一、人CD34分化抗原转录调控序列的克隆与调控表达（论文文献综述）
于亚菲[1]（2021）在《WES筛选ITP致病基因和rhTPO影响ITP巨核产板的异质性研究》文中研究指明第一部分:利用全外显子组测序技术筛选ITP致病基因及亚组致病基因研究背景:原发免疫性血小板减少症（Immunethrombocytopenia,ITP）是一种病因尚未完全阐明的获得性出血性疾病。患者的共同特点是血小板计数低于正常参考值下限（100×109/L）,其临床表现具有异质性,患者可伴或不伴不同程度、不同部位的出血症状,近年来,乏力、焦虑甚至认知功能障碍等症状也逐渐引起重视。迄今为止,ITP的关键病因是免疫失耐受,导致血小板破坏增加或血小板产生不足。其中主要涉及体液和细胞免疫两大方面,涉及多种免疫细胞包括B细胞、T细胞、单核/巨噬细胞（Mφ）、树突状细胞（DCs）、间充质干细胞（MSCs）、髓系来源的抑制性细胞（MDSCs）等。目前已证实患者免疫系统对自身血小板表面膜糖蛋白失耐受,机体产生血小板表面膜糖蛋白特异性抗体致敏血小板,进而导致单核巨噬系统吞噬破坏血小板能力增强;ITP患者体内杀伤性CD8+T细胞对自身血小板失耐受,可直接裂解血小板;ITP患者血小板表面糖蛋白（GP）去唾液酸化增加,易被肝脏捕获吞噬等多种途径导致血小板的破坏加速。另一方面,多种免疫细胞、细胞因子及血小板抗体的异常导致巨核细胞增殖、成熟和凋亡障碍,最终导致血小板产生不足。随着对ITP发病机制更深入更全面的研究,ITP患者与正常人体内复杂交错的微观差异也逐步被揭示,涉及多种分子、细胞、器官、系统,因此寻找ITP最本质的差异,探索最源头的病因,也日渐成为ITP领域研究者的重点攻坚问题。全基因组测序（Whole Genome Sequencing,WGS）与全外显子组测序（Whole Exome Sequencing,WES）是目前DNA水平高通量测序的主要研究内容,人类基因组包含约31.6亿脱氧核糖核苷酸碱基对,其中外显子组占1-2%。加州大学圣克鲁兹分校（University of California Santa Cruz,UCSC）提供的 hg19 版本人类参考基因组中有entrez gene ID号的基因是23056个,虽然外显子在人类所有基因中所占的比例不足2%,但是它却包含约85%的已知致病突变。因此检测基因组中所有的外显子,即全外显子组测序,对于筛选与所研究疾病有关的致病突变具有重要意义。高通量测序技术自诞生以来已成功应用于多个科研领域,医学研究涉及广泛,如食管鳞癌基因组变异研究,多发性肺癌基因组异质性研究,同步双侧卵巢癌的异质性和克隆进化研究,外显子测序揭示肝细胞-胆管癌的进化及起源,单细胞转录组测序探究示踪造血干细胞形成过程等。基于急性髓细胞白血病（Acute myeloidleukemia,AML）的基因测序研究改写了 2016年WHO分型指南,急性白血病、骨髓增生异常综合征（MDS）等疾病都已有应用于临床的基因检测panel,而ITP方面目前尚未有测序相关研究报道,本研究首次探索ITP患者的基因组特点及变异信息,筛选与正常健康对照的基因差异,并且探究ITP患者内部的基因差异,包括骨髓巨核细胞数量相对正常与显着增多患者、rhTPO治疗有效与无效患者的基因差异,从而探索寻找ITP的致病突变基因以及ITP内部异质性的基因根源。研究目的:（1）描述与统计本研究中ITP患者基因组测序数据的基本变异特点。（2）探究ITP患者与正常对照全外显子组的差异,包括突变位点、结构变异,并进行有害性分析,筛选ITP患者共有突变基因,得出致病候选基因,并进行基因富集分析和蛋白质交互作用预测。（3）探究疾病亚组间的基因差异,亚组包括骨髓巨核异常增多与骨髓巨核大致正常ITP患者、对rhTPO治疗有效与无效的ITP患者,旨在揭示ITP患者间骨髓巨核差异以及对rhTPO治疗反应差异的基因根源。研究方法:（1）ITP患者与健康对照样本:严格按照纳入与排除标准,筛选ITP患者,匹配同年龄、同性别的健康志愿者,采集患者和健康志愿者外周血,记录患者病例信息资料。（2）外周血DNA全外显子组测序:提取外周血DNA,经DNA样品检测、建库捕获、库检、采用Illumina Novaseq 6000测序平台进行测序。（3）测序数据质量评估:将获得的原始测序数据（Rawdata）进行精细过滤,得到cleanreads,有效测序数据通过BWA比对到人类参考基因组（GRCh37/hg19）上,初始比对结果为BAM格式,然后用SAMtools软件对其排序,再用Sambamba进行重复数据标记,最后进行覆盖度、深度等统计。（4）生物信息分析:将过滤后的高质量序列比对到人类参考基因组上,检测样本变异,并利用ANNOVAR对变异进行注释。筛选ITP相关有害变异位点与基因的步骤包括:1)筛选高质量ITP差异位点与基因;2)根据已有数据库进一步筛选突变位点;3)ACMG突变位点有害性分类;4)结构变异有害性分析;5)ITP共有突变基因筛选;6)候选基因相关性排序;7)候选基因富集分析;8)蛋白相互作用分析。另外对ITP患者内部巨核细胞显着增多与相对正常者、rhTPO有效与无效者进行基因组外显子区差异分析。（5）分析结果验证:从测序、生信分析后得到的候选致病基因中随机挑选,提取患者外周血单个核细胞（PBMC）RNA反转录,从cDNA水平进行候选致病位点的Sanger验证,以确定突变位点确实影响到mRNA,并随机挑选部分基因对应的mRNA进行差异表达检测与分析。研究结果:（一）测序标本统计信息:纳入55例ITP患者及55例同年龄、同性别的健康对照者。1、ITP患者:中位年龄为39（范围:18-80）岁,基线中位血小板计数为11（范围:1-47）×109/L,男性21人,女性34人。2、健康对照者:中位年龄为39（范围:18-80）岁,基线中位血小板计数为185（范围:161-239）×109/L,男性21人,女性34人。（二）送检标本质控信息:55例ITP患者外周血提取DNA后经全外显子组测序获得平均原始数据量11.6±0.97 G,所有测序标本比对到参考基因组上的总reads数量比例均达到99.9%。目标区域的中位覆盖率为99.6%（范围:99.6-99.9%）,目标区域平均测序深度112.0±9.12 X。（三）ITP测序标本基因变异结果:（1）基因组上各分区单核苷酸变异（SNV）结果显示:内含子变异数目最多70788±4827,其次是外显子区域22002±151.6和基因间区域20545±2430。而编码区上不同类型SNV结果为同义突变最多11261±82.8,其次是错义突变10199±88.59。其余区域和类型数目相对较少。（2）基因组上各分区插入缺失变异（InDel）结果显示:内含子变异数目最多10322±752.3,其次是基因间区域3026±388.6和非编码RNA内含子区域818.3 ±72.54,外显子区域为613.3±17.79。而编码区上不同类型InDel结果为非移码缺失最多198.6 ± 10.03,非移码插入183.1±10.49,未知功能位点90.62 ±3.325,移码缺失 76.56±6.215,移码插入 58.16±4.803。（3）基因组上各分区拷贝数变异（CNV）结果显示:CNV总数目较少,其中CDS区相对最多,其余区域CNV基本可忽略不计。（四）基因组检测结果生信分析:本研究共得到总变异位点数目SNV 778643个,InDel 147859个,从测得的变异结果中去除人群高频的SNP,利用现有数据库,软件等,结合ITP血小板减少特点,进行再筛选,最终得到总SNV 15054个,总InDel 1900个,合并相同位点后共得到428个候选致病位点,342个候选致病基因,并注释出ACMG分类为致病的159个已知致病基因。经数据库筛选以及经55例正常对照筛选的共有候选基因富集分析显示卟啉与叶绿素代谢通路、抗坏血酸和醛酸代谢通路、甾体激素生物合成、戊糖和葡萄糖酸酯的相互转化、视黄醇代谢、药物代谢等KEGG信号通路在ITP患者与正常对照间存在显着差异。另外还进行了巨核异常增多与巨核相对正常ITP患者、rhTPO治疗有效与无效ITP患者差异基因的筛选。（五）分析结果验证:随机抽取342个候选致病基因中的FHOD1基因的6个候选致病位点,设计引物扩大样本至200例进行Sanger测序得到各个SNV的变异频率为:rs200317614（0.5%）,rs6499118（3.0%）,rs1 17880323（0.5%）,rs199924523（0.5%）,rs539519503（0.5%）,67264047（0.5%）。另外对部分随机抽取的 7 个候选基因进行RT-qPCR相对表达定量检测,发现3个基因在ITP患者与正常对照间表达有显着差异,包括MMP9、ERCC6、NFIB,其余4个基因表达量与正常人无显着差异,但表达量的标准差要大于正常对照组。研究结论:（一）在对测序结果进行质控筛选后确保质量可靠的前提下,ITP患者与正常对照基因组确实存在差异,基因组上SNV在内含子区最多,其次为外显子区,而InDel在内含子区也最多,其次为基因间区域,而CNV数目很少。（二）经测序和生信分析共得到428个外显子区候选致病位点,342个候选致病基因,其中ACMG分类为致病的为159个已知致病基因。对候选基因富集分析显示ITP与正常对照之间在多个代谢相关的KEGG信号通路存在显着差异。（三）巨核异常增多与巨核相对正常ITP患者、rhTPO治疗有效与无效ITP患者间也存在差异基因,这些差异为探究ITP患者内部巨核细胞的异质性以及预测rhTPO效果可能具有重要指导意义。第二部分:rhTPO影响血小板抗体阳性ITP巨核产板的异质性研究研究背景:原发免疫性血小板减少症（Immunethrombocytopenia,ITP）是一种以血小板计数持续减低为特征状态的获得性自身免疫性疾病。迄今为止,ITP的发病机制尚未完全阐明,其中心学说为“免疫失耐受”,体液与细胞免疫异常导致机体对自身血小板表面抗原失耐受从而加速血小板的破坏,免疫异常还影响巨核细胞的发育、成熟和凋亡产板,免疫系统对自身血小板及巨核的失耐受导致血小板破坏增加,生成减少,从而形成机体血小板持续减低的状态。血小板表面膜糖蛋白（Glycoprotein,GP）特异性抗体是攻击血小板的主要分子,70%的ITP患者血浆中可检测到该类抗体（以抗GPⅡb/Ⅲa或GPⅠb/Ⅸ为主）,抗体作为体液免疫的重要组成部分,也是ITP最早发现的发病机制,是ITP发病机制的关键部分。已有多项研究表明,抗GPⅡb/Ⅲa和抗GPⅠb/Ⅸ抗体对巨核细胞生成血小板具有不同影响:小鼠模型中发现,部分抗GPⅡb/Ⅲa抗体可以抑制巨核增殖,引起巨核数目减少,但抗GPIbα抗体对骨髓巨核计数影响较小;GPIbα可以影响血小板的体积,GPIbα敲除小鼠可以模拟巨血小板综合症,使其出现血小板增大和数量的减少。GPIbα胞内区域与细胞骨架细丝蛋白A相连接,调控生成血小板的大小,体外实验中发现,细丝蛋白A可以与PACSIN2（BAR/F-BAR蛋白的一种）相互作用,调控巨核胞内界膜系统生成,以及血小板内管状膜性结构生成。综合以往研究,抗GPⅡb/Ⅲa抗体主要阻碍巨核增殖,抗GPⅠbα抗体更多地影响血小板内部骨架结构,而TPO可特异性促进造血干细胞自我更新和增殖,还可以促进巨核祖细胞向巨核细胞的分化与增殖,rhTPO以及其他TPO-RAs已被证实可有效地促进ITP患者血小板提升,那么两种血小板抗体阳性ITP患者巨核产板障碍的情况是否都能被rhTPO纠正尚未阐明。研究目的:通过体外观察ITP患者血清在加入不同血小板表面膜糖蛋白纯化功能性抗体的作用下对巨核发育成熟、凋亡以及血小板生成的影响,以及探究rhTPO能否弥补或纠正这种影响,并通过体内动物实验,探究rmTPO对ITP小鼠在注射不同血小板表面膜糖蛋白功能抗体的作用下,恢复血小板水平的效果。为临床rhTPO应用前疗效预测提供基础研究依据。研究方法:（1）ITP患者和健康志愿者:收集外周血,无菌分离制备血清及血浆。（2）MAIPA检测:检测患者血浆两种血小板抗体的结果,并分组留取不同MAIPA结果患者的血清。（3）脐血诱导巨核细胞:采集健康的足月妊娠女性脐血80-100mL,无菌分离单个核细胞,并进一步磁珠分选CD34+细胞,培养基选择无血清培养基（Serum-Free Expansion Medium,SFEM）,其中加入重组人血小板生成素,重组人IL-3以及干细胞因子三种细胞因子,诱导培养脐血来源的CD34+细胞向巨核系方向分化。（4）体外细胞实验:第一部分:A组:抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性患者组,B组:抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性患者组,C组:抗体双阴组,D组:正常对照组。第二部分:A组:双阴血清对照组,B组:血清加抗GPⅡb抗体组,C组:血清加抗GPⅠbα抗体组,D组:血清加双抗体组。CD34+细胞经以上处理分组培养,14天后采用流式细胞术检测各组巨核细胞生成比例和凋亡比例、多倍体巨核比例和产血小板数量等指标,比较不同处理对巨核发育、成熟及产板的影响。14天后向第二部分各组加入rhTPO,继续培养14天,再次流式细胞术检测各组巨核细胞比例和凋亡比例、多倍体巨核比例以及产血小板数量等指标,比较rhTPO对不同组巨核发育、成熟及产板的影响。（5）体内动物实验:构建C57BL/6背景的ITP被动小鼠模型:A组:小鼠+抗GPⅡb功能抗体+rmTPO,B组:小鼠+抗GPⅡb功能抗体+等量生理盐水,C组:小鼠+抗GPⅠbα功能抗体+rmTPO,D组:小鼠+抗GPⅠbα功能抗体+等量生理盐水。每周采集并检测不同组ITP小鼠的血小板变化情况。研究结果:（1）不同MAIPA结果ITP患者与正常对照者血清TPO水平之间无显着差异。本研究共纳入41例ITP患者和8例正常对照者,对49例样本外周血贫血小板血浆（PPP）进行MAIPA检测,得到抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性患者13人（A组）,抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性患者8人（B组）,抗体双阴患者13人（C组）,抗体双阳患者7人（D组）,抗血小板抗体阳性检测率为68.3%（28/41）,8例正常对照者MAIPA检测结果为双阴性（E组）。ELISA检测该49例外周血血清TPO水平,按照MAIPA结果对5组TPO水平进行统计分析显示各组TPO水平之间无统计学差异（P>0.05）。（2）不同MAIPA结果ITP患者与正常对照者血清对脐血诱导巨核细胞和血小板生成的影响具有异质性。向脐血来源的CD34+细胞诱导巨核体系中,加入不同MAIPA结果的ITP或正常对照者的血清,分为A组:抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性患者组（n=13）,B组:抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性患者组（n=8）,C组:抗体双阴组（n=13）,D:正常对照组（n=8）。四组培养体系中细胞总数之间无显着差异,而CD61+细胞比例以及CD61+巨核细胞数量抗GPⅡb/Ⅲa与抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性组都显着低于正常对照组,而抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性组水平最低,还显着低于抗体双阴性组,而各组ITP患者相比正常对照组血小板释放都显着减少。（3）抗血小板GPⅠbα与GPⅡb特异性抗体对血清孵育脐血诱导的巨核细胞生成、成熟、凋亡和血小板生成的影响不同。向脐血来源的CD34+细胞诱导巨核体系中,加入血小板抗体双阴性ITP患者血清以及纯化的抗人CD41a（GPⅡb）和/或CD42b（GPⅠbα）功能抗体,分为A组:双阴血清对照组（n=10）,B组:血清加抗GPⅡb抗体组（n=10）,C组:血清加抗GPⅠbα抗体组（n=10）,D组:血清加双抗体组（n=10）。抗GPⅡb抗体组以及双抗体组CD61+细胞比例都显着低于抗体双阴性组,而≥4N多倍体巨核细胞比例双抗体组显着低于抗体双阴性组,各组巨核凋亡比例未见显着差异,加抗体各组血小板生成数量要显着低于抗体双阴组。（4）rhTPO对血清和血小板抗体孵育脐血诱导的巨核生成、成熟、凋亡和血小板生成的影响不同。脐血诱导巨核体系在与血小板抗体孵育后分为A组:双阴血清对照组（n=10）,B组:血清加抗GPⅡb抗体组（n=10）,C组:血清加抗GPⅠbα抗体组（n=10）,D组:血清加双抗体组（n=10）。再应用rhTPO,检测培养体系CD61+细胞比例,发现抗体双阴性组与加抗GPⅡb抗体组要显着高于加双抗体组,而相比于应用rhTPO之前,抗GPⅡb抗体组CD61+细胞比例提升较抗GPⅠbα抗体组显着增加,提高抗体双阳性组≥4N多倍体巨核细胞比例至与其他组无显着差异水平,各组巨核凋亡比例仍未见显着差异。培养体系血小板释放增加,但GPⅠbα抗体组与双抗体组仍显着低于双阴组,而GPⅡb抗体组提升至与双阴组无显着差异水平。（5）rmTPO对抗GPⅠbα抗体诱导的小鼠血小板减少的治疗作用效果不佳。A组:抗GPⅡb功能抗体+rmTPO,B组:抗GPⅡb功能抗体+NS,C组:抗GPⅠbα功能抗体+rmTPO,D组:抗GPⅠbα功能抗体+NS。A组血小板计数比B组显着增高,但C组与D组相比无统计学差异,说明rmTPO对抗GPⅡb抗体诱导的ITP小鼠模型血小板的提升显着,但对于抗GPⅠbα抗体诱导的ITP小鼠模型血小板的提升作用不佳。结论:（1）不同MAIPA结果ITP患者与正常对照者血清TPO水平之间无显着差异。（2）体外不同MAIPA结果ITP患者与正常对照者血清对脐血诱导巨核细胞和血小板生成的影响具有异质性,MAIPA阳性ITP患者与正常对照者相比巨核以及血小板生成显着受抑制,其中抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性ITP患者血清孵育的巨核细胞比例和数量最低,显着低于正常对照者和双阴性ITP患者。（3）体外抗GPⅡb抗体对血清孵育脐血诱导的巨核细胞生成数量影响较大,而抗GPⅠbα抗体可能对巨核细胞大小或成熟程度影响较大,两种抗体同时存在会显着降低≥4N多倍体巨核比例以及产板量。rhTPO的应用可以显着提升抗GPⅡb抗体组巨核细胞比例,并且提升双抗体组多倍体巨核比例。（4）体内小鼠模型也显示rmTPO对抗GPⅠbα抗体诱导的小鼠血小板减少的治疗作用效果不佳。第三部分:ITP患者血小板自身抗体特异性与对rhTPO反应性的相关性研究研究背景:原发免疫性血小板减少症（Immunethrombocytopenia,ITP）是一种获得性自身免疫性出血性疾病,其年发病率为2～5/10万成人,患者常有不同程度的出血症状。近年来,还发现乏力等症状也与ITP发病有关。糖皮质激素和静脉注射丙种球蛋白（intravenousimmunoglobulin,IVIG）目前仍然是我国成人ITP患者的一线治疗方案。然而,仍有15%～25%的患者对一线治疗无效,并且激素的长期使用甚至是不规范使用给ITP患者带来了严重的不良反应,因此,亟需寻找其他安全有效的ITP治疗药物。随着ITP患者巨核细胞生成障碍以及血小板产生不足的发病机制逐步被揭示,TPO受体激动剂类药物,包括rhTPO、艾曲泊帕、阿伐曲泊帕以及国外的罗米司亭等是近年来ITP领域的研究热点,并且大量高质量RCT研究证实其临床疗效可达60%～90%。而rhTPO作为我国的原研药,其应用于ITP也已近20年,具有大量丰富的临床应用数据,表现出良好的疗效性和安全性。但TPO-RAs与激素相比,价格更加昂贵,因此,寻找此类药物的获益人群,有针对性的个体化用药,对于提高ITP治疗效果,规避不良反应风险以及降低医疗费用具有重要意义。在ITP研究领域已有相关文献报道,ITP患者体内血小板自身抗体可以作为药物疗效的预测指标。改良单克隆抗体特异性俘获血小板抗原实验（modified monoclonal antibody specific immobilization of platelet antigen,MAIPA）是一种间接检测ITP患者血浆中游离抗血小板抗体的实验技术。其具有特异性较高,但灵敏度稍低的特点,是ITP辅助诊断的重要实验技术。已有多项基础和临床研究证实,抗GPIb/IX抗体阳性ITP患者对激素和IVIG的治疗反应不佳。目前国内外尚无研究证实,ITP患者体内血小板自身抗体与rhTPO治疗反应相关性的情况。研究目的:回顾性分析应用rhTPO的、一线治疗无效或复发的且检测过血浆血小板自身抗体的成人ITP患者,通过统计学分析,探究rhTPO疗效与自身抗体特异性的相关性,旨在寻找可以预测rhTPO疗效的指标,从而有益于ITP的个体化和精准治疗。研究方法:（1）患者入组:回顾性收集2010年8月至2019年4月山东大学齐鲁医院血液科入院患者信息。纳入标准:一线治疗无效或复发的ITP患者,入院应用rhTPO治疗,治疗前接受过血小板抗体检测。rhTPO治疗前至少4周未接受过其他ITP特异性治疗药物。排除标准:妊娠合并ITP患者等需排除。记录纳入患者基线统计学信息。（2）研究变量:MAIPA检测患者血浆血小板自身抗体。rhTPO用法用量为300U/kg皮下注射连续14天。总有效（OR）定义为:至少两次间隔7天及以上的血常规检测结果显示血小板计数大于30 × 109/L,并且至少高于两倍的基线血小板值且不存在出血症状。完全有效（CR）定义为:至少两次间隔7天及以上的血常规检测结果显示血小板计数大于100 × 109/L,并且至少高于两倍的基线血小板值且不存在出血症状。无效（NR）定义为:rhTPO治疗后,血小板仍低于30 × 109/L或仍存在出血症状。据此计算纳入患者起效时间（TTR）、总有效率（ORR）、完全有效率（CRR）等数据信息。（3）统计分析:根据变量为数值变量或分类变量选择统计分析方法,包括t检验、方差检验、非参数检验和卡方检验等,多组间的比较采用Bonferroni校正法,采用多因素logistic回归和析因设计分析全面评估可能影响rhTPO疗效的相关指标。P值为双侧检验,P<0.05被认为具有统计学意义。研究结果:（1）根据纳入和排除标准最终共有123例ITP患者纳入分析。女性72人,男性51人。中位年龄48（范围:16-92）周岁,中位病程3（范围0-368）个月,基线血小板中位值为8（范围0-37）× 109/L。58人抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性,其中单阳患者20人;50人抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性,其中单阳患者12人;38人抗体双阳性;53人抗体双阴性。（2）123人中有90人获得OR（73.2%）,其中53人为CR,37人部分有效。有效患者中位起效时间为7（范围2-13）天,抗GPIb/IX抗体阴性患者总有效率要显着高于抗体阳性患者:82.2%（60/73）vs.60.0%（30/50）,χ2=7.444,P=0.006。CR也具有同样的统计学差异趋势:47.9%vs.36.0%,χ2=5.448,P=0.020。而抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性或阴性患者的OR和CR均未见统计学差异。（3）多因素logistic回归分析显示年龄、性别、基线血小板值或抗GPⅡb/Ⅲa抗体都与rhTPO疗效无关,只有抗GPⅠb/Ⅸ抗体的存在与否与rhTPO疗效显着相关,抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性患者与其抗体阴性患者获得rhTPO反应的比值比为0.040（P=0.003,95%CI:0.005-0.336）,析因设计也同样证实抗 GPⅠb/Ⅸ 抗体是 rhTPO疗效的主要影响因子（F=12.826,P<0.001）。两种分析方法均表明两抗体间不存在交互作用。结论:（1）MAⅠPA检测血浆抗GPⅠb/Ⅸ阳性患者对rhTPO治疗反应差,而抗GPⅡb/Ⅲa抗体则无预测作用。（2）两种血小板抗体在影响rhTPO疗效方面无交互作用。（3）该研究提示rhTPO临床应用中,可优先推荐应用于抗GPⅠb/Ⅸ抗体阴性患者,这部分患者可能更获益。
梅舒翀[2]（2021）在《FAPα在骨髓间充质干细胞促进AML耐药中的作用及机理研究》文中研究指明研究背景:急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是威胁人类生命健康的常见血液系统恶性疾病。其治疗花费大,周期长,给患者及家庭造成巨大负担。尽管有新药不断涌现,化疗方案和治疗方法不断完善,目前除了急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia,APL）外,AML的长期预后仍未得到明显改善。临床治疗过程中多数AML患者易出现耐药、复发,对化疗药物失去敏感性,甚至出现原发性耐药,这是导致AML远期疗效不佳的重要原因之一。因此,深入研究AML的耐药机制,寻找新的肿瘤治疗靶点,破解AML耐药难题已成为当前的研究热点。不断有证据显示肿瘤细胞与肿瘤微环境之间的相互作用,是包括AML在内的肿瘤细胞发生耐药的重要机制之一。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stromal/stem cells,BMMSCs）是AML骨髓微环境中的重要细胞成分,其在保护AML细胞免受化疗药物诱导的凋亡中起到重要的作用,但是目前其保护机制尚未完全阐明。研究发现,在实体肿瘤中,BMMSCs能够被肿瘤细胞及其分泌的细胞因子趋化至实体肿瘤微环境中,在肿瘤细胞的“教育”下,与肿瘤细胞“共进化”,转变成为肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts,CAFs）,参与肿瘤的发生、耐药、侵袭转移、免疫逃逸以及调控肿瘤炎症微环境变化等。成纤维细胞活化蛋白α（fibroblast activation protein alpha,FAPα）被认为是CAFs的一个重要的功能分子标记。研究显示,FAPα在CAFs介导的肿瘤的耐药、发生发展以及免疫逃逸中起到重要的作用,且FAPα的表达水平与肿瘤的不良预后有关,因此FAPα成为肿瘤治疗的新靶点。既然BMMSCs能够被趋化至实体肿瘤微环境中,活化成为CAFs,参与CAFs的形成。那么,在血液系统恶性肿瘤微环境中,BMMSCs是否一样能够被活化成为CAFs?FAPα在介导BMMSCs促进AML抗化疗药物诱导的凋亡中起到了什么种作用,其机制是什么?FAPα能否成为破解AML耐药的新靶点?基于上述研究背景及目前存在的问题,我们开展了本项目相关研究。目的:探讨AML患者BMMSCs的FAPα的表达水平及临床意义,比较AML患者及健康对照组BMMSCs之间FAPα表达的差异。以及FAPα在介导BMMSCs保护AML抗Ara-C诱导的凋亡中的作用及可能的机制。研究方法:通过分离纯化获得初治AML患者以及健康对照者的BMMNCs,通过体外传代培养获得BMMSCs,并通过流式细胞术鉴定BMMSCs表面分子标记;采取流式细胞术、RT-q PCR及免疫荧光技术检测FAPα在BMMSCs中的表达水平。通过免疫组织化学染色检测骨髓活检组织FAPα的表达水平,随后分析AML患者骨髓活检组织FAPα表达水平与临床指标以及生存时间的相关性。最后通过小干扰（small interfering,si）RNA敲低BMMSCs的FAPα后,采取流式细胞术的方法检测阿糖胞苷（Ara-C）诱导的Kasumi-1细胞凋亡比例的变化,并通过Western Blot探讨其潜在的机制。结果:1、培养获得的BMMSCs粘附在培养瓶上,具有粘塑性,呈成纤维细胞样形态。流式细胞术检测传代至第二代的BMMSCs分子标记,显示CD14、CD34和CD45呈低表达,CD90和CD105呈高表达。2、初治AML患者和健康对照组BMMSCs的FAPα表达水平分别为:流式结果:（70.92±4.38%vs 36.74±10.37%;P=0.0072）,RT-q PCR结果:（24.75±2.75 vs.9.77±1.94;P=0.0001）。3、观察到在骨髓基质中呈棕黄色区域即为FAPα的阳性表达;AML骨髓活检组织FAPα的OD/area值明显高于健康对照组（11.88±4.55 vs.5.16±3.67;P=0.0001;n=15）。FAPα的OD/area值与流式细胞术检测到的骨髓中原始幼稚细胞比例呈正相关（r=0.878;P<0.0001）;在8例未接受化疗的患者中,FAPα的OD/area值与生存时间呈显着负相关（r=0.815;P=0.0137）。4、FAPα-si RNA组与NC-si RNA对照组相比,FAPα的m RNA相对表达量显着降低（0.11±0.01 vs 0.84±0.08;P=0.0001）,提示si RNA转染后可有效降低FAPα的表达。MSC-Mock组凋亡细胞比例与阿糖胞苷组相比明显降低（12.96±0.95 vs 25.66±1.54%;P<0.001;n=9）。FAPα-si RNA组中凋亡细胞的比例与NC-si RNA组相比显着增加（22.69±1.99 vs 13.29±1.10%;P<0.001;n=9）。FAPα-si RNA组凋亡细胞比例仍低于Ara-C组（22.69±1.99 vs 25.66±11.54%;P=0.001）。5、在没有加入BMMSCs的情况下,Ara-C组β-catenin的m RNA相对表达量为（113.20±2.77）,明显高于不含Ara-C组（44.02±0.06）（P<0.0001）。此外,在Ara?C和BMMSCs存在下,β?catenin在NC-si RNA组的m RNA相对表达量为（116.84±0.40）明显高于FAPα-si RNA组（82.11±1.26）,差异有统计学意义（P<0.0001）。6、在没有BMMSCs存在的情况下,加入β-catenin信号通路抑制剂XAV939对于Kasumi-1细胞的凋亡无明显影响。具体结果:Kasumi-1细胞+Ara-C组和Kasumi-1细胞+Ara-C+XAV939组的细胞凋亡比例分别为（25.66±1.54%）vs（26.32±1.00%）（P=0.2933）;在有BMMSCs存在的情况下,加入β-catenin信号通路抑制剂XAV939后,可以显着提高Kasumi-1细胞的凋亡比例。具体结果:Kasumi-1细胞+Ara-C+MSCs-NC-si RNA组和Kasumi-1细胞+Ara-C+MSCs-NC-si RNA+XAV939组的Kasumi-1细胞凋亡比例分别为（13.29±1.10%）vs（15.17±1.01%）（P=0.0017）。Kasumi-1细胞+Ara-C+MSCs-FAPα-si RNA组和Kasumi-1细胞+Ara-C+MSCs-FAPα-si RNA+XAV939组的Kasumi-1细胞凋亡比例分别为（22.69±1.99%）vs（24.69±0.95%）（P=0.015）。结论:1、AML患者的BMMSCs高表达CAFs的表型FAPα。2、FAPα在AML患者中高表达,可能在AML骨髓微环境中发挥重要作用;BM中FAPα表达水平增高可能是AML预后不良的一个因素。3、AML患者的BMMSCs能够保护AML细胞免受化疗药物诱导的凋亡,这种保护作用部分与FAPα表达上调有关,其机制是通过β-catenin信号通路介导的。
李坤[3]（2021）在《基于多组学和生物信息学的淋巴细胞分化发育研究》文中认为淋巴细胞是具有重要免疫功能的白细胞,对于机体抵抗感染、清楚衰老细胞和防止肿瘤发生至关重要,因此对于淋巴细胞的研究一直是生命科学研究的热点。在淋巴细胞中NK细胞和T细胞分别在固有免疫和适应性免疫中发挥杀伤和免疫调节作用,同时基于NK细胞和T细胞的免疫疗法在疾病治疗中取得的良好效果,使得NK细胞和T细胞的研究愈发的重要。而对于NK细胞和T细胞分化发育的研究可以帮助我们正确理解NK细胞和T细胞的分化发育过程,对了解免疫系统的组成,免疫系统紊乱时疾病的发生以及疾病的治疗具有重要意义。此前技术的不完善严重阻碍了对NK细胞和T细胞分化发育的研究,随着多种组学测序技术的发展和完善我们可以更加全面地研究NK细胞和T细胞的分化发育。但是目前NK细胞和胸腺T细胞的分化发育过程并不是十分清楚,了解NK细胞和胸腺T细胞的分化发育过程可以为淋巴细胞的发育研究提供新的见解,并促进基于NK细胞和T细胞的免疫疗法的发展。整合多种组学技术对于增进我们对人类疾病和生物学的理解至关重要,因此本文希望利用Microarray,scRNA-seq,ATAC-seq,scATAC-seq 等多组学技术,整合转录组学和表观基因组学等多种生物信息学方法研究NK细胞和胸腺T细胞发育过程的转录调控网络,挖掘调控转录过程的重要的转录因子,并揭示发育过程中未曾揭示的重要的生物学过程。本论文内容主要分为两个部分。在第一部分工作中,我们首先在体外诱导NK细胞分化的不同阶段收集样品进行ATAC-seq建库测序,经过质量控制获得了高质量的ATAC-seq数据,并利用这些数据描述了 NK细胞分化过程中染色质可及性图谱。我们共发现6401个差异的染色质开放位点,对这些差异位点进行聚类分析发现NK细胞分化过程中表观调控元件的开放可以分为前后两个阶段,其中一些已知的调控NK细胞发育的基因也在相应的阶段富集,比如STAT5A在前期富集,在后期调控NK细胞发育的基因TBX21在后期富集。对这些差异性的调控元件进行功能富集分析发现,在前期开放的位点大多富集磷酸化等维持机体正常生命活动相关的功能,而在后期开放的位点则会参与免疫系统的构建等免疫反应相关的过程,说明在后期开放的这些调控元件伴随着基因的表达来调控NK细胞的发育。随后基于这些表观调控元件我们利用HOMER和Genomica富集了调控NK细胞分化不同阶段的转录因子。利用这些富集的转录因子及其基因的表达,我们构建了NK细胞分化过程中的转录调控网络并描述了转录调控网络随着NK细胞发育动态变化的过程。最后我们发现除已知的转录因子以外,FOSL2和EGR2在NK细胞分化过程中显着富集并且他们调控的基因会富集免疫反应相关的功能,暗示FOSL2和EGR2会调控NK细胞的分化,随后我们通过敲低实验证明FOSL2和EGR2确实会影响NK细胞的分化和成熟。在第二部分工作中,首先我们利用流式细胞术从小鼠胸腺中分选得到CD45阳性的淋巴细胞,之后通过10X Genomics建库并测序后得到单细胞RNA-seq数据。该数据包括1986个细胞,平均每个细胞可以检测到1784个基因。通过对单细胞RNA-seq数据进行分群和细胞类型注释,我们一共得到15个细胞亚群,分别对应于胸腺T细胞发育的DN、DP、CD4单阳性和CD8单阳性等不同阶段,以及一些抗原呈递细胞和非传统的淋巴细胞,并且利用假时间分析描述了胸腺T细胞的发育过程。其次我们通过单细胞RNA-seq和单细胞ATAC-seq的整合分析揭示了调控T细胞发育的转录因子,除了已知的转录因子在其发挥功能的阶段富集外,我们也发现了一些新的转录因子的富集。并且根据这些富集的转录因子及其调控的差异表达的基因,我们构建了胸腺T细胞发育过程的转录调控网络。随后我们发现Ly6d和CD2这两个表面marker可以将DP细胞分选为更为精细的细胞亚群。通过精细的分群我们也发现了一些胸腺T细胞发育过程中未曾揭示的现象:（1）DP细胞独特的增殖方式:DPbla细胞的分化伴随着有丝分裂同时进行,DPbla细胞的增殖能力明显减弱并且在分裂结束后倾向于退出有丝分裂。而DPbla细胞增殖能力减弱可能是导致青春期后胸腺T细胞不断减少的原因。（2）除了传统上认为的胸腺上皮细胞,胸腺T细胞本身也可以作为抗原提呈细胞为T细胞的发育提呈抗原,我们通过免疫荧光发现胸腺细胞之间确实存在免疫突触,证明胸腺细胞确实可以作为抗原呈递细胞促进CD8细胞的选择过程。最后,我们下载并分析了人类胸腺细胞的单细胞数据,通过跨物种比较分析揭示了人和鼠在转录水平上的差异并结合ChIP-seq数据发现Gata1可能调控这些物种之间的转录差异。
李骏[4]（2020）在《p75NTR对牙周膜干细胞骨向分化潜能的影响及其机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）是一种牙源性的间充质干细胞,由Seo等于2004年首次从人牙周膜组织中鉴定并分离得到。研究显示,PDLSCs具有良好的自我更新能力和多项分化潜能,可分化为成骨细胞、成纤维细胞、成牙骨质细胞等特殊的细胞类型。进一步的证据表明PDLSCs还具备一定的免疫调节功能和较低的免疫原性,易于从乳牙、阻生的第三磨牙或正畸拔除的前磨牙中获取,在骨组织工程中具有广阔的应用前景。然而,PDLSCs作为一个复杂而异质性的群体,即使在相同条件下也可能反映出不同的生物学特性,这限制了其作为干细胞的应用。在牙齿的发生发育过程中,起源于颅神经嵴（cranial neural crest,CNC）的外胚间充质干细胞（ectomesenchymal stem cells,EMSCs）迁徙并分化为各种间充质细胞系,最终形成牙髓、牙本质、牙骨质和牙周膜。有学者认为,在牙齿发育完成后,部分CNC源性的祖细胞会留存在牙周膜中,成为PDLSCs中一个更加始祖的亚群;而更精准地分离出这个亚群将促进PDLSCs在未来成功应用于临床治疗。p75神经营养因子受体（p75neurotrophin receptor,p75NTR）是一种高度保守的跨膜的神经营养因子/神经营养因子前体蛋白受体,属于肿瘤坏死因子受体超家族。p75NTR的作用并不局限于神经系统,其在非神经组织的发育和分化过程中也具有多重生物学功能。此外,p75NTR在CNC来源的干细胞中高表达,被认为是CNC源性干细胞的一种特异性表面标志物。在前期研究中,本课题组以p75NTR为细胞表面标志物从大鼠体内分离出CNC源性的p75NTR+EMSCs,发现其具有优良的多向分化潜能;不仅如此,p75NTR还参与了EMSCs成骨分化的正向调控。然而,基于p75NTR表达分选PDLSCs的研究报道较少,p75NTR对PDLSCs生物学特性的影响及其作用机制也尚不清楚。本研究旨在利用p75NTR作为细胞表面标志物分选人PDLSCs,观察p75NTR对PDLSCs再生潜能的影响并进一步探讨其中的潜在机制。我们希望找到一种优化的细胞表面标志物来鉴定和纯化PDLSCs,从而促进其在骨组织工程中的应用。方法:第一部分:PDLSCs的p75NTR流式分选经医院伦理委员会批准及患者知情同意后,收集18至25周岁接受正畸治疗的患者拔除的健康前磨牙,刮取牙周膜组织,采用酶消化法收集原代PDLSCs并进一步体外培养至第3代细胞。以p75NTR为细胞表面标志物,用荧光激活细胞分选术分选PDLSCs并收集p75NTR+PDLSCs和p75NTR-PDLSCs。选取第4代p75NTR+、p75NTR-和未分选PDLSCs,用流式细胞术检测三种细胞表面p75NTR和间充质干细胞相关表面标志物的表达,并用免疫荧光验证三种细胞中p75NTR的表达。第二部分:p75NTR+、p75NTR-和未分选PDLSCs生物学特性的研究选取第4代p75NTR+、p75NTR-和未分选PDLSCs:（1）常规培养10d后,用结晶紫染色观察三种细胞的克隆形成单位,计算其克隆形成率。（2）常规培养7d,每天用CCK-8法检测三种细胞的增殖能力。（3）用流式细胞术检测三种细胞的凋亡率。（4）成脂诱导21d后,用油红O染色观察三种细胞的成脂分化水平。（5）成软骨诱导21d后,用阿利新蓝染色观察三种细胞的成软骨分化水平。（6）成骨诱导7d和21d后,分别用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和茜素红染色观察三种细胞的成骨分化水平。（7）成骨诱导前及成骨诱导7d后,分别用荧光定量逆转录聚合酶链反应（fluorescent quantitation reverse transcription-polymerase chain reaction,q RT-PCR）和Western blot检测三种细胞中p75NTR、ALP和Runt相关转录因子2（runt related transcription factor 2,RUNX2）的m RNA和蛋白的表达。第三部分:p75NTR+、p75NTR-和未分选PDLSCs的RNA测序（RNA Sequencing,RNA-seq）和差异分析选取第4代p75NTR+、p75NTR-和未分选PDLSCs,常规培养3d后收集三种细胞的总RNA。经RNA质检、文库构建与质检、Illumina测序、测序数据质控、基因定量分析后,用DESeq2软件对数据进行统计学分析,得到三种细胞的差异基因表达谱,并进一步用Cluster Profiler软件对p75NTR+和p75NTR-PDLSCs中的差异表达基因进行富集分析,筛选出存在差异的关键信号通路。最后,从差异基因表达谱中选择五种与该信号通路相关的基因:层粘连蛋白α1（laminin alpha 1,LAMA1）、Ⅳ型胶原蛋白α1（collagen typeⅣalpha 1,COL4A1）、整合素α1（integrin alpha 1,ITGA1）、整合素α7（integrin alpha7,ITGA7）及整合素α8（integrin alpha 8,ITGA8）,用q RT-PCR检测其m RNA的表达,验证RNA-seq的结果。第四部分:p75NTR通过ITGA1优化PDLSCs骨向分化潜能的机制探讨选择ITGA1作为p75NTR+和p75NTR-PDLSCs中与成骨分化有关的关键差异表达基因。选取第4代p75NTR+PDLSCs:（1）利用小干扰RNA转染沉默细胞中的ITGA1,并用免疫荧光验证沉默效果。（2）ITGA1沉默后对细胞成骨诱导3d,用ALP染色观察其骨向分化水平的变化,用q RT-PCR检测其ITGA1、p75NTR、ALP、RUNX2、ITGA7、ITGA8、LAMA1及COL4A1 m RNA的表达,用Western blot检测其ITGA1、p75NTR、ALP及RUNX2蛋白的表达。选取第4代p75NTR-PDLSCs:（1）利用腺病毒转染过表达细胞中的ITGA1,并用免疫荧光验证过表达效果。（2）ITGA1过表达后对细胞成骨诱导3d,用ALP染色观察其骨向分化水平的变化,用q RT-PCR检测其ITGA1、p75NTR、ALP、RUNX2、ITGA7、ITGA8、LAMA1及COL4A1 m RNA的表达,用Western blot检测其ITGA1、p75NTR、ALP及RUNX2蛋白的表达。结果:第一部分:流式分选结果显示:PDLSCs中p75NTR+PDLSCs的比例为0.99%±0.38%,p75NTR+、p75NTR-和未分选PDLSCs的形态未见明显差异,大部分呈梭形,具有MSCs的外形特征。分选后的流式细胞表型鉴定结果显示:p75NTR+PDLSCs中p75NTR的表达率为60.59%,而p75NTR-和未分选PDLSCs中p75NTR的表达率分别为0.55%和1.31%;三种细胞均高表达人MSCs阳性表面标志物（CD44/CD73/CD90/CD105）,且均低表达人MSCs阴性表面标志物（CD45/CD34/CD11b/CD19/HLA-DR）。免疫荧光结果显示:p75NTR+PDLSCs中p75NTR的荧光强度高于p75NTR-和未分选PDLSCs。第二部分:p75NTR+、p75NTR-和未分选PDLSCs的结晶紫染色结果显示三种细胞的克隆形成率未见明显差异。CCK-8检测结果显示三种细胞连续7天的增殖能力未见明显差异。流式细胞术检测结果显示三种细胞的凋亡率未见明显差异。油红O和阿利新蓝染色结果显示三种细胞均能向成脂肪细胞或成软骨细胞分化。ALP和茜素红染色结果显示三种细胞均能向成骨细胞分化,且p75NTR+PDLSCs的骨向分化水平强于p75NTR-和未分选PDLSCs。q RT-PCR和Western blot检测结果显示:在成骨诱导前,p75NTR+PDLSCs中p75NTR m RNA和蛋白的表达高于p75NTR-与未分选PDLSCs,而三种细胞中ALP和RUNX2 m RNA和蛋白的表达未见明显差异;在成骨诱导7d后,三种细胞中p75NTR、ALP和RUNX2 m RNA和蛋白的表达均升高,且p75NTR+PDLSCs中p75NTR、ALP和RUNX2 m RNA和蛋白的表达高于p75NTR-和未分选PDLSCs。第三部分:RNA-seq结果显示:p75NTR+与p75NTR-PDLSCs相比有713个基因上调,754个基因下调;p75NTR+与未分选PDLSCs相比有458个基因上调,410个基因下调;p75NTR-与未分选PDLSCs相比有214个基因上调,196个基因下调。KEGG通路分析显示:p75NTR+和p75NTR-PDLSCs中的差异表达基因涉及多条信号通路,其中ECM-receptor interaction信号通路可能与PDLSCs的成骨分化密切相关。q RT-PCR检测结果显示:p75NTR+PDLSCs中ITGA1、ITGA7、ITGA8、LAMA1及COL4A1 m RNA的表达均高于p75NTR-PDLSCs,与RNA-seq结果一致。第四部分:在p75NTR+PDLSCs中沉默ITGA1后,免疫荧光结果显示其ITGA1的表达降低。ALP染色结果显示其骨向分化水平减弱。q RT-PCR检测结果显示其ITGA1、p75NTR、ALP及RUNX2 m RNA的表达降低,但其ITGA7、ITGA8、LAMA1及COL4A1m RNA的表达未见明显变化。Western blot检测结果显示其ITGA1、p75NTR、ALP及RUNX2蛋白的表达降低。在p75NTR-PDLSCs中过表达ITGA1后,免疫荧光结果显示其ITGA1的表达升高。ALP染色结果显示其骨向分化水平增强。q RT-PCR检测结果显示其ITGA1、p75NTR、ALP及RUNX2 m RNA的表达升高,但其ITGA7、ITGA8、LAMA1及COL4A1 m RNA的表达未见明显变化。Western blot检测结果显示其ITGA1、p75NTR、ALP及RUNX2蛋白的表达升高。结论:1、p75NTR可用于分选PDLSCs以获取CNC源性的干细胞亚群。2、p75NTR+PDLSCs较p75NTR-和未分选PDLSCs具备更高的骨向分化潜能。3、p75NTR+和p75NTR-PDLSCs中的差异表达基因涉及ECM-receptor interaction信号通路,且p75NTR+PDLSCs较p75NTR-PDLSCs表达更高水平的ITGA1。4、ITAG1作为ECM-receptor interaction信号通路中的关键受体,在成骨诱导的环境下,可以正向调控PDLSCs的成骨分化。综上所述,本研究首次证实p75NTR可用于分离骨向分化潜能较好的同质的PDLSCs。此外,p75NTR可以通过ECM-receptor interaction信号通路上调ITGA1的表达并优化PDLSCs的骨向分化潜能,提示p75NTR可以作为一种新的细胞表面标志物来识别和纯化PDLSCs,并促进其在骨组织工程中的应用。
马文兵[5]（2020）在《GPS2通过稳定EKLF促进红系分化》文中研究指明造血干细胞分化成熟为具有功能的红细胞是一个复杂的过程,涉及到众多的细胞事件,如谱系决择、形态结构改变、细胞代谢变化以及周期调控等。红系分化过程受到细胞外信号、细胞内转录调控以及染色质组表观遗传变化等的协同调控,其调控异常往往会导致贫血、白血病等多种疾病的发生。因此,研究红系分化调节机制对认识细胞分化调控过程及红系分化失调相关疾病具有重要意义。GATA-1（GATA binding protein 1）、EKLF/KLF1（Erythroid Krüppel-like factor）等转录因子在红系分化调控中发挥了关键的作用。多种蛋白质通过影响它们的翻译后修饰、蛋白质相互作用、DNA结合及转录活性等参与红系分化调控。GPS2（G protein pathway suppressor 2）是一种广泛参与炎症、代谢、免疫的多功能蛋白质,它在红系分化过程中的作用尚未见报道。本论文采用GPS2敲除小鼠模型及人原代CD34+细胞模型研究了GPS2在红系分化中的作用,我们的结果表明GPS2通过稳定EKLF蛋白在红系分化中发挥了重要作用,是一种新的红系分化调节因子。主要结果包括:1.Gps2-/-小鼠E12.5胚胎呈现发白、肝脏小等典型胚胎造血发育障碍表型。Gps2-/-小鼠E12.5胚胎肝脏总细胞数及Ter119+细胞明显减少。流式分析和瑞氏吉姆萨染色结果表明GPS2缺失导致小鼠胚胎红系发育不良,其特征符合红系终末分化障碍的表型。2.对CD34+细胞体外红系诱导,GPS2表达水平显着上调;在CD34+细胞中下调GPS2表达导致诱导红系分化障碍,表现为CD71+GPA+细胞亚群及联苯胺染色阳性细胞比例降低、红系成集落能力下降、红系相关基因表达下调及G0/G1期阻滞等异常;GPS2下调的CD34+细胞也在移植小鼠体内表现为红系分化的障碍。这些证据进一步证明了GPS2调控红系分化的作用,并说明这种作用可能在人类红系分化调控中同样重要。3.GPS2能够和EKLF发生相互作用,抑制蛋白酶体对EKLF的降解,从而提高EKLF稳定性,但GPS2并不改变EKLF泛素化水平。在鼠红白血病细胞（MEL）细胞和人脐带血CD34+细胞中的结果显示,GPS2促进红系分化依赖EKLF,但并不依赖NCOR1（nuclear receptor corepressor 1）。缺失NCOR1结合结构域（aa1-110）,GPS2依然能够促进红系分化;而缺失EKLF相互作用结构域（aa111-150）,GPS2促进红系分化效应丧失。回补EKLF能够挽救敲低GPS2导致的红系分化的阻滞。值得注意的是,我们发现了GPS2结合在EKLF aa191-230区域,该区域是一段物种间高度保守区域,对于EKLF自身稳定性至关重要,该发现有可能为EKLF突变导致的造血失调提供合理的解释。EKLF是一个非常关键的红系转录因子,其敲除或突变可导致严重的红系分化障碍。EKLF的功能受到多种方式的调控,但其蛋白质稳定性的调控,特别是稳定性与红系分化的关系还少见报道。近年来,EKLF与人类红系分化障碍疾病的关系受到广泛的关注,EKLF的多种突变体在不同的疾病被发现,其中一些突变体显着影响了细胞内EKLF的蛋白质水平。因此,我们的研究不仅发现了一种新的红系分化调节因子,并为揭示与EKLF相关的血液疾病的发病机制提供了新的思路。
杨最[6]（2020）在《地中海贫血症红细胞谱系发育分化基因筛查及机制研究》文中研究说明地中海贫血症是世界上最常见和发生率最高的一种单基因遗传病。目前临床上地中海贫血症没有可以普遍推广的根治方法。产前诊断在地中海贫血症的预防上有重要贡献。由于产前诊断技术的局限,导致地中海贫血症稀有突变类型不能被检测,不能完全避免地中海贫血症患儿出生。而外显子测序技术有可能弥补这一缺点,因此我们运用外显子测序技术对地中海贫血症基因携带者羊水样本进行检测,既能验证临床产前诊断结果,同时也是为了发现新的变异位点。我们通过外显子测序筛选出1344个共有变异位点。通过对这些共有变异位点进行GO富集分析筛选了26个term,涵盖膜的整体成分、跨膜信号受体活性、细胞外基质结构成分、钙离子结合等;通过KEGG富集分析筛选了13条信号通路,包括糖酵解/糖异生、ECM受体相互作用、补体与凝血级联反应等。这些基因和信号通路可能与地中海贫血症的发病机制密切相关,其结果需要进一步验证。另一方面,珠蛋白基因缺陷影响红细胞发育过程。红细胞的发育起源于造血干细胞,对造血干细胞的机理研究是根治地中海贫血症等一系列血液疾病的潜在突破口。我们利用磁珠分选和流式分选的方法从脐带血样本分离纯化CD34阳性细胞,在体外运用多种细胞因子成功对造血干细胞进行诱导分化,为体外培养造血干细胞模拟体内的造血过程奠定基础。
许小宇[7]（2020）在《FUS-ERG融合基因阳性AML的分子特征和发病机制研究》文中研究表明一、FUS-ERG融合基因阳性AML的临床特征目的:回顾性分析苏州大学附属第一医院血液科诊断和治疗的7173例AML患者,根据细胞遗传学和融合基因检测的不同结果,分析不同融合基因阳性AML患者的临床特征、细胞遗传学特点以及生存预后的差别。方法:1.完善苏州大学附属第一医院血液科诊断和治疗的AML患者基本信息的采集,系统性分析全部AML患者临床及细胞遗传学特征。2.根据融合基因和细胞遗传学的检测结果,比较不同融合基因亚型AML患者的临床特点及差异。3.详细分析FUS-ERG融合基因阳性AML患者的临床、实验室分子以及预后生存特点。结果:1.7173例AML患者的细胞遗传学特点:正常核型患者3025人,占42.1%;染色体核型未检测或者检测结果丢失的患者占6.5%（463/7173）;2.4%（172/7173）的患者染色体核型分析结果显示未见细胞分裂相;49%（3156/7173）的患者染色体核型存在异常,其中 t（15;17）,t（8;21）,inv（16）,t（9;22）分别占 12.3%（884）,11.2%（809）,1.8%（129）,1.4%（103）。2.从2006年起对初诊AML患者进行融合基因检测,共有3984例患者纳入本研究,结果提示融合基因阴性的患者2492例,占62.6%,AML1-ETO,PML-RARa,CBFb-MYH11,BCR-ABL,MLL 重排分别占 12.6%（500）,13.2%（527）,5.0%（198）,1.8%（71）,3.8%（152）。其他少见类型的融合基因有 DEK-NUP214（17）,FUS-ERG（10）,NPM-MLF1（3）和AML1-MTG16（2）。我们对不同融合基因阳性AML患者的临床特征进行分析,发现FUS-ERG融合基因阳性AML患者的发病年龄相对较小,中位发病年龄为24.5岁（8-52岁）,与其他融合基因组年龄的差异存在统计学意义（p<0.001）,但是检测到的FUS-ERG融合基因阳性的病例数仅为10人,样本数少统计结果可能存在偏差。3.搜集到FUS-ERG融合基因阳性的患者共38例,其中34例为AML患者,占全部AML患者的0.47%（34/7173）,3例为急性淋巴细胞白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia,ALL）以及 1 例急性混合细胞白血病（Mixed-Phenotype Acute Leukemia,MPAL）。对AML患者进行了随访调查,发现FUS-ERG融合基因阳性AML患者的早期死亡（6月内死亡）患者达到17.6%（6/34）,一疗程诱导缓解率（complete response,CR）为64.7%（22/34）;AML患者中有17例患者进行了造血干细胞移植治疗,发现造血干细胞移植组患者与单纯化疗组患者的总生存率和无事件生存率的存在统计学差异（p=0.0075,p=0.021）,移植组患者的预后相对较好;但是移植患者移植后的复发率达到41.2%（7/17）,复发患者的治疗效果极差。结论:1.苏州大学附属第一医院血液科AML患者的临床特征和细胞遗传学特点与国际上的报道相类似,染色体核型正常的患者约占42.1%;49%的AML患者染色体核型存在异常,其中 t（8;21）,t（15;17）,inv（16）,t（9;22）分别占 11.2%,12.3%,1.8%,1.4%。2.进行融合基因检测的3984例AML患者,结果提示融合基因阴性的患者占62.6%,AML1-ETO,PML-RARa,CBFb-MYH11,BCR-ABL,MLL 重排阳性分别占12.6%,13.2%,5.0%,1.8%,3.8%;其他少见类型如FUS-ERG融合基因阳性AML患者的发病年龄较小,中位发病年龄24.5岁（8-52岁）,与其他融合基因阳性AML患者中位年龄的差异存在统计学意义（p<0.001）。3.0.47%的AML患者可检测到FUS-ERG融合基因,但是FUS-ERG融合基因阳性的患者一共38例,其中34例AML,1例MPAL和3例ALL。在AML患者中,患者早期死亡患者达到17.6%;17患者进行造血干细胞移植治疗,移植患者的复发率达到41.2%（7/17）,此类患者的生存预后极差。二、FUS-ERG融合基因阳性患者的分子特征目的:通过全外显子测序技术（Whole exon sequencing technology,WES）,全转录组测序（Whole transcriptome sequencing technology,RNA-sequencing）及二代测序技术（next generation sequencing technology,NGS）揭示 FUS-ERG 融合基因阳性 AML 患者的分子生物学特征,并初步探讨其可能的致病机制。方法:1.回顾性分析苏州大学附属第一医院血液科诊断的AML患者的细胞遗传学和分子生物学数据,筛选FUS-ERG融合基因阳性AML患者为研究对象,搜集FUS-ERG融合基因阳性AML患者的DNA或者RNA标本。2.通过WES对10例初诊FUS-ERG融合基因阳性AML患者的DNA标本进行基因突变检测,寻找共同伴随基因突变特征。3.通过RNA-sequencing对10例初诊FUS-ERG融合基因阳性AML患者的RNA标本进行基因表达和融合基因的检测,分析FUS基因和ERG基因断裂融合方式,以正常核型和其他类型AML患者作为对照,分析FUS-ERG融合基因阳性AML患者的基因表达特征及与其他类型AML患者的基因表达差异,寻找FUS-ERG融合基因可能的致病机制。4.采用包含51个血液肿瘤相关基因的靶向NGS,对13例初诊FUS-ERG融合基因阳性AML患者的DNA标本进行基因突变检测,进一步揭示其基因突变特征。结果:1.搜集到10例FUS-ERG融合基因阳性AML患者的初诊骨髓细胞DNA标本进行全外显子测序,分析测序结果显示:出现6次以上的重现性突变基因有RPL14、MUC4、LNP1、CAMKK2、FADS6、NBPF14,未检测到常见的 AML 基因突变。2.搜集到10例FUS-ERG融合基因阳性AML患者的初诊骨髓细胞RNA标本进行RNA-sequencing检测,分析这组病人和正常核型急性髓系白血病患者基因表达差异,FUS-ERG融合基因阳性AML患者显着上调的通路有肿瘤信号转导通路、PI3K-Akt信号转导通路以及Rap1超RAS信号转导通路;通过和其他类型的AML患者的基因表达的GSEA分析,发现两者存在差异信号通路是主要是代谢相关通路:包括抗环血酸和醛酸代谢通路,半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路以及组氨酸代谢通路。3.搜集到13例FUS-ERG融合基因阳性AML患者的初诊骨髓细胞DNA标本进行靶向NGS测序,一共检测到20个基因突变,其中PTPN11激活性突变出现次数最多,频率为30.8%（4/13）,其次是WT1突变,推测PTPN11突变可能对疾病的发生进展起到重要的作用。结论:通过和其他类型的急性髓系白血病患者的基因表达的GSEA分析,发现两者存在差异的通路主要是代谢相关通路:包括抗环血酸和醛酸代谢通路,半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路以及组氨酸代谢通路。血液肿瘤相关基因的二代靶基因深度测序共检测到20个基因突变,其中PTPN11激活性突变出现次数最多（4/13）,推测PTPN11激活性突变可能对疾病的进展起重要作用。三、FUS-ERG融合基因的致白血病机制研究目的:应用体外和体内实验模型,阐述FUS-ERG融合基因的致白血病机制。方法:1.构建FUS-ERG融合基因过表达慢病毒质粒载体,三质粒系统包装慢病毒,分别在HL-60以及32D细胞株中稳定过表达,探究FUS-ERG融合基因在体外细胞株中对细胞增殖、凋亡以及分化的作用。2.构建逆转录病毒表达载体,转染人脐血CD34阳性的细胞,流式分选CD34+GFP+细胞,进行原代细胞克隆形成和液体培养髓系诱导分化实验,观察克隆数目和类别的差异,以及其对原代细胞分化能力的影响。3.构建慢病毒过表达载体,将PTPN11-WT、PTPN11-D61V、PTPN11-E76K突变体分别在32D-Venus与32D-FUS-ERG细胞中过表达,研究PTPN11-WT及突变体对细胞增殖和分化能力的作用。4.构建慢病毒过表达载体,转染Balb/c小鼠骨髓CD117阳性细胞,胫骨原位移植到同种Balb/c小鼠骨髓内,观察移植后小鼠的发病情况。5.构建Vav-1为启动子的FUS-ERG融合基因敲入小鼠模型,观察小鼠的发病情况。结果:1.成功构建FUS-ERG融合基因慢病毒表达载体,感染人白血病细胞株,研究结果显示FUS-ERG融合基因可导致HL-60细胞增殖增多和凋亡减少,亦可以引起32D细胞分化阻滞。2.成功分选脐血中CD34阳性细胞,感染逆转录病毒,研究结果显示FUS-ERG融合基因可引起脐血细胞克隆形成能力增加,多潜能集落形成单位比例增加,髓系成熟分化阻滞,流式细胞学检测细胞阻滞在干祖细胞及早幼粒细胞阶段。3.在体外,FUS-ERG融合基因可协同PTPN11激活性突变,引起PI3K-AKT信号通路激活,导致32D细胞增殖能力显着增加以及髓系成熟分化阻滞,促使下游基因HIF-1a、IKKa、Casp9 基因的下调。4.在小鼠骨髓移植模型体内实验中,检测移植后小鼠的生存情况,结果显示FUS-ERG融合基因移植小鼠全部死亡,载体对照组小鼠仅死亡一只,两组小鼠总生存率存在显着的统计学差异（p=0.075）。小鼠进行流式细胞学以及病理切片HE染色观察,结果显示单独FUS-ERG融合基因可导致移植小鼠发病,但是小鼠疾病的发生骨髓原始细胞增多,同时表达CD3和/或ter1 19的阳性细胞,发病形式不统一,此和临床上FUS-ERG融合基因的疾病发生类型相似。结论:1.FUS-ERG融合基因可导致HL-60细胞增殖能力增加,细胞凋亡减少;亦可以引起32D细胞髓系成熟分化阻滞。2.FUS-ERG融合基因引起脐血细胞克隆形成能力增加,髓系成熟分化阻滞,分化阻滞在干祖细胞及早幼粒细胞阶段。3.FUS-ERG融合基因协同PTPN11突变,引起PI3K-AKT信号通路激活,导致32D细胞增殖能力增加和髓系分化阻滞,下游HIF-1a、IKKa、Casp9基因下调。4.单独FUS-ERG融合基因可导致移植小鼠发病,但是小鼠疾病的发生类型多样,此结果和临床上FUS-ERG融合基因的发生白血病的类型相似。
李泊涵[8]（2020）在《树突状细胞在移植物抗宿主病中的亚群变化及调控机制初探》文中提出目的:许多研究表明造血干细胞移植后的移植物抗宿主病的发生与树突状细胞的免疫重建有着明显的相关性,然而关于供体树突状细胞各亚群的免疫重建异常的机制仍没有明确的答案,树突状细胞的产生与发育主要来源于骨髓中的造血干祖细胞如多能干细胞（MPP）,树突状细胞祖细胞（CDP）。关于这些干祖细胞在移植物抗宿主病（graft-versus-host disease,GVHD）发生发展过程中的改变以及其可能机制的研究仍然较少,本研究将通过造血干细胞移植后外周血以及骨髓临床样本中树突状细胞以及树突状细胞祖细胞的比例和数量的检测来探讨造血干细胞移植后儿童的树突状细胞免疫重建的情况以及其与移植物抗宿主病的严重程度的相关性。通过体外培养造血干细胞,建立造血干细胞向树突状细胞分化的体外培养系统。并通过体外实验探导致树突状细胞免疫重建异常的可能分子机制。方法:1.使用流式细胞仪检测粒细胞植入时造血干细胞移植后患者外周血中DC以及其亚群的比例以及数目的情况。2.使用流式细胞仪检测造血干细胞移植后1个月的患者骨髓中造血干祖细胞的比例和数量。3.使用流式细胞仪检测造血干祖细胞中Dot1L的功能产物H3k79me2的表达水平。4.使用流式细胞仪检测使用不同细胞因子组合体外培养14后的粒细胞,单核细胞,树突状细胞的比例及数量。5.向体外培养系统中添加Dot1L抑制剂SGC0946,检测抑制剂组以及对照组体外分化培养第8天,第12天,第16天时检测粒细胞,单核细胞,树突状细胞的比例及数量。6.使用分选式流式细胞仪分选抑制剂组以及对照组中体外培养14天后的pDC以及CD1c+DC,将分选后的树突状细胞与CD4+T细胞进行共培养,使用流式细胞仪检测其分泌细胞因子的情况。7.使用流式细胞仪检测分化培养后CD1c+DC、pDC表达共刺激分子的情况。8.使用定量PCR法检测培养分化后的CD1c+DC、pDC分泌细胞因子的基因的表达情况。9.使用定量PCR法检测体外培养分化到第4天,第8天时DC相关转录因子的表达情况。10.统计学分析采用SPSS 22.0统计软件进行数据统计分析。使用曼-惠特尼U检验临床样本中外周血中树突状细胞及其亚群的比例数量,骨髓中造血干祖细胞细胞比例数量以及H3k79me2的表达水平。使用双侧t检验分析体外分化培养后各组之间细胞数的差异。以及两组之间基因表达情况的差异。使用P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.发生2-4度aGVHD的患者与发生0-1度aGVHD的患者相比其粒细胞植入时DC所占比例以及数量更低,差异有统计学意义。（P<0.05）DC亚群方面发生2-4度aGVHD的患者与发生0-1度aGVHD的患者相比在粒细胞植入时其pDC占总DC的比例以及数量更低,差异有统计学意义。（P<0.05）而CD1c+DC占DC的比例以及数量在0-1aGVHD组和2-4aGVHD组之间无差异。（P>0.05）2.在造血干细胞移植术后1个月时发生2-4度aGVHD的患者与0-1度aGVHD的患者相比其骨髓中总CD34+细胞以及造血祖细胞MPP、CDP的比例以及数量均较少,差异有统计学意义。（P<0.05）3.发生2-4度aGVHD的患者其骨髓中MPP以及CDP表达H3k79me2的表达量较发生0-1度aGVHD的患者的H3k79me2低,差异有统计学意义。（P<0.05）4.MS-5+GFS3组合在体外可以更有效的使造血干细胞分化为DC。5.Dot1L抑制剂SGC0946可以降低造血干细胞体外的增殖,同时可以促使造血干细胞向粒细胞的分化,抑制造血干细胞向pDC分化,差异有统计学意义。（P<0.05）6.使用Dot1L抑制剂SGC0946培养分化得到的DC与对照组相比可以更强的促进CD4+T细胞向Th1,Th2的分化。7.使用Dot1L抑制剂SGC0946培养分化得到的DC与未使用抑制剂组相比其共刺激分子HLA-DR,CD86,CD83表达水平更高。8.使用Dot1L抑制剂SGC0946培养分化得到的DC与对照组相比其细胞因子IL-12,IFN-α,IFN-β的基因表达量均低于对照组。9.使用Dot1L抑制剂SGC0946培养第四天其IRF4,BATF3,FLT3基因表达量明显低于对照组,差异有统计学意义。（P<0.05）在第8天时TCF4,IRF4,IRF8,FLT3的基因表达量明显低于对照组,差异有统计学意义。（P<0.05）结论:1.GVHD的患者其粒细胞植入时外周血中DC重建受损尤其是pDC。2.GVHD的患者骨髓中的造血干祖细胞MPP/CDP减少与发生2-4严重GVHD反应有明显相关性。而这种现象与造血干祖细胞中Dot1L的表达量低有相关性。3.MS5+GSF3体外分化培养系统与其他细胞因子组合相比可以很好的使造血干细胞向DC分化。4.造血干细胞中Dot1L的甲基化功能受到抑制后会导致DC分化相关的转录因子表达降低,从而影响产生DC尤其是pDC的数量,并且还会利于DC诱导CD4+T的活化,以及共刺激分子的表达。
杨阳[9]（2019）在《BCL11A识别γ-珠蛋白基因启动子的结构基础以及BAF180与核小体互作的结构与功能研究》文中研究指明本论文主要分两个章节,第一章节重点研究了锌指蛋白BCL11A负调控Y-珠蛋白表达的分子机制;第二章节主要研究了人源BAF180蛋白质第一个BAH结构域的晶体结构以及其与核小体的相互作用。第一章节:血红蛋白的主要作用是将氧气运输到身体的各个组织和器官,来维持人类正常的生命活动。血红蛋白由两条α类型和两条β类型的亚基组成,其编码基因分别位于人类第16号和11号染色体上。β类型的亚基由5个不同的珠蛋白基因（ε-,Gγ-,Aγ-,δ-,和β-珠蛋白）编码,并且在胚胎发育过程中会经过两次发育转换。在胚胎期,主要表达ε-珠蛋白;胎儿期,主要表达γ-珠蛋白;成人期,主要表达β-珠蛋白和δ-珠蛋白。此时,胎儿血红蛋白（HbF或者α2 γ2）的水平降到1%以下。β-血红蛋白疾病是由于编码β-珠蛋白的基因发生突变导致β-珠蛋白的结构发生异常或合成异常,包括镰刀型贫血症和β-地中海贫血症。目前,β-血红蛋白疾病治疗方案有羟基脲（hydroxyurea）治疗、输血治疗、骨髓移植和基因治疗。患有“遗传性胎儿血红蛋白持续存在症（HPFH综合症）”的病人没有完成正常的珠蛋白转换,因此血液中仍然含有一定比例的胎儿血红蛋白。对于正常人来说,这种HPFH综合症对他们的健康状况没有显着影响,但是对于患有β-血红蛋白疾病的患者,却能够极大地缓解他们的症状。因此重激活Y-珠蛋白的表达可以作为一种治疗β-血红蛋白疾病的策略。全基因组关联分析研究（GWAS）发现转录因子BCL11A在调控γ-珠蛋白表达上起着重要的作用。在人类造血干/祖细胞CD34+细胞中敲除BCL11A,γ-珠蛋白表达明显上升;在患有镰刀型贫血症的小鼠中,通过条件型敲除BCL11A的表达,可以提高小鼠体内Y-珠蛋白的产量,也可以修正小鼠的表型。尽管大量的功能实验已经证实BCL11A可以调控γ-珠蛋白的表达,但是具体的分子机制仍然还不清楚。直到最近,两个课题组同时报道BCL11A通过其C端的三个串联的C2H2锌指结合γ-珠蛋白基因启动子上游的115bp区域。巧合的是,天然突变G-117A以及C-1 14A/T/G位于该区域内并且被鉴定存在于患有HPFH综合症的病人体内,但是这些天然突变对于负调控γ-珠蛋白的表达机制也还不清楚。我们通过体外克隆表达以及纯化获得了 BCL11A的C端三个串联的锌指Znf4-6,并设计不同长度的DNA序列用于后续的结晶实验,最终获得了 2.50 A的BCL11A和12bp的DNA复合物晶体结构。通过结构分析以及ITC滴定实验,我们验证了 G-117A和C-114A/T/G突变能够极大地减弱了 BCL11A和DNA的亲和力,这与晶体结构中Znf4-5与G-117以及G-114之间存在相互作用一致。我们也通过ITC实验验证了 ZBTB7A蛋白的C端四个串联的锌指可以结合在γ-珠蛋白基因启动子上游200bp区域,亲和力约为120 nM,该区域内也存在一些与HPFH综合症相关的点突变,目前正在进行后续研究。第二章节:染色质重塑作为表观遗传调控的重要组成成分,主要依赖于染色质重塑复合物来实现功能,主要包括SWI/SNF蛋白家族、ISWI蛋白家族、CHD蛋白家族和INO80蛋白家族。在人类细胞中,SWI/SNF家族又可以分为BAF和PBAF两个蛋白质亚家族。BAF180是PBAF亚家族中独有的亚基,在维持基因组稳定、促进哺乳动物心腔成熟、DNA转录过程中的损伤修复以及抑制乳腺癌、肾细胞癌等起着重要的作用。BAF180含有6个Bromo结构域、2个BAH结构域和1个HMG box结构域。其中它的6个Bromo结构域已经被解析,而C末端的HMG box结构域的功能主要是参与结合DNA,但是关于BAH结构域的结构以及功能尚未有文章报道。之前文章报道BAH结构域可以参与识别组蛋白翻译后修饰来调控基因的表达;也可以参与结合核小体来调控基因沉默;也可以参与蛋白-蛋白相互作用。因此探究BAF180的BAH结构域的结构与功能对于理解BAF180的生物学功能具有很重要的意义。我们解析了 BAF180的第一个BAH结构域的晶体结构,并通过体外组装核小体,利用GST pull-down、EMSA以及ITC实验证实了 BAH结构域可以直接结合体外组装的核小体,也能与293T细胞中提取的核小体相互作用。通过大量的点突变实验和核磁滴定实验,我们初步鉴定了 BAH结构域与核小体相互作用的界面信息。我们希望通过后续的核磁滴定实验,能够获得核小体上的作用界面信息,从而搭建结构模型,获得BAH结构域与核小体的三维结构。
朱予津[10]（2019）在《嗜酸性粒细胞型哮喘患者基因启动子和IncRNA与临床特征和生物标志物相关性研究》文中研究说明目的:分析嗜酸性粒细胞型哮喘患者基因启动子及外显子单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）,探讨差异SNP的功能及其与临床特征及生物标志物的相关性;检测嗜酸性粒细胞型哮喘患者长链非编码RNA（long noncoding RNA）,探索新型lncRNA的调控机制及其与临床特征及生物标志物的相关性。为嗜酸性粒细胞型哮喘患者的发病机制、个体化诊断及靶向治疗提供理论依据。方法:第一部分嗜酸性粒细胞型哮喘患者基因启动子及外显子分析及其与临床特征及生物标志物相关性分析1.入选57例嗜酸性粒细胞型哮喘患者,收集患者临床资料及生物标志物（发病年龄、吸烟史、家族及个人过敏史、总IgE、外周血嗜酸性粒细胞（Eos）%及诱导痰Eos%、肺功能、呼出气一氧化氮（FeNO）、ACT、ACQ评分、焦虑抑郁情绪测定、IL-5、IL-6、IL-8、IL-13、TNF-α）,利用高通量测序技术检测上述嗜酸性粒细胞型哮喘患者109个哮喘相关基因启动子及外显子SNP。通过病例-对照研究找出嗜酸性粒细胞型哮喘患者差异SNP。2.利用Sanger测序技术验证Th2型炎症通路活化关键转录因子GATA3基因启动子rs1269486A>G 突变。3.利用荧光素酶报告基因研究GATA3基因启动子rs1269486A>G突变功能。4.检测GATA3基因启动子rs1269486 A>G突变与临床特征及生物标志物的相关性。第二部分嗜酸性粒细胞型哮喘患者lncRNA研究及其与临床特征及生物标志物相关性分析1.入选12例嗜酸性粒细胞型哮喘患者,6例中性粒细胞型哮喘患者及6例健康对照者,收集上述受试者临床特征及生物标志物,利用高通量测序等技术筛选嗜酸性粒细胞型哮喘患者特异表达lncRNA并分析其生物功能。2.利用PCR技术对嗜酸性粒细胞型哮喘患者lncRNA的进行验证并分析其与临床特征及生物标志物的相关性。3.利用JURKAT细胞及人CD4+T淋巴细胞进行嗜酸性粒细胞型哮喘患者lncRNA参与Th2型炎症通路分析。第三部分嗜酸性粒细胞型哮喘患者新型lncRNA（LNC000127）在哮喘-Th2型炎症通路中的调控作用1.利用荧光标记原位杂交技术（FISH）进行新型lncRNA（LNC000127）定位分析。2.利用干扰RNA敲减JURKAT细胞中的新型lncRNA（LNC000127）,构建慢病毒稳转细胞系并鉴定。3.利用PCR芯片及Western-Blot探索新型lncRNA（LNC000127）在Th2型炎症通路的调控作用。结果:第一部分:嗜酸性粒细胞型哮喘患者基因启动子及外显子分析及其与临床特征及生物标志物相关性分析1.57例嗜酸性粒细胞型哮喘患者检测了 109个哮喘基因启动子及外显子,共检测出47个差异SNP（P<0.05）,其中位于启动子16个,位于外显子31个。外显子新发现2个新型SNP,分别位于IRF2,NFKB1基因。2.在57例嗜酸性粒细胞型哮喘患者中发现12例携带GATA3 rs1269486 A>G突变（P<0.05）。3.嗜酸性粒细胞型哮喘患者GATA3 rs1269486 A>G突变位点等位基因为G时较位点为A时基因荧光素酶活性显着增强（P<0.05）,说明GATA3 rs1269486多态性位点由A突变为G后可能提高了 GATA3基因转录活性。4.与嗜酸性粒细胞型哮喘患者GATA3 rs1269486 A>G等位基因为A的患者比较,携带等位基因G的患者家族哮喘遗传比例更高、重症患者比例更高、气流持续受限比例及血IL-5水平更高、焦虑状态更重（P<0.05）,而FEV1/FVC%及PEF%更低（P<0.05）。GATA3基因启动子SNP rs1269486 A>G突变的患者外周血IL-5与FEV1/FVC%及PEF%呈负相关。第二部分:嗜酸性粒细胞型哮喘患者lncRNA研究及其与临床特征及生物标志物相关性分析1.与中性粒细胞型哮喘组及正常对照组比较,嗜酸性粒细胞型哮喘患者组差异表达的lncRNA 190个,其中表达上调的81个,表达下调的109个;在差异表达的190 个lncRNA 中发现 3 个lncRNA（LNC000127,RP11-408H1.3,OIP5-ASl）与嗜酸性粒细胞型哮喘-Th2型炎症通路相关基因共表达,其中发现了新型lncRNA:LNC000127。2.通过PCR验证,新型LNC000127在嗜酸性粒细胞型哮喘患者组中明显升高（P<0.05）,与中性粒细胞型哮喘患者和正常对照组相比,新型LNC000127表达升高的嗜酸性粒细胞型哮喘患者总IgE、FeNO、外周血及诱导痰中Eos%、家族哮喘遗传比例及血IL-5水平更高（P<0.05）;而FEV%和FEV1/FVC%更低（P<0.05）。新型LNC000127表达升高的患者外周血IL-5与FEV1%及FEV1/FVC%呈负相关。3.新型LNC000127在PMA/CD28刺激的JURKAT细胞及人CD4+T细胞中表达升高（P<0.05）。第三部分嗜酸性粒细胞型哮喘患者新型lncRNA（LNC000127）在哮喘-Th2型炎症通路中的调控作用1.新型LNC000127定位于JURKAT细胞的细胞核内。2.干扰RNA慢病毒载体构建成功,pLKD-CMV-G&PR-U6-shRNAY6472敲减JURKAT中的新型LNC000127效率最高（P<0.05）。3.敲减新型LNC000127可导致JURKAT细胞向Th2型细胞分化过程中关键转录因子GATA3、STAT5A及T淋巴细胞表面受体CD40L、CCR8、CRLF2表达下降（P<0.05）。结论:1.利用高通量测序技术检测57例嗜酸性粒细胞型哮喘患者的109个哮喘相关基因的启动子及外显子SNP。发现12例嗜酸性粒细胞型哮喘患者携带GATA3 rs1269486A>G突变（突变率21%）,该突变可使GATA3基因转录活性升高,目前尚未见文献报道。携带GATA3 rs1269486 A>G突变的嗜酸性粒细胞型哮喘患者有明显的家族哮喘遗传倾向、且病情更重、肺功能更差、焦虑状态更重以及血IL-5水平更高,而且携带GATA3 rs1269486 A>G突变的患者外周血IL-5与FEV1/FVC%及PEF%呈负相关,因此提示GATA3 rs1269486 A>G突变可能与嗜酸性粒细胞型哮喘发病机制及临床特征相关,并有可能成为该表型哮喘的生物标志物。2.首次发现的新型LNC000127在嗜酸性粒细胞型哮喘患者中表达显着升高且新型LNC000127高表达的患者总IgE、FeNO、外周血及诱导痰中Eos%、家族哮喘遗传比例及血IL-5水平更高,而FEV1%和FEV1/FVC%更低,新型LNC000127表达升高的患者外周血IL-5与FEV1%及FEV1/FVC%呈负相关,提示新型LNC000127有可能成为嗜酸性粒细胞型哮喘患者的生物标志物并与临床特征及肺功能密切相关。3.嗜酸性粒细胞型哮喘患者携带的新型LNC000127参与了转录因子GATA3,STAT5A 及 CCR8、CD40L、CRLF2 等 T 淋巴细胞表面受体（T cell receptor,TCR）的调控,其可能通过TCR-STAT-GATA3通路影响Th0型细胞向Th2型细胞分化,从而可能参与嗜酸性粒细胞型哮喘的发病机制。未来新型LNC000127有可能成为GATA3基因介导的嗜酸性粒细胞型哮喘的治疗靶点。
二、人CD34分化抗原转录调控序列的克隆与调控表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人CD34分化抗原转录调控序列的克隆与调控表达（论文提纲范文）
（1）WES筛选ITP致病基因和rhTPO影响ITP巨核产板的异质性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分: 利用全外显子组测序技术筛选ITP致病基因及亚组致病基因 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分: rhTPO影响血小板抗体阳性ITP巨核产板的异质性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分: ITP患者血小板自身抗体特异性与对rhTPO反应性的相关性研究 |
| 前言 |
| 研究对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 英文论着Ⅰ |
| 英文论着Ⅱ |
| 英文论着Ⅲ |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（2）FAPα在骨髓间充质干细胞促进AML耐药中的作用及机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 骨髓间充质干细胞分离培养和AML患者FAPα 表达水平及临床意义 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.2.1 主要试剂 |
| 1.2.2 主要溶液配制 |
| 1.2.3 主要仪器设备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 骨髓间充质干细胞的分离培养 |
| 2.2 流式检测BMMSCs的 FAPα 表达水平以及AML患者骨髓原始细胞比例 |
| 2.3 免疫荧光观察BMMSCs的 FAPα 表达水平 |
| 2.4 逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测BMMSCs的 FAPα 表达水平 |
| 2.5 骨髓组织病理石蜡切片制作 |
| 2.6 免疫组织化学法染色检测骨髓组织FAPα表达水平 |
| 3.统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1.BMMSCs的形态与分子表达 |
| 2.初诊AML患者和健康对照组BMMSCs的 FAPα 的表达水平 |
| 3.新诊断的AML患者和健康供体骨髓活检标本中FAPα 的表达水平 |
| 4.骨髓组织FAPα 表达与新诊断AML患者临床参数及生存时间的相关性分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 FAPα在BMMSCs介导的AML细胞耐药中的作用及分子机制 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 siRNA细胞转染 |
| 2.2 流式细胞术检测细胞凋亡比例 |
| 2.3 Western Blot |
| 2.4 流式细胞术检测抑制β-catenin通路前后细胞凋亡的变化 |
| 3.统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1.siRNA转染效果验证 |
| 2.流式细胞术检测各组Ara-C诱导Kasumi-1 细胞凋亡的比例 |
| 3.Western blot检测敲低BMMSCs的FAPα前后对Kasumi-1细胞β-catenin的表达水平的影响 |
| 4.流式细胞术检测抑制β-catenin信号通路前后的细胞凋亡比例的变化 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文结论与展望 |
| 1.全文总结 |
| 2.本文不足之处及下一步研究方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 成纤维细胞活化蛋白的生物学特性及其在肿瘤中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
（3）基于多组学和生物信息学的淋巴细胞分化发育研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 淋巴细胞发育研究 |
| 1.1.1 淋巴细胞概述 |
| 1.1.2 NK细胞发育研究 |
| 1.1.3 胸腺T细胞发育研究 |
| 1.2 多组学和生物信息学及其应用 |
| 1.2.1 多组学概述及相关二代测序技术 |
| 1.2.2 生物信息学概述 |
| 1.2.3 多种组学技术和生物信息学在NK细胞研究中的应用 |
| 1.2.4 多种组学技术和生物信息学在T细胞发育研究中的应用 |
| 1.3 论文思路和主要工作 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验样本 |
| 2.1.2 构建ATAC-seq文库的相关试剂 |
| 2.1.3 NK细胞分化研究中使用的其他试剂及仪器 |
| 2.1.4 实验小鼠 |
| 2.1.5 构建单细胞RNA-seq文库的相关试剂 |
| 2.1.6 构建单细胞ATAC-seq文库的相关试剂 |
| 2.1.7 胸腺T细胞发育研究中使用的抗体 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 NK细胞体外培养 |
| 2.2.2 ATAC-seq文库构建 |
| 2.2.3 免疫荧光染色 |
| 2.2.4 RNA分离和real-time PCR |
| 2.2.5 慢病毒的产生和转导 |
| 2.2.6 慢病毒载体的构建 |
| 2.2.7 胸腺细胞分离 |
| 2.2.8 流式细胞术 |
| 2.2.9 胸腺细胞之间免疫突触的成像 |
| 2.2.10 细胞增殖染色 |
| 2.2.11 单细胞RNA-seq文库构建 |
| 2.2.12 单细胞ATAC-seq文库构建 |
| 2.3 ATAC-seq数据分析 |
| 2.3.1 测序数据预处理 |
| 2.3.2 数据质量检测 |
| 2.3.3 差异分析 |
| 2.3.4 鉴定时期特异性的基因和染色质开放区域 |
| 2.3.5 转录因子富集分析 |
| 2.3.6 转录因子“足迹”分析 |
| 2.3.7 基因模块和蛋白质相互作用分析 |
| 2.3.8 转录调控网络构建 |
| 2.4 单细胞数据分析 |
| 2.4.1 单细胞测序 |
| 2.4.2 单细胞RNA-seq数据预处理 |
| 2.4.3 细胞分群和鉴定 |
| 2.4.4 整合Tabula Muris小鼠胸腺单细胞数据 |
| 2.4.5 发育路径和假时间分析 |
| 2.4.6 鉴定动态变化的基因 |
| 2.4.7 利用SCENIC富集转录因子 |
| 2.4.8 鉴定转录因子和差异基因的调控关系 |
| 2.4.9 单细胞ATAC-seq数据分析 |
| 2.4.10 单细胞RNA-seq和单细胞ATAC-seq整合分析 |
| 2.4.11 细胞周期分析 |
| 2.4.12 人和鼠跨物种分析 |
| 第三章 NK细胞分化的转录调控研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.1.1 NK细胞相关的免疫疗法 |
| 3.1.2 体外诱导NK细胞 |
| 3.1.3 应用染色质可及性研究转录调控网络 |
| 3.2 研究结果 |
| 3.2.1 获得NK细胞分化过程中的染色质可及性图谱 |
| 3.2.2 NK细胞分化过程中染色质开放区域的动态变化 |
| 3.2.3 调控NK细胞分化的转录因子 |
| 3.2.4 FOSL2和EGR2调控NK细胞分化相关的基因 |
| 3.2.5 FOSL2和EGR2影响NK细胞的分化 |
| 3.2.6 NK细胞分化过程中转录调控网络的动态变化 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 单细胞分辨率下胸腺细胞发育研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 研究结果 |
| 4.2.1 单细胞转录组图谱描述胸腺中αβ-T细胞的发育 |
| 4.2.2 单细胞ATAC-seq揭示新的与胸腺细胞发育相关的转录因子 |
| 4.2.3 Ly6d和CD2可以作为分选DP细胞各个亚群的新的表面marker |
| 4.2.4 DPbla细胞在细胞周期中发育为DPre细胞 |
| 4.2.5 DP细胞亚群之间的差异与胸腺T细胞发育相关 |
| 4.2.6 胸腺细胞充当CD8相关胸腺选择的抗原呈递细胞 |
| 4.2.7 物种特异性转录因子在人鼠胸腺细胞发育中调控跨物种的转录差异 |
| 4.3 本章小结 |
| 4.4 本章研究中使用的简称 |
| 第五章 总结与讨论 |
| 5.1 NK细胞分化的转录调控研究 |
| 5.2 单细胞分辨率下胸腺细胞发育研究 |
| 参考文献 |
| 附录一 ATAC-seq接头序列信息 |
| 附录二 ATAC-seq测序质量 |
| 附录三 单细胞ATAC-seq接头序列信息 |
| 附录四 本研究中使用的其他试剂、耗材及仪器 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（4）p75NTR对牙周膜干细胞骨向分化潜能的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| abstract |
| 摘要 |
| 前言 |
| 第一章 PDLSCs的 p75NTR流式分选及鉴定 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二章 p75NTR~+、p75NTR~-和未分选PDLSCs生物学特性的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三章 p75NTR~+、p75NTR~-和未分选PDLSCs的 RNA测序和差异分析 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四章 p75NTR通过ITGA1 优化PDLSCs骨向分化潜能的机制探讨 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 牙周膜干细胞在再生医学中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）GPS2通过稳定EKLF促进红系分化（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 红系分化 |
| 1.1.1 发育过程中的红系造血作用 |
| 1.1.2 红系造血过程中细胞分化 |
| 1.1.3 红系分化的调节 |
| 1.1.4 研究红系分化常用的模型 |
| 1.2 EKLF在红系分化过程中的功能研究 |
| 1.2.1 EKLF对红系分化的调节 |
| 1.2.2 EKLF突变导致的疾病 |
| 1.3 GPS2功能研究进展 |
| 1.3.1 GPS2参与病毒对宿主细胞的感染 |
| 1.3.2 GPS2参与细胞转录调控 |
| 1.3.3 GPS2参与细胞信号通路的调节 |
| 1.4 本课题研究的意义 |
| 第二章 GPS2敲除小鼠胎肝红系造血受阻 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 GPS2敲除小鼠的基因型鉴定 |
| 2.2.2 GPS2敲除小鼠胎肝红系造血不足 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 敲低GPS2抑制脐带血CD34~+细胞向红系分化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 GPS2在红系诱导过程中表达上调 |
| 3.2.2 干涉GPS2抑制CD34~+细胞在液体培养体系中向红系分化 |
| 3.2.3 敲低GPS2抑制半固体培养基中红系集落形成 |
| 3.2.4 敲低GPS2抑制CD34~+细胞在体内重建 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 GPS2 能够稳定EKLF |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 GPS2 增强EKLF对下游靶基因的激活 |
| 4.2.2 GPS2与EKLF存在相互作用 |
| 4.2.3 GPS2 能够稳定EKLF |
| 4.2.4 aa191-230 区域对维持EKLF蛋白稳定性至关重要 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 GPS2 促进红系分化依赖EKLF |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 GPS2 促进红系分化依赖与EKLF的相互作用 |
| 5.2.2 回补EKLF能够挽救敲低GPS2 造成的红系分化的阻滞 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 引物 |
| 附录B 常用溶液的配制 |
| 附录C 发表学术性论文 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（6）地中海贫血症红细胞谱系发育分化基因筛查及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题背景及研究的目的和意义 |
| 1.2 地中海贫血的定义和分类 |
| 1.2.1 α地中海贫血 |
| 1.2.2 β地中海贫血 |
| 1.3 地中海贫血的治疗现状和预防 |
| 1.3.1 常规疗法 |
| 1.3.2 造血干细胞移植 |
| 1.3.3 基因活化疗法 |
| 1.3.4 地中海贫血预防现状 |
| 1.4 造血调控与造血干细胞的研究 |
| 1.4.1 血细胞发生的基本概念 |
| 1.4.2 造血细胞发育阶段和鉴别方法 |
| 1.4.3 早期造血的三个阶段 |
| 1.4.4 早期造血胎儿红细胞生成和血红蛋白合成 |
| 1.4.5 多能造血干细胞维持自我更新的分子基础 |
| 1.4.6 造血干细胞多态性 |
| 1.4.7 造血祖细胞多态性 |
| 1.4.8 造血干细胞和祖细胞的主要区别 |
| 1.4.9 造血干细胞和造血祖细胞表面标志 |
| 1.4.10 造血干细胞的体外和体内检测方法 |
| 1.4.11 造血干细胞和祖细胞富集方法 |
| 1.4.12 造血干细胞移植问题 |
| 1.4.13 造血干细胞体外扩增问题 |
| 1.5 造血调控的关键:细胞因子 |
| 1.5.1 最早研究的细胞因子:集落刺激因子 |
| 1.5.2 作用于早期造血细胞的细胞因子 |
| 1.5.3 其他类型参与造血调控的细胞因子 |
| 1.5.4 与红系分化相关的调控因子 |
| 1.5.5 转录因子在造血调控中的作用 |
| 1.6 红细胞系统发育以及相关调控 |
| 1.6.1 红系祖细胞阶段 |
| 1.6.2 红系前体细胞阶段 |
| 1.6.3 红细胞脱核和释放成熟阶段 |
| 1.6.4 红细胞生成的调控机制 |
| 1.7 本文的主要研究内容 |
| 第2章 实验方法与材料 |
| 2.1 样本来源 |
| 2.2 主要试剂和耗材 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 羊水细胞培养 |
| 2.4.2 细胞冻存 |
| 2.4.3 细胞计数 |
| 2.4.4 脐带血分离单个核细胞 |
| 2.4.5 磁珠分选CD34阳性细胞 |
| 2.4.6 流式细胞仪分析和分选不同阶段的红细胞 |
| 2.4.7 体外造血集落检测 |
| 2.4.8 WES数据分析 |
| 第3章 地中海贫血携带者基因型调查研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 羊水细胞体外培养 |
| 3.3 地中海贫血携带者外显子测序结果 |
| 3.3.1 地中海贫血携带者临床和基因分类 |
| 3.3.2 全外显子组测序结果和数据分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 脐带血造血干细胞体外诱导分化研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 脐带血造血干细胞的分离纯化和鉴定 |
| 4.3 脐带血造血干细胞体外诱导分化和造血集落检测 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）FUS-ERG融合基因阳性AML的分子特征和发病机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 FUS-ERG融合基因阳性AML的临床特征 |
| 引言 |
| 病例资料 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 FUS-ERG融合基因阳性AML的分子特征 |
| 引言 |
| 病例资料 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 FUS-ERG融合基因的致白血病机制研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 FUS-ERG融合基因阳性的急性髓系白血病病例报告及文献复习 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词汇表 |
| 攻读学位期间公开发表的文章 |
| 致谢 |
（8）树突状细胞在移植物抗宿主病中的亚群变化及调控机制初探（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 树突状细胞免疫重建与GVHD的相关性探索 |
| 材料与方法 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、统计学分析 |
| 结果 |
| 1. 外周血DC亚群检测结果 |
| 2. 骨髓中DC祖细胞检测 |
| 3. 骨髓中H3k79me2的检测 |
| 小结 |
| 第二部分 树突状细胞体外分化培养系统的构建 |
| 材料与方法 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、统计学分析 |
| 结果 |
| 一、体外分化培养系统总细胞增殖情况 |
| 二、体外分化培养系统树突状细胞增殖情况 |
| 三、体外分化培养系统粒细胞以及单核细胞增殖情况 |
| 小结 |
| 第三部分 探索DOT1L与DC分化、功能之间的关联 |
| 材料与方法 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、统计学分析 |
| 结果 |
| 一、给予Dot1L抑制剂后对树突状细胞分化的影响 |
| 二、给予Dot1L抑制剂后对树突状细胞功能的影响 |
| 三、Dot1L影响DC分化的分子机制 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 一、造血干细胞移植后树突状细胞免疫重建的探索 |
| 二、树突状细胞体外分化培养系统的构建 |
| 三、探索DOT1L与DC分化、功能之间的关联 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（9）BCL11A识别γ-珠蛋白基因启动子的结构基础以及BAF180与核小体互作的结构与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 BCL11A识别γ-珠蛋白基因启动子的结构基础研究 |
| 1.1 背景介绍 |
| 1.1.1 血红蛋白(hemoglobin)的结构与功能 |
| 1.1.2 血红蛋白转换(hemoglobin switching) |
| 1.1.3 β-血红蛋白疾病(β-hemoglobin disorders) |
| 1.1.3.1 镰刀型贫血症 |
| 1.1.3.2 β-地中海贫血症 |
| 1.1.4 遗传性胎儿血红蛋白持续存在(hereditary persistence fetalhemoglobin,HPFH)症 |
| 1.1.5 γ-珠蛋白基因的表达调控 |
| 1.1.5.1 β-珠蛋白基因座的5'端调控序列 |
| 1.1.5.2 转录因子GATA-1 |
| 1.1.5.3 转录因子BCL11A |
| 1.1.5.4 转录因子LRF |
| 1.1.5.5 转录因子KLF1 |
| 1.1.5.6 转录因子TAL1 |
| 1.1.5.7 表观调控复合物NuRD |
| 1.1.5.8 发育相关的因子IGF2BP1/3,LIN28A/B和let-7,HBBP1 |
| 1.1.6 β-血红蛋白疾病的治疗方案 |
| 1.1.6.1 羟基脲和5-氮胞苷 |
| 1.1.6.2 输血治疗和骨髓移植 |
| 1.1.6.3 基因治疗 |
| 1.1.7 Cys2His2 (C2H2)锌指蛋白 |
| 1.1.7.1 C2H2锌指蛋白的结构 |
| 1.1.7.2 C2H2锌指蛋白的功能 |
| 1.1.7.3 C2H2锌指蛋白的识别 |
| 1.1.7.4 锌指酶 |
| 1.2 实验材料与试验方法 |
| 1.2.1 蛋白质边界选择 |
| 1.2.2 目的片段的扩增 |
| 1.2.3 目的片段的胶回收 |
| 1.2.4 目的片段的限制性双酶切和酶切回收 |
| 1.2.5 质粒的抽提以及载体的构建 |
| 1.2.6 目的片段和载体的连接 |
| 1.2.7 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备 |
| 1.2.8 连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞 |
| 1.2.9 菌液PCR鉴定和酶切鉴定 |
| 1.2.10 突变体的构建 |
| 1.2.11 人源BCL11A蛋白质的C端串联Znf4-6的表达 |
| 1.2.12 人源BCL11A蛋白质的C端串联Znf4-6的纯化 |
| 1.2.13 凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) |
| 1.2.14 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 1.2.15 凝胶电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA) |
| 1.2.16 等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry,ITC) |
| 1.2.17 晶体生长与数据收集和结构修正 |
| 1.2.17.1 DNA的设计 |
| 1.2.17.2 晶体生长 |
| 1.2.17.3 晶体数据收集、晶体结构解析与修正 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 Znf4-6的边界选择 |
| 1.3.2 Znf4-6的克隆、表达和纯化 |
| 1.3.3 Znf4-6与γ-珠蛋白基因启动子-115区域的EMSA实验 |
| 1.3.4 Znf4-6与DNA复合物的晶体结构与分析 |
| 1.3.4.1 T-119的识别 |
| 1.3.4.2 A-118的识别 |
| 1.3.4.3 G-117和T-116的识别 |
| 1.3.4.4 G-115的识别 |
| 1.3.4.5 G-114以及T-113的识别 |
| 1.4 总结与展望 |
| 1.4.1 总结 |
| 1.4.2 存在的不足 |
| 1.4.3 展望 |
| 1.5 参考文献 |
| 第2章 BAF180与核小体互作的结构与功能研究 |
| 2.1 背景介绍 |
| 2.1.1 表观遗传调控(epigenetic regulation) |
| 2.1.2 组蛋白翻译后修饰 |
| 2.1.2.1 组蛋白翻译后修饰的概述 |
| 2.1.2.2 组蛋白翻译后修饰的识别 |
| 2.1.3 染色质重塑以及染色质重塑复合物 |
| 2.1.3.1 染色质重塑的原理以及染色质重塑复合物 |
| 2.1.3.2 SWI/SNF染色质重塑复合物的作用机制 |
| 2.1.3.3 SWI/SNF染色质重塑复合物与癌症的发生 |
| 2.1.4 BAF180的结构域组成以及生物学功能 |
| 2.1.4.1 BAH结构域介导蛋白与蛋白的相互作用 |
| 2.1.4.2 BAH结构域参与核小体的结合 |
| 2.1.4.3 BAH结构域识别组蛋白翻译后修饰 |
| 2.2 实验材料与试验方法 |
| 2.2.1 人源BAF180蛋白质的BAH结构域的边界选择 |
| 2.2.2 His-tag融合蛋白的表达和纯化 |
| 2.2.3 GST pull-down实验 |
| 2.2.4 Westren-blot实验 |
| 2.2.5 小肽膜筛选实验(peptide array) |
| 2.2.6 组蛋白的表达纯化 |
| 2.2.7 widom601-147bp DNA的纯化 |
| 2.2.8 离子交换层析(ion-exchange column chromatography) |
| 2.2.9 核小体的组装 |
| 2.2.10 核磁样品准备 |
| 2.2.11 晶体生长 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 目的蛋白表达边界的选择 |
| 2.3.2 目的蛋白的表达与纯化 |
| 2.3.3 BAH1的~(15)N,~1H-HSQC谱图 |
| 2.3.4 BAH1的结晶实验以及结构分析 |
| 2.3.5 BAH1与组蛋白的GST pull-down实验 |
| 2.3.6 组蛋白小肽膜筛选实验 |
| 2.3.7 BAH1与组蛋白H3的ITC实验 |
| 2.3.8 核小体的组装 |
| 2.3.9 BAH1与核小体的GST pull-down实验 |
| 2.3.10 BAH1与核小体以及free DNA的EMSA实验 |
| 2.3.11 BAH1与核小体的ITC实验 |
| 2.3.12 确定BAH1与核小体相互作用的界面信息 |
| 2.3.13 BAH1以及核小体的甲基反标谱图 |
| 2.4 总结与展望 |
| 2.5 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与参加的学术会议 |
（10）嗜酸性粒细胞型哮喘患者基因启动子和IncRNA与临床特征和生物标志物相关性研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 嗜酸性粒细胞型哮喘患者启动子及外显子分析及其与临床特征及生物标志物相关性分析 |
| 第一节 嗜酸性粒细胞型哮喘患者基因启动子及外显子分析 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| G突变SANGER测序验证'>第二节 TH2型炎症通路活化关键转录因子GATA3基因启动子Rs1269486 A>G突变SANGER测序验证 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| G突变功能研究'>第三节 GATA3基因启动子Rs1269486 A>G突变功能研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| G突变与临床特征及生物标志物相关性分析'>第四节 GATA3基因启动子Rs1269486 A>G突变与临床特征及生物标志物相关性分析 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 嗜酸性粒细胞型哮喘患者LNCRNA研究及其与临床特征及生物标志物相关性分析 |
| 第一节 嗜酸性粒细胞型哮喘患者LNCRNA表达及其生物功能预测 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二节 嗜酸性粒细胞型哮喘患者LNCRNA验证及与临床特征及生物标志物相关性分析 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三节 嗜酸性粒细胞型哮喘患者LNCRNA参与TH2型炎症通路分析 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 嗜酸性粒细胞型哮喘患者新型LNCRNA(LNC_000127)在哮喘-TH2型炎症通路中的调控作用 |
| 第一节 新型LNCRNA(LNC_000127)FISH基因定位分析 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二节 新型LNCRNA(LNC_000127)敲减慢病毒载体的构建与鉴定 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三节 新型LNCRNA(LNC_000127)对TH2型炎症通路的调控作用 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表文章 |
| 致谢 |
四、人CD34分化抗原转录调控序列的克隆与调控表达（论文参考文献）
- [1]WES筛选ITP致病基因和rhTPO影响ITP巨核产板的异质性研究[D]. 于亚菲. 山东大学, 2021(11)
- [2]FAPα在骨髓间充质干细胞促进AML耐药中的作用及机理研究[D]. 梅舒翀. 南昌大学, 2021(01)
- [3]基于多组学和生物信息学的淋巴细胞分化发育研究[D]. 李坤. 中国科学技术大学, 2021(09)
- [4]p75NTR对牙周膜干细胞骨向分化潜能的影响及其机制研究[D]. 李骏. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [5]GPS2通过稳定EKLF促进红系分化[D]. 马文兵. 军事科学院, 2020(02)
- [6]地中海贫血症红细胞谱系发育分化基因筛查及机制研究[D]. 杨最. 哈尔滨工业大学, 2020(01)
- [7]FUS-ERG融合基因阳性AML的分子特征和发病机制研究[D]. 许小宇. 苏州大学, 2020(06)
- [8]树突状细胞在移植物抗宿主病中的亚群变化及调控机制初探[D]. 李泊涵. 苏州大学, 2020(02)
- [9]BCL11A识别γ-珠蛋白基因启动子的结构基础以及BAF180与核小体互作的结构与功能研究[D]. 杨阳. 中国科学技术大学, 2019(02)
- [10]嗜酸性粒细胞型哮喘患者基因启动子和IncRNA与临床特征和生物标志物相关性研究[D]. 朱予津. 中国人民解放军医学院, 2019(02)