个lnc RNAs（FAM66C、MIAT、NR2F2AS1等）。FLNC、NEXN和TNNT3的表达水平能反应黑色素瘤细胞对多种药物的治疗反应。第3部分正常皮肤和原发黑色素瘤之间有1499个DEGs（GSE15605）;良性黑痣与原发黑色素瘤之间有595个DEGs（GSE112509）;原发黑色素瘤和转移黑色素瘤之间有209个DEGs（GSE7553）。这3个数据集有2个共同的DEGs:AURKA和BUB1。其中BUB1与黑色素瘤患者的临床分期、Breslow深度、clarck评分和预后等具有显着相关性。BUB1基因的甲基化和拷贝数变异与BUB1基因表达显着相关。体外细胞实验发现,敲低BUB1明显抑制了黑色素瘤细胞（A375和A875）的增殖和迁移能力。单细胞测序结果表明,高表达的BUB1能抑制肿瘤微环境中CD8+T细胞的数量和功能。进一步研究结果提示,BUB1高表达的黑色素瘤细胞株对多种药物的治疗反应性更好。结论:1.免疫相关基因CLEC7A、CLEC10A、HAPLN3和HCP5组成的预后标志物,结合年龄、Breslow深度、Clark评分等临床信息构建的预后模型,能有效预测恶黑患者死亡风险。2.TMB相关基因FLNC、NEXN和TNNT3与黑色素瘤的药物敏感性密切相关,有助于区分不同的药物敏感人群。3.BUB1是黑色素瘤的致癌基因,上调的BUB1与降低的CD8+T细胞的比例及功能的降低显着相关,是潜在的分子治疗靶点。
二、浅析致癌机制及癌的基因治疗（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、浅析致癌机制及癌的基因治疗（论文提纲范文）
（1）泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 抗体偶联药物的知识现状 |
| 引言 |
| 1.1.1 ADC发展简史 |
| 1.1.2 获得监管批准的上市ADC |
| 1.1.3 临床试验中的在研ADC及其靶标图谱 |
| 1.1.4 抗体骨架和靶标的选择 |
| 1.1.5 连接子类型和偶联技术 |
| 1.1.6 有效载荷 |
| 1.1.7 ADC在体内的工作原理 |
| 1.1.8 ADC对难治性癌症的治疗 |
| 1.1.9 ADC的毒性问题 |
| 1.1.10 ADC耐药机制 |
| 1.1.11 未来展望 |
| 1.2 嵌合抗原受体T细胞的知识现状 |
| 引言 |
| 1.2.1 CAR-T发展简史 |
| 1.2.2 CAR-T细胞的工作原理 |
| 1.2.3 CAR和T细胞受体的结构 |
| 1.2.4 获得监管批准的CAR-T |
| 1.2.5 CAR-T细胞疗法的毒性 |
| 1.2.6 未来挑战、机会和应用 |
| 1.3 本课题的研究目标 |
| 第二章 基于多组学构建泛实体瘤相关抗原图谱 |
| 引言 |
| 2.1 数据采集与分析方法 |
| 2.1.1 正常组织转录组和蛋白组的数据采集 |
| 2.1.2 蛋白质亚细胞定位数据的采集与编译 |
| 2.1.3 人体组织器官的重排与映射 |
| 2.1.4 正常组织的表达及其分级 |
| 2.1.5 基因在肿瘤及其癌旁组织之间的差异表达分析 |
| 2.1.6 基因在肿瘤与其他正常组织之间的差异表达分析 |
| 2.1.7 肿瘤组织转录组、基因组和表型数据的编译 |
| 2.1.8 功能相关突变的注释 |
| 2.1.9 预测肿瘤相关抗原的蛋白过表达率 |
| 2.1.10 肿瘤相关抗原与癌细胞功能状态的相关性分析 |
| 2.1.11 基因集富集得分分析 |
| 2.1.12 临床试验的检索策略 |
| 2.1.13 统计分析 |
| 2.2 分析结果 |
| 2.2.1 组装综合数据集并通过算法识别肿瘤相关抗原 |
| 2.2.2 肿瘤相关抗原的表达谱与差异表达谱 |
| 2.2.3 肿瘤相关抗原的异质表达谱 |
| 2.2.4 预测肿瘤相关抗原的蛋白过表达率 |
| 2.2.5 癌症驱动基因变异全景 |
| 2.2.6 候选肿瘤相关抗原的组合评估 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 靶向CDH17 的新型ADC的制备及抗结直肠癌活性研究 |
| 引言 |
| 3.1 实验动物 |
| 3.2 实验仪器及试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 TCGA与 GTEx中 CDH17的m RNA数据的获取与分析 |
| 3.3.2 免疫原的设计与制备 |
| 3.3.3 制备靶向CDH17 的单克隆抗体的免疫方案 |
| 3.3.4 抗体可变区基因测序 |
| 3.3.5 鼠-人嵌合抗体的构建与表达纯化 |
| 3.3.6 抗体结合亲和力的测定 |
| 3.3.7 CDH17 靶向抗体偶联vc MMAE |
| 3.3.8 细胞内吞实验 |
| 3.3.9 细胞膜蛋白的提取 |
| 3.3.10 免疫沉淀 |
| 3.3.11 免疫沉淀产物的银染 |
| 3.3.12 蛋白免疫印迹 |
| 3.3.13 免疫组化 |
| 3.3.14 免疫荧光 |
| 3.3.15 流式细胞实验 |
| 3.3.16 体外细胞毒性实验 |
| 3.3.17 体内抑瘤活性实验 |
| 3.3.18 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 CDH17 在消化道肿瘤和正常组织中的表达 |
| 3.4.2 CDH17 靶向抗体的多重表征 |
| 3.4.3 CDH17 靶向ADC的制备与表征 |
| 3.4.4 CDH17 靶向ADC在体外的抗肿瘤活性 |
| 3.4.5 CDH17 靶向ADC在 KM12SM结肠癌异种移植模型中的抗肿瘤活性 |
| 3.4.6 CDH17 靶向ADC在 COLO205 结肠癌异种移植模型中的抗肿瘤活性 |
| 3.4.7 荷瘤小鼠对CDH17 靶向ADC的耐受性 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 靶向LYPD3的CAR-T细胞的抗肺腺癌活性研究 |
| 引言 |
| 4.1 实验动物 |
| 4.2 试剂耗材及设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 TCGA与 GTEx中 LYPD3 m RNA数据的获取与分析 |
| 4.3.2 抗体人源化 |
| 4.3.3 慢病毒包装 |
| 4.3.4 CD3+T细胞的复苏与激活 |
| 4.3.5 CD3+T细胞慢病毒感染 |
| 4.3.6 CAR-T细胞分化与耗竭的检测 |
| 4.3.7 CAR-T体外细胞杀伤 |
| 4.3.8 CAR-T体内活性实验 |
| 4.3.9 细胞因子的检测 |
| 4.3.10 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 LYPD3 蛋白在肿瘤和正常组织中的表达 |
| 4.4.2 LYPD3 靶向的CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性 |
| 4.4.3 LYPD3 靶向的CAR-T细胞在PC9 肺腺癌异种移植模型中抗肿瘤活性 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）晚期胰腺癌中医方证特征地域差异及临床研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略表 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 现代医学对胰腺癌的认识及研究进展 |
| 1 胰腺癌流行病学概况 |
| 2 胰腺癌的危险因素 |
| 3 胰腺癌的发病机制 |
| 4 胰腺癌的诊断与分型 |
| 5 胰腺癌西医治疗进展 |
| 6 小结与展望 |
| 综述二 中医药治疗胰腺癌研究进展 |
| 1 胰腺与胰腺癌中医病名溯源 |
| 2 胰腺癌病因病机及辨证分型 |
| 3 不同地域医派胰腺癌辨治的学术探讨 |
| 4 中医药治疗胰腺癌研究概况 |
| 5 小结与展望 |
| 第二部分 晚期胰腺癌中医方证特征南北比较研究 |
| 第一章 基于文献的胰腺癌中医证型分布规律研究 |
| 资料与方法 |
| 1 资料来源 |
| 2 时间范围 |
| 3 文献类型 |
| 4 检索策略 |
| 5 文献的纳入与筛选 |
| 6 数据提取和规范 |
| 7 统计学方法 |
| 结果 |
| 1 文献类型 |
| 2 文献来源及时间分布 |
| 3 证型频次分布 |
| 讨论 |
| 1 证候、病机、证型的关系 |
| 2 胰腺癌病机特点 |
| 3 胰腺癌证型研究存在的问题 |
| 结论 |
| 第二章 基于数据挖掘的晚期胰腺癌中医方证特征南北比较研究 |
| 临床资料与方法 |
| 1 临床资料 |
| 2 研究方法 |
| 结果 |
| 1 一般资料 |
| 2 关联规则分析 |
| 讨论 |
| 1 晚期胰腺癌病机及证素特点 |
| 2 晚期胰腺癌用药特点 |
| 3 本研究的特点 |
| 结论 |
| 第三部分 中西医联合治疗晚期胰腺癌临床疗效观察研究 |
| 临床资料与方法 |
| 1 临床资料 |
| 2 研究内容和方法 |
| 3 数据管理与统计分析 |
| 4 统计分析 |
| 结果 |
| 1 一般资料 |
| 2 疗效分析 |
| 讨论 |
| 1 中西医联合治疗可延长晚期胰腺癌患者总生存时间 |
| 2 中西医联合治疗可降低晚期胰腺癌患者肿瘤标志物CA50 |
| 3 中西医联合治疗可改善晚期胰腺癌患者症状 |
| 4 中西医联合治疗可提高晚期胰腺癌患者生活质量 |
| 结论 |
| 结语 |
| 本研究的创新性 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附录一 胰腺癌AJCC第八版TNM分期 |
| 附录二 |
| 附件 |
（3）hsa-miR-6887-3p/Mex3a轴通过RAP1/MAPK通路对结直肠癌恶性生物学行为的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Mex3家族在肿痛中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士在读期间发表论文目录 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
| Western blot原始条带 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
（4）PTEN相关ceRNA网络的构建及肝癌发病机制的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略名词对照 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肝癌的流行病学 |
| 1.1.1 肝癌的监测 |
| 1.1.2 肝癌的诊断 |
| 1.1.3 肝癌的发病率和死亡率 |
| 1.1.4 肝癌的生存率 |
| 1.1.5 肝癌的风险因素 |
| 1.2 竞争性内源性RNA(ceRNA)在肝细胞癌中的新兴作用 |
| 1.2.1 非编码RNA的特征 |
| 1.2.2 非编码RNA的在癌症中的作用 |
| 1.2.3 ceRNA假说的概述和组成 |
| 1.3 lncRNA介导的ceRNET通过调节HCC中的信号传导途径发挥功能 |
| 1.3.1 NF-κB信号通路 |
| 1.3.2 PI3K/AKT信号通路 |
| 1.3.3 Wnt/β-catenin信号通路 |
| 1.3.4 TGF-β信号通路 |
| 1.3.5 JAKs/STAT信号通路 |
| 1.4 lncRNA介导的ceRNET在肝细胞癌中的临床应用 |
| 1.4.1 LncRNA相关的ceRNET介导的肝癌早期检测和诊断 |
| 1.4.2 LncRNA相关的ceRNET介导的肝癌预后和复发 |
| 1.4.3 LncRNA相关的ceRNET介导的肝癌靶向治疗和用药 |
| 1.5 本课题的研究意义、研究内容和创新点 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 创新点 |
| 第二章 在肝癌中构建与PTEN相关的ceRNA调控网络 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验数据与方法 |
| 2.2.1 数据准备与处理 |
| 2.2.2 差异表达基因的筛选 |
| 2.2.3 肝癌ceRNA网络的建立 |
| 2.2.4 功能富集分析 |
| 2.2.5 肝癌生存分析 |
| 2.3 研究结果 |
| 2.3.1 验证肝癌中PTEN过表达的抑癌作用及预后价值 |
| 2.3.2 鉴定差异表达的基因(DEmRNA,DElncRNA和 DEmiRNA) |
| 2.3.3 lnRNA-miRNA-mRNA三重调控网络的构建 |
| 2.3.4 ceRNA网络的构建和验证 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 在肝癌患者中DLEU2L/TAOK1轴的识别及临床相关性分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验数据与方法 |
| 3.2.1 相关性分析 |
| 3.2.2 建立特定的肝癌预后模型 |
| 3.2.3 验证TAOK1在HCC中的异常表达 |
| 3.2.4 统计分析 |
| 3.3 研究结果 |
| 3.3.1 预后模型的初建立 |
| 3.3.2 DLEU2L/TAOK1轴在肝癌患者中的临床意义 |
| 3.3.3 TAOK1 异常高表达的验证 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 肝癌预后模型DLEU2L/TAOK1的免疫组化分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验数据与方法 |
| 4.2.1 肝癌样本收集 |
| 4.2.2 主要耗材及试剂 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.3.1 TAOK1蛋白在Alb-Cmyc自发成瘤小鼠肝癌组织和正常小鼠肝组织中的表达 |
| 4.3.2 TAOK1蛋白在人肝癌和相应癌旁组织中的表达 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 预后模型DLEU2L/TAOK1轴参与肝癌分子机制的初步探讨 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验数据与方法 |
| 5.2.1 数据准备与处理 |
| 5.2.2 TAOK1的甲基化及表达分析 |
| 5.2.3 TAOK1的免疫浸润水平及表达分析 |
| 5.2.4 统计分析 |
| 5.3 研究结果 |
| 5.3.1 TAOK1异常过表达与基因组学的关系 |
| 5.3.2 TAOK1基因甲基化与表达的关系 |
| 5.3.3 肝癌免疫浸润与TAOK1表达的关系 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间主要成果 |
| 致谢 |
（5）长链非编码RNA LINC01614通过miR-520a-3p/SNX3调控轴促进骨肉瘤进展的分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 LncRNAs的结构及功能特点 |
| 1.2.1 LncRNAs的起源及分类 |
| 1.2.2 LncRNAs在细胞内的调控模式 |
| 1.2.3 LncRNAs的调控作用 |
| 1.3 LncRNAs在骨肉瘤中的研究进展 |
| 1.3.1 LncRNAs在骨肉瘤发病机制中的作用 |
| 1.3.2 LncRNAs参与调控骨肉瘤的分子通路 |
| 1.3.3 LncRNAs参与调控骨肉瘤的细胞通路 |
| 1.3.4 LncRNAs在骨肉瘤中的临床应用情况 |
| 1.4 CeRNA在骨肉瘤中的研究进展 |
| 1.4.1 CeRNA调控骨肉瘤的生物功能 |
| 1.4.2 CeRNA调节骨肉瘤的耐药 |
| 1.5 LINC01614、miR-520a-3p、SNX3 在肿瘤中的研究现状 |
| 1.5.1 LINC01614 在肿瘤中的研究现状 |
| 1.5.2 MiR-520a-3p在肿瘤中的研究现状 |
| 1.5.3 SNX3 在肿瘤中的研究现状 |
| 第二章 骨肉瘤中以LncRNAs为核心的调控网络构建及关键基因筛选 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 骨肉瘤组织中差异表达lncRNAs、miRNAs及 mRNAs分子表达谱检测及分析 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.3 骨肉瘤中差异表达lncRANs靶基因的调控功能分析及以LINC01614、MALAT1 为中心的促癌调控网络提取和功能分析 |
| 2.3.1 实验材料 |
| 2.3.2 实验方法 |
| 2.3.3 实验结果 |
| 2.4 LINC01614及MALAT1 在骨肉瘤细胞及骨肉瘤组织中表达水平的验证 |
| 2.4.1 实验材料 |
| 2.4.2 实验方法 |
| 2.4.3 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 LINC01614 在骨肉瘤中的调控功能研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 LINC01614 与骨肉瘤患者生存率及组织学分期有关 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 分析方法 |
| 3.2.3 分析结果 |
| 3.3 沉默LINC01614 抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭,并促进骨肉瘤细胞凋亡 |
| 3.3.1 实验材料 |
| 3.3.2 实验方法 |
| 3.3.3 实验结果 |
| 3.4 沉默LINC01614 抑制骨肉瘤小鼠模型肿瘤生长 |
| 3.4.1 实验材料 |
| 3.4.2 实验方法 |
| 3.4.3 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 LINC01614 调控骨肉瘤发生发展的分子机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 LINC01614 通过miR-520a-3p调控骨肉瘤的生物功能 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 实验结果 |
| 4.3 LINC01614 通过竞争性结合miR-520a-3p调控SNX3 的表达 |
| 4.3.1 实验材料 |
| 4.3.2 实验方法 |
| 4.3.3 实验结果 |
| 4.4 LINC01614/miR-520a-3p通过SNX3 调控骨肉瘤的发生与发展 |
| 4.4.1 实验材料 |
| 4.4.2 实验方法 |
| 4.4.3 实验结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（6）LncRNA H19在香烟烟雾暴露促食管鳞状细胞癌发生发展的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 食管癌的发病情况及危险因素 |
| 1.2 香烟烟雾与癌症的关系 |
| 1.3 表观遗传学与香烟烟雾暴露 |
| 1.4 本课题研究目的 |
| 第二章 香烟烟雾慢性暴露细胞模型的建立以及lncRNA芯片的分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 LncRNA H19 在细胞和患者组织中的表达水平以及临床病理特征的分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 香烟烟雾暴露下H19 基因DNA甲基化的改变 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 本研究的创新之处和局限性 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 香烟烟雾诱导食管癌表观遗传学改变的研究进展 |
| 参考文献 |
| 本人在硕士期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）海洋候选药物PA/GPA抗肾癌机制和早期ADMET研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 PA类抗肾癌活性候选药物筛选及肾癌靶点挖掘 |
| 第一章 PA类抗肾癌活性候选药物筛选 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 溶液配制 |
| 2 PAs化合物的结构 |
| 3 PAs化合物的肾癌细胞增殖抑制活性 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 细胞给药 |
| 3.3 PA/GPA抗肾癌增殖活性优于索拉菲尼 |
| 4 PA和GPA的理化性质分析 |
| 5 小结与讨论 |
| 第二章 多组学挖掘PA/GPA抗肾癌作用新靶点 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 转录组学挖掘PA抗肾癌靶点 |
| 2.1 样品准备 |
| 2.2 转录组文库构建、质检和上机测序 |
| 2.3 差异表达基因显着性分析 |
| 3 定性蛋白质组学筛选PA相互作用新靶标 |
| 3.1 实验路线及操作方案 |
| 3.2 液-质连用(HPLC-MS/MS)分析与小分子PA结合的蛋白质成分 |
| 4 WGCNA分析发现PRDX1/4与PA所影响基因处于同一表达模式 |
| 5 RT-qPCR验证PA/GPA对PRDX1的影响 |
| 5.1 样品制备 |
| 5.2 数据处理及显着性标准 |
| 5.3 RT-qPCR结果分析 |
| 6 临床人肾透明细胞癌组织与癌旁组织PRDX1表达情况 |
| 6.1 样品准备 |
| 6.2 临床人肾透明细胞癌组织中PRDX1低表达 |
| 7 MTT法检测PA/GPA对shPRDX1敲低ACHN细胞增殖抑制率 |
| 7.1 慢病毒转染 |
| 7.2 MTT法检测PA/GPA对shPRDX1敲低ACHN细胞的增殖抑制率 |
| 8 小结与讨论 |
| 第三章 PA/GPA直接结合PRDX1诱导肾癌细胞凋亡 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 激光全息细胞成像系统检测PA诱导ACHN细胞凋亡 |
| 2.1 样品准备 |
| 2.2 结果 |
| 3 PA/GPA降低ACHN细胞ROS水平 |
| 3.1 PA降低ACHN肾癌细胞ROS水平 |
| 3.2 PRDX1敲低后PA/GPA降ROS作用消失 |
| 4 PA/GPA通过抑制PRDX1的Tyr194磷酸化增加过氧化物酶活性 |
| 5 PA/GPA促使PRDX1入核增加 |
| 5.1 样品准备 |
| 5.2 结果 |
| 6 表面等离子共振实验证明PA/GPA与PRDX1蛋白结合 |
| 6.1 配体预富集、蛋白偶联及样品进样 |
| 6.2 结果 |
| 7 PA/GPA作用于PRDX1二聚体结合界面 |
| 8 小结与讨论 |
| 第四章 PA/GPA对ACHN荷瘤裸鼠成瘤能力的影响 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 人肾癌裸鼠移植瘤模型建立及给药方案设计 |
| 2.1 人肾癌裸鼠移植瘤模型的建立 |
| 2.2 实验设计与分组 |
| 2.3 数据处理及显着性标准 |
| 3 荷瘤小鼠体重、肿瘤体积、重量及免疫组化检测 |
| 4 PA/GPA下调PRDX1抑制荷瘤小鼠肿瘤生长 |
| 5 PA/GPA诱发荷瘤裸鼠肝毒性 |
| 6 小结与讨论 |
| 第二部分 PA/GPA肝毒性机制研究 |
| 第五章 PA/GPA毒性机制挖掘 |
| 1 试剂和仪器 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 TMT标记定量蛋白质组学差异表达蛋白鉴定 |
| 2.1 样品准备 |
| 2.2 差异表达蛋白鉴定与KEGG通路富集 |
| 3 转录组学与定量蛋白质组学关联研究PA/GPA肝毒性靶点 |
| 3.1 差异靶基因的挖掘 |
| 3.2 差异靶基因的肝肾组织分布 |
| 3.3 PA/GPA对HepG2细胞胆固醇代谢靶基因表达的影响 |
| 4 PA/GPA的线粒体毒性 |
| 4.1 样品准备 |
| 4.2 PA/GPA对HepG2细胞线粒体膜电位的影响 |
| 5 PA/GPA增加HepG2细胞对低密度脂蛋白的摄取 |
| 5.1 样品准备 |
| 5.2 PA/GPA对HepG2细胞摄取LDL能力的影响 |
| 6 PA/GPA加剧高胆固醇诱导的小鼠肝损伤 |
| 6.1 实验动物 |
| 6.2 总体实验设计与分组 |
| 6.3 数据处理与显着性标准 |
| 6.4 小鼠肝脏形态学和生化指标 |
| 7 LXRα的激活是PA/GPA产生肝毒性的必要条件 |
| 8 PA/GPA延缓肝脏胆固醇代谢 |
| 9 PA/GPA对胆汁酸代谢信号通路Cyp7a1基因具有抑制作用 |
| 10 PA/GPA通过抑制LXRα调控CYP7A1的表达 |
| 10.1 siLXRα敲低HepG2细胞株的构建 |
| 10.2 PA/GPA通过抑制LXRα下调CYP7A1的表达 |
| 11 小结与讨论 |
| 第六章 PA/GPA与LXRα蛋白体外结合能力探讨 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 薛定谔Maestro v11.1对PA/GPA-LXRα进行计算机模拟分子对接 |
| 3 SPR实验证明PA与LXRα蛋白直接结合 |
| 3.1 配体预富集、蛋白偶联及样品进样 |
| 3.2 PA能在体外与LXRα蛋白直接结合 |
| 4 粉蝶霉素类化合物与LXRα毒效关系探讨 |
| 5 小结与讨论 |
| 第七章 PA/GPA早期ADME研究 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 PA/GPA的吸收与分布 |
| 2.1 动物准备 |
| 2.2 总体实验设计与分组 |
| 2.3 高分辨质谱、UPLC、UPLC-MS/MS鉴定方法 |
| 2.4 样品的处理和进样 |
| 2.5 PA/GPA在小鼠体内的药时曲线和肝组织含量 |
| 3 PA的代谢 |
| 3.1 PA在人肝微粒体中的CYP代谢 |
| 3.2 PA在人肝微粒体中的UGT代谢 |
| 4 小结与讨论 |
| 第八章总结与展望 |
| 1 总结 |
| 2 本论文的创新之处 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 攻读学位期间的成果 |
| 致谢 |
（8）miR-557通过靶向RAB10调控Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文略缩词表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 肝细胞癌 |
| 1.1.1 肝细胞性肝癌的流行病学 |
| 1.1.2 肝细胞性肝癌的危险因素 |
| 1.1.3 肝细胞性肝癌的筛查 |
| 1.1.4 肝细胞性肝癌的诊断 |
| 1.1.5 肝细胞性肝癌的分期 |
| 1.1.6 肝细胞性肝癌的治疗 |
| 1.1.7 肝细胞性肝癌的生物学 |
| 1.2 microRNAs(miRNAs) |
| 1.2.1 miRNA概述 |
| 1.2.2 miRNA与 HCC |
| 1.2.3 miRNA-557与HCC |
| 1.3 上皮间充质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT) |
| 1.3.1 EMT概述 |
| 1.3.2 EMT和 miRNAs |
| 1.3.3 EMT和 HCC |
| 1.4 Wnt/β-catenin信号通路 |
| 1.4.1 Wnt/β-catenin信号通路概述 |
| 1.4.2 Wnt/β-catenin信号通路与HCC |
| 1.4.3 Wnt/β-catenin信号通路与miRNAs |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第2章 miR-557 在肝癌中的表达及其与患者临床病理特征及预后关系 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 miR-557在GSE108724 的表达情况 |
| 2.3.2 miR-557在GSE26323 的表达情况 |
| 2.3.3 miR-557 在肝癌细胞系中的表达情况 |
| 2.3.4 miR-557 在肝癌组织中的表达情况 |
| 2.3.5 miR-557 在肝癌组织中的表达水平与患者生存时间的关系 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 miR-557 对肝癌细胞体内外生物学行为的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 统计学方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 mimics和 inhibitors可以显着影响miR-557 的表达 |
| 3.3.2 miR-557 抑制肝癌细胞增殖 |
| 3.3.3 miR-557 抑制肝癌细胞迁移和侵袭能力 |
| 3.3.4 miR-557 过表达和敲减均影响肝细胞癌的细胞周期分布 |
| 3.3.5 miR-557 抑制肝癌细胞EMT |
| 3.3.6 慢病毒稳转株的筛选及miR-557 对细胞克隆形成的影响 |
| 3.3.7 miR-557 对肝细胞癌克隆形成和裸鼠皮下成瘤的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第4章 miR-557 通过靶向RAB10 抑制Wnt/β-catenin信号的研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 统计学方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 生物信息学预测miR-557 的靶基因 |
| 4.3.2 双荧光素酶报告实验验证miR-557与RAB10 的靶向性 |
| 4.3.3 miR-557 负性调控RAB10 的表达水平 |
| 4.3.4 RAB10 在肝癌组织中表达及其与miR-557 的相关性 |
| 4.3.5 促进或干扰RAB10 的表达会影响 miR-557对HCC细胞生物学行为的影响 |
| 4.3.6 miR-557 抑制肝细胞性肝癌Wnt/β-catenin信号通路 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第5章 总结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文情况 |
| 综述 MicroRNA 在肝细胞癌中的作用及其机制的研究进展 |
| 参考文献 |
（9）肿瘤中EphA2超级增强子的识别及其功能与机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题的研究背景及意义 |
| 1.2 增强子的研究进展 |
| 1.2.1 增强子概述及其鉴定 |
| 1.2.2 增强子类型及作用方式 |
| 1.3 超级增强子研究进展简介 |
| 1.3.1 超级增强子概述 |
| 1.3.2 超级增强子的鉴定 |
| 1.3.3 超级增强子与3D基因组结构 |
| 1.3.4 超级增强子相关数据库 |
| 1.4 超级增强子与疾病的关系 |
| 1.4.1 超级增强子与肿瘤的关系 |
| 1.4.2 超级增强子在治疗中的应用 |
| 1.5 Eph/ephrin及 EphA2 的研究进展 |
| 1.5.1 Eph/ephrin的研究概况 |
| 1.5.2 EphA2 的研究进展 |
| 1.5.3 EphA2 与恶性肿瘤的研究进展 |
| 1.6 本文的主要研究内容及技术路线 |
| 1.6.1 文章的主要研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第2章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物及细胞系 |
| 2.1.2 实验试剂及仪器 |
| 2.1.3 常用网站和软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 核酸的提取 |
| 2.2.2 实时定量PCR |
| 2.2.3 染色质免疫共沉淀(ChIP) |
| 2.2.4 蛋白质免疫印迹(Western Blot) |
| 2.2.5 双荧光素酶载体的构建与检测 |
| 2.2.6 敲除细胞系的建立 |
| 2.2.7 MTT增殖与克隆形成 |
| 2.2.8 细胞周期 |
| 2.2.9 细胞划痕 |
| 2.2.10 细胞侵袭和迁移 |
| 2.2.11 小鼠皮下成瘤 |
| 2.2.12 H&E染色与组织免疫荧光 |
| 2.2.13 ChIP-seq 数据与RNA-seq 数据 |
| 2.2.14 统计学分析 |
| 2.2.15 实验室质量控制 |
| 第3章 EphA2-SE的识别与鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 超级增强子的生物信息学分析 |
| 3.2.1 超级增强子的识别 |
| 3.2.2 组分增强子的划分及活性检测 |
| 3.3 超级增强子靶基因的预测 |
| 3.4 EphA2 在肿瘤中的表达以及与预后关系的研究 |
| 3.4.1 EphA2在TCGA数据库肿瘤样本中的表达分析 |
| 3.4.2 EphA2 表达与预后相关 |
| 3.5 EphA2对BRD4 抑制敏感 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 EphA2-SE在肿瘤细胞中对EphA2 的转录调控机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 EphA2-SE核心组分的识别 |
| 4.3 EphA2-SE对 EphA2 调控机制的探究 |
| 4.3.1 结合E1 组分增强子的转录因子识别 |
| 4.3.2 E1 组分增强子上FOSL2和TCF7L2 转录因子结合位点分析 |
| 4.3.3 FOSL2和TCF7L2 调控E1 增强子活性及EphA2 表达 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 RNA-seq高通量测序分析EphA2-SE的功能 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 EphA2-SE缺失细胞系的建立 |
| 5.2.1 敲除靶点有效性的检测 |
| 5.2.2 稳转细胞系的建立 |
| 5.3 HeLa、HCT-116和MCF-7 细胞中差异表达基因分析 |
| 5.4 三种肿瘤细胞中共差异表达基因分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 EphA2-SE影响肿瘤细胞基本生物学功能的研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 EphA2-SE对肿瘤细胞生物学特性的影响 |
| 6.2.1 EphA2-SE影响肿瘤细胞的增殖与克隆形成 |
| 6.2.2 EphA2-SE对肿瘤细胞侵袭与迁移的能力的影响 |
| 6.2.3 EphA2-SE信号通路分析 |
| 6.3 EphA2-SE对裸鼠体内成瘤的影响 |
| 6.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ |
| 附录 Ⅱ |
| 附录 Ⅲ |
| 附录 Ⅳ |
| 附录 Ⅴ |
| 附录 Ⅵ |
| 攻读博士学位期间取得创新性成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）基于生信方法对皮肤恶性黑色素瘤中免疫相关分子的鉴定及分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 文献综述 恶性黑色素瘤的临床特征、现状及展望 |
| 2.1 恶性黑色素瘤的流行病学和危险因素 |
| 2.2 恶性黑色素瘤的治疗现状 |
| 2.2.1 免疫治疗 |
| 2.2.2 靶向治疗 |
| 2.2.3 免疫治疗和靶向治疗的联合 |
| 2.2.4 全身辅助性治疗 |
| 2.3 恶性黑色素瘤的治疗前沿 |
| 2.4 未解决的问题和未来的方向 |
| 第3章 免疫相关预后分子及诺模图预后模型的构建与验证 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 数据采集 |
| 3.1.2 加权基因共表达网络分析(WGCNA) |
| 3.1.3 DAVID分析 |
| 3.1.4 免疫相关预后标志物的鉴定与验证 |
| 3.1.5 肿瘤浸润免疫细胞的差异表达分析 |
| 3.1.6 基因集富集分析 |
| 3.1.7 诺莫图的构建与验证 |
| 3.1.8 统计分析 |
| 3.2 研究结果 |
| 3.2.1 研究流程 |
| 3.2.2 免疫相关模块的鉴定和验证 |
| 3.2.3 免疫相关预后标志物的鉴定与验证 |
| 3.2.4 预后标记物的临床相关性 |
| 3.2.5 诺模图预后模型的构建和验证 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 黑色素瘤中肿瘤突变负荷相关关键基因的鉴定及潜在机制研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 RNA测序数据来源 |
| 4.1.2 高TMB组和低TMB组的DEGs的计算 |
| 4.1.3 TMB与肿瘤免疫微环境的关系 |
| 4.1.4 TMB相关关键基因的鉴定和潜在的分子机制 |
| 4.1.5 蛋白互作网络及子簇的构建 |
| 4.1.6 竞争性内源性RNA网络的构建 |
| 4.1.7 基因集功能注释 |
| 4.1.8 关键基因与药物敏感性的相关性分析 |
| 4.1.9 统计分析 |
| 4.2 研究结果 |
| 4.2.1 技术路线图 |
| 4.2.2 黑色素瘤基因突变的总体描述 |
| 4.2.3 TMB与临床特征的关系 |
| 4.2.4 TMB与TIICs的关系 |
| 4.2.5 TMB相关关键基因和ce RNAs的鉴定 |
| 4.2.6 TMB相关关键基因与黑色素瘤细胞株对药物敏感性之间的关系 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 BUB1在皮肤恶性黑色素瘤中作用及机制的研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 黑色素瘤组织标本的收集 |
| 5.1.2 细胞系的获取 |
| 5.1.3 cDNA引物的设计 |
| 5.1.4 RT-PCR |
| 5.1.5 siRNA敲低靶基因 |
| 5.1.6 划痕实验 |
| 5.1.7 cck-8 实验 |
| 5.2. 研究结果 |
| 5.2.1 黑色素瘤发病过程中关键基因的鉴定与验证 |
| 5.2.2 驱动基因的鉴定 |
| 5.2.3 BUB1的临床意义 |
| 5.2.4 BUB1对黑色素瘤细胞表型的影响 |
| 5.2.5 BUB1相关的信号通路分析 |
| 5.2.6 BUB1与CD8~+T细胞的关系 |
| 5.2.7 BUB1与治疗反应的关系 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 第6章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学校间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
四、浅析致癌机制及癌的基因治疗（论文参考文献）
- [1]泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用[D]. 方佳成. 西北大学, 2021(12)
- [2]晚期胰腺癌中医方证特征地域差异及临床研究[D]. 姜菊玲. 中国中医科学院, 2021(02)
- [3]hsa-miR-6887-3p/Mex3a轴通过RAP1/MAPK通路对结直肠癌恶性生物学行为的影响[D]. 李海霞. 山东大学, 2021(11)
- [4]PTEN相关ceRNA网络的构建及肝癌发病机制的初步研究[D]. 石怡. 湖南工业大学, 2021(02)
- [5]长链非编码RNA LINC01614通过miR-520a-3p/SNX3调控轴促进骨肉瘤进展的分子机制[D]. 蔡启轩. 吉林大学, 2021(01)
- [6]LncRNA H19在香烟烟雾暴露促食管鳞状细胞癌发生发展的作用及机制研究[D]. 叶美洁. 汕头大学, 2021
- [7]海洋候选药物PA/GPA抗肾癌机制和早期ADMET研究[D]. 梁至. 南方医科大学, 2021
- [8]miR-557通过靶向RAB10调控Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌进展的机制研究[D]. 叶善平. 南昌大学, 2021(01)
- [9]肿瘤中EphA2超级增强子的识别及其功能与机制的研究[D]. 崔爽. 哈尔滨工业大学, 2021(02)
- [10]基于生信方法对皮肤恶性黑色素瘤中免疫相关分子的鉴定及分析[D]. 张川. 吉林大学, 2021(01)