生物人工肝细胞材料的研究进展

一、生物人工肝细胞材料研究进展（论文文献综述）

李柯,张广浩,张丞,杨嘉屹,吴昌哲,霍小林^[1]（2022）在《体外3D规模化扩增肝细胞的培养体系及自动化、智能化生物反应器的评估》文中研究说明背景:如何在体外获得足够数量和质量的肝细胞,是生物人工肝临床应用亟待解决的核心问题。目的:对肝细胞体外3D规模化扩增培养体系的主要研究内容进行综述,总结了当前主要的肝种子细胞来源、3D培养方法、生物反应器系统以及培养过程关键指标实时在线监测的进展和局限,并对自动化、智能化生物反应器系统进一步发展进行展望。方法:由第一作者检索Web of Science核心数据库、ScienceDirect、EI、PubMed以及中国知网数据库,英文检索词为:"hepatocyte,3D culture,proliferate,bioreactorsystem,monitor andcontrol",中文检索词为:"肝细胞、3D培养、增殖、生物反应器系统、监测和控制"。文献检索时间范围为2005年1月至2021年3月,文献的类型包括研究原着、综述和荟萃分析,最终筛选出93篇文献进行综述。结果与结论:（1）目前肝种子细胞来源、3D培养方式、生物反应器系统构建以及关键生化指标实时在线监测方法等方面的研究均取得了一定进展,为进一步构建肝细胞体外3D规模化培养体系奠定了坚实的基础。（2）人肝癌细胞系、永生化肝细胞、干细胞分化及其他来源的肝细胞均能在体外培养增殖并进行肝功能表达,其中干细胞分化和直接重编程得到的肝细胞样细胞具有成熟肝脏细胞类似的细胞形态、功能和基因表达谱特征,在未来有更大的应用前景。（3）3D悬浮培养在培养密度、传质效率方面表现优异,且具有易于放大、接种和取用方便等优点,是肝细胞体外3D培养方式的主要发展方向。（4）现有的生物反应器系统虽然能实现肝细胞体外培养扩增,但自动化程度低,且缺乏对关键生化指标进行实时在线检测方法;此外,当前这几方面的研究相互融合程度低,也制约了肝细胞体外3D规模化培养体系的进展。（5）未来的研究重点是结合不同来源的肝种子细胞的生长特性,选择适合培养方式,以建立培养过程中的关键参数实时在线监测方法,从而构建高度自动化和智能化生物反应器系统,最终实现肝细胞体外规模化制备。

潘晨燕^[2]（2021）在《仿生生物人工肝的构建及其治疗急性肝衰竭的作用研究》文中研究说明目的:基于肝细胞微载体与半透膜微管构建仿生肝小叶结构单元;基于肝小叶结构功能单元构建肝脏芯片;肝脏芯片应用于仿生生物人工肝（Bionic bioartificial liver system,BBALS）治疗急性肝衰竭的效果研究。方法:第一部分:构建基于肝小叶结构功能单元的肝脏芯片。通过对肝细胞微载体进行肝功能评估,验证其模拟肝脏微环境以及作为体外生物反应器单元可能性,并与半透膜微管结合构建肝小叶结构功能单元。将其与双向循环体系结合构建肝脏芯片,通过对双向循环体系不同流速进行优化,优选出最适合肝细胞微载体培养的流速,能够维持肝细胞微载体最强活性、及最佳细胞功能。实验分为对细胞进行二维平板培养组和肝细胞微载体模拟3D培养组,使用过碘酸雪夫染色法（Periodic Acid-Schiffstain,PAS）观察糖原合成情况,同时使用吲哚青绿（Indocyanine green,ICG）染色观察摄取及排泄能力,通过检测尿素（Urea）、白蛋白（Album,ALB）水平评估合成及分泌能力,检测细胞色素P-450表达（Cytochrome P-450,CYP-450）情况,通过细胞增殖及肝功能水平检测确定最佳流速。第二部分:通过使用构建的仿生生物人工肝,对其治疗急性肝衰竭的作用进行研究。使用3D肝脏芯片作为新型生物反应器应用于BBALS中,通过过滤D-氨基半乳糖诱导（D-galactosamine,D-Gal）形成急性肝衰竭（Acute liver failure,ALF）兔模型,对其进行血浆置换,研究BBALS治疗ALF的作用。实验分为正常组、ALF组以及BBALS治疗组,观察丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotransferase,AST）、尿素和白蛋白水平,并用H&E、Ki-67和Tunel染色检测炎症反应、增殖和凋亡程度。结果:第一部分:肝细胞微载体3D培养组与细胞平板培养组相比,肝糖原合成更多,ICG摄取和释放速度更快,尿素合成、白蛋白分泌水平增高,CYP-450水平增高。得到了优化后的最佳流速,证明肝脏芯片在5mL/h时能够保持较高的细胞活性,维持其特异性功能。第二部分:与未治疗的ALF组相比,BBALS治疗组的ALT和AST显着降低,尿素和血浆生成明显改善,炎症浸润、肝细胞凋亡和肝细胞增殖显着减少。结论:1.肝细胞在微载体上3D培养与细胞平板培养相比有更好的肝储备、合成、分泌、代谢能力,将其与半透膜微管组装构建了模拟肝脏肝小叶结构的功能单元。发现肝小叶结构功能单元结合双向循环体系构建的肝脏芯片能够在0.5mL/h流速下使细胞达到最佳生长活性,有较好的肝脏特异性功能。2.仿生生物人工肝治疗急性肝衰竭后,肝脏损伤程度减轻,解毒和合成功能得到一定程度的恢复,显示了其在组织工程中的应用前景。

白校杰^[3]（2020）在《活化核受体FXR对生物人工肝种子细胞及肝性脑病的作用研究》文中指出背景肝性脑病是急性或慢性肝功能衰竭的神经精神并发症,氨中毒被认为是其病因之一,该病目前尚无特异治疗方法,以综合治疗为主。生物人工肝是由微载体粘附的肝细胞和人工解毒装置共同组成的体外肝灌流系统,是患者自体恢复肝功能的重要治疗方法,也是帮助患者过渡到肝移植的桥梁,在一定程度上缓解了肝性脑病。目前,生物人工肝的种子细胞来源是制约生物人工肝发展的首要问题,去氨作用是其核心要求。胆汁酸通过法尼酯X受体（FXR）调节脂质和葡萄糖的代谢,奥贝胆酸（OCA）作为一种胆汁酸的模拟物可活化FXR。近期研究发现,FXR能引起氨代谢通路中部分酶基因的改变。但是激活FXR是否可以促进生物人工肝种子细胞的氨代谢能力,使其更好的应用到生物人工肝系统尚未见报道。此外,活化FXR对肝损伤所致的肝性脑病是否有治疗作用,也值得进一步探讨。目的1.检测活化FXR对生物人工肝种子细胞氨代谢能力的影响,进一步开发高效生物人工肝系统。2.探讨活化FXR对小鼠氨代谢及肝性脑病的作用。方法细胞实验:1.生物人工肝种子细胞C3A的生物学改造:（1）C3A细胞系转染FXR稳转质粒,通过G418筛选,建立C3A-FXR稳转细胞株,RT-PCR、细胞荧光检测FXR过表达效率。（2）转染精氨酸酶1（ARG1）和鸟氨酸氨基甲酰转移酶（OTC）质粒,恢复C3A细胞的氨代谢通路。2.C3A细胞的氨代谢和耐氨毒能力检测:（1）RT-PCR检测氨代谢通路关键酶基因的表达水平。（2）加入20 mM NH4Cl建立氨胁迫环境,使用实时无标记细胞分析仪（RTCA）检测细胞增殖能力来评价其耐氨毒能力。（3）生化分析仪检测不同处理后细胞上清中尿素的含量,评估生物人工肝种子细胞的氨代谢能力。动物实验:1.肝性脑病动物模型的建立:选取12周龄C57BL/6N野生型雄性小鼠,连续3天腹腔注射硫代乙酰胺（TAA）200 mg/kg/天建立TAA模型;肝脏大部分切除术（PHx）建立肝切模型。生化分析仪检测这两个模型血浆中血氨、尿素含量及肝功能指标;HE染色和免疫组织化学分析肝脏和大脑的病理改变。2.活化FXR对氨代谢的影响:小鼠腹腔注射TAA前一天开始使用FXR激动剂OCA 25mg/kg/天进行灌胃处理,三天后处死小鼠,取血浆、肝脏和大脑;对WT和FXR-KO小鼠进行大部分肝切手术,分别在术后40 h、3d和7d处死小鼠,取血浆,肝脏和大脑。（1）RT-PCR检测FXR的靶基因验证FXR的激活;（2）生化分析仪检测血浆中血氨、尿素含量及肝功能指标ALT,AST,TBA等;（3）HE染色和免疫组织化学分析肝脏的病理改变;（4）RT-PCR及Western blot检测氨代谢通路关键酶基因的表达。3.活化FXR对肝性脑病的影响:小鼠腹腔注射TAA前一天开始连续使用OCA 25mg/kg/天进行灌胃处理,三天后处死小鼠。（1）旷场实验检测肝性脑病所致小鼠行为学改变;（2）处死小鼠后取大脑,RT-PCR检测脑中肝性脑病相关因子的基因表达;（3）HE染色和免疫组织化学分析大脑皮质及海马的病理改变。结果1.生物人工肝种子细胞C3A的生物学改造:C3A细胞转染FXR稳定表达质粒后,FXR及其下游靶基因的表达水平显着升高。在LO-2,HepG2,C3A这三种细胞系中,氨代谢通路关键酶基因ARG1,OTC明显低表达,甚至缺失,我们在C3A-FXR细胞中过表达ARG1和OTC,在激活FXR的同时恢复氨代谢通路。2.活化FXR提高C3A细胞的氨代谢以及耐氨毒能力:RT-PCR结果显示,活化FXR可以上调氨代谢通路关键酶基因的表达,其中以NAGS和SLC1A4尤为明显。RTCA结果显示,NH4Cl浓度越高,其对细胞增殖的抑制作用越明显,但细胞过表达FXR后,NH4Cl对细胞增殖能力的抑制效果明显下降,细胞耐氨毒能力增强。细胞培养72 h后取上清进行生化检测,发现激活FXR后尿素生成增加,并且在氨胁迫状态下,激活FXR同样可以增加尿素生成量。3.活化FXR并恢复氨代谢通路中的关键酶ARG1和OTC后对C3A细胞的氨代谢以及耐氨毒能力的影响:活化FXR并恢复氨代谢通路后,细胞的耐氨毒能力并没有出现叠加效应,尿素的生成亦呈现同样的趋势。4.肝性脑病动物模型的建立:（1）TAA模型生化结果显示,血浆中ALT、AST和血氨浓度均显着升高;肝脏HE染色显示,腹腔注射TAA后,肝细胞桥接坏死伴大量炎细胞浸润,大脑皮质及海马区星形胶质细胞增多,肿胀;脑免疫组织化学结果显示,星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）及脑免疫细胞小胶质细胞标记物离子钙接头蛋白分子1（IBA1）的表达明显升高。（2）肝切模型生化结果显示,肝切后血浆中ALT、AST、TBA和氨浓度均有显着升高,尿素的含量降低,其中以肝切后40 h变化最大,随着肝脏的再生,7 d后肝功能基本恢复;免疫组织化学结果显示,肝切后大脑中GFAP及IBA1的表达升高。5.活化FXR提高小鼠的氨代谢水平:在TAA模型中,生化结果显示小鼠饲喂OCA活化FXR后血浆中ALT、AST和血氨水平较TAA组均有显着下降;HE染色显示,活化FXR后肝细胞炎症和坏死区域显着减少;此外,注射TAA后,小鼠氨代谢相关基因的表达水平大多显着下调,饲喂OCA激活FXR后,这些基因表达有明显的回升。同时,Western blot结果显示,注射TAA后,NAGS,AS蛋白表达降低,饲喂OCA后NAGS,AS蛋白表达水平上调。肝切模型中,相较于WT小鼠,FXR-KO小鼠的肝功能受影响更严重,表现为肝切后血浆中ALT,AST和TBA含量较WT小鼠均有显着升高,尿素含量在40h明显下降,但血氨水平则变化不显着;此外,肝切之后,氨代谢相关酶基因GS,CPS1,ARG1,AL,NAGS,SLC1A4d的表达水平显着上调,其中FXR-KO小鼠和WT小鼠的趋势是一致的。另外,和WT小鼠相比,FXR-KO小鼠中FXR的靶基因NAGS,SLC1A4和GLS的表达量是降低的。6.活化FXR改善肝性脑病:在TAA模型中,大脑病理损伤相关基因TSPO,MAO-A,GRIAL的表达水平显着升高,小鼠饲喂OCA活化FXR后,上述基因的表达有明显的下调。免疫组化结果显示,活化FXR后大脑海马和皮质区域GFAP和IBA1的表达均有明显下降,这说明活化FXR对肝性脑病有明显改善作用。结论1.活化FXR提高生物人工肝种子细胞C3A的氨代谢及耐氨毒能力。2.活化FXR并恢复氨代谢通路未进一步增强C3A的氨代谢及耐氨毒能力。3.活化FXR能提高肝损伤小鼠的氨代谢能力,并有显着的肝保护作用。4.活化FXR能改善肝性脑病。

武之涛,彭青,高毅,潘国宇^[4]（2019）在《生物人工肝的研究进展》文中提出肝衰竭是临床常见的严重肝病症候群,病死率极高,除肝移植外,目前尚无有效的治疗方法。人工肝支持系统是治疗肝功能衰竭的重要方法之一,主要包括非生物型人工肝和生物型人工肝。结合了功能性肝细胞的生物型人工肝装置可发挥肝脏解毒、合成、代谢等功能,并且可以部分替代人体肝脏功能。生物型人工肝研发的关键在于种子细胞的筛选和生物反应器的构建。具有良好特性种子细胞的生物人工肝对于肝衰竭的疗效已在一些临床前研究中得以体现,并且目前已启动了多个生物人工肝的临床研究。该文从种子细胞的来源、生物反应器结构分类和临床应用等不同方面,对目前生物型人工肝的发展现状进行了综述。

王珊^[5]（2017）在《PE、DPMAS治疗高胆红素血症的疗效对比研究》文中研究说明[目的]本研究旨在比较血浆置换（PE）与双重血浆分子吸附系统（DPMAS）对高胆红素血症的临床疗效,探求治疗高胆红素血症的最佳人工肝治疗方案。比较血浆置换（PE）与双重血浆分子吸附系统（DPMAS）治疗高胆红素血症中的肝衰竭患者的临床疗效,探求治疗肝衰竭的最佳人工肝治疗方案。[方法]选择2015年7月1日—2017年1月31日在昆明医科大学第二附属医院消化内科二病区住院并行人工肝治疗的的高胆红素血症患者90例,所有患者均行内科综合治疗及人工肝支持治疗（PE或DPMAS治疗）,其共行人工肝治疗262人次。根据患者行人工肝方式的不同,将高胆红素血症患者分为两组:PE治疗组45例和DPMAS治疗组45例,PE治疗组共行PE术142人次,DPMAS治疗组共行DPMAS术120人次。分别比较两组患者的基线资料（术前总胆红素浓度、年龄、人工肝类型）与治疗效果的关系。比较两组患者人工肝治疗前后的肝功能、凝血功能、急性感染三项、肾功能、血常规、电解质的实验室各指标的变化情况,观察两组患者治疗中及治疗后的不良反应。高胆红素血症患者的肝衰竭患者有23例患者行PE治疗术,有14例患者行DPMAS治疗术。对比肝衰竭患者PE组和DPMAS组治疗前后的肝功能、凝血功能、急性感染三项、肾功能、血常规、电解质的实验室各指标的变化,记录治疗相关的不良反应。[结果]1.PE组、DPMAS组术前与术后的肝功对比:①PE、DPMAS组术后即刻的白蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、间接胆红素（IBIL）较术前降低（P<0.01）。两组术前与术后即刻的下降率对比示:PE组相较于DPMAS组,ALB下降率更大。②PE、DPMAS组术前与术后2-3天的肝功对比、术前与术后5-7天的肝功对比、术前与术后12-14天的肝功对比的结果示:PE组、DPMAS组术后的转氨酶、梗阻酶、总胆红素、总胆汁酸（TBA）均较术前下降,两组下降率的比较无统计学差异。PAB的下降率DPMAS组相较于PE组更大（P<0.05）。2.PE组、DPMAS组术前与术后2-3天的凝血功能对比:PE组:术后2-3的凝血酶原时间（PT）、国际标准化比率（INR）较术前下降（P<0.01）,术后2-3天的纤维蛋白原（FIB）较术前升高（P<0.01）,其余指标均无统计学意义。DPMAS组:术后的凝血功能相关指标较术前相比均无统计学差异。两组术前术后凝血功能相关指标下降率的对比研究:PT、INR的下降率具有统计学意义（P<0.05）,PE组下降率更大。3.PE组、DPMAS组术前与术后即刻的急性感染三项对比:PE组及DPMAS组的急性感染三项的变化规律一致,PE组、DPMAS组的术后即刻的降钙素原（PCT）、超敏C反应蛋白（hs-CRP）较术前相比均降低（P<0.01）。两组急性感染三项的下降率对比均无统计学意义（P>0.05）。4.PE组、DPMAS组术前与术后2-3天的肾功能对比:PE组:术后的肌酐（CREA）较术前降低（P<0.01）。DPMAS组:术后的肌酐较术前相比均无统计学意义（P>0.05）。5.PE组和DPMAS组术前与术后2-3天的血常规对比:PE组:术后的中性粒细胞（NEU%）较术前相比升高（P<0.01）,术后的RBC、HGB、PLT较术前相比降低（P<0.05）。DPMAS组:术后的血常规较术前相比均无统计学意义（P>0.05）。6.PE组和DPMAS组术前与术后1-2天的电解质对比:PE组:术后的钾（K+）较术前相比升高（p<0.05）,术后的钠（Na+）、氯（Cl-）、较术前相比均升高（p<0.01）。术后的Ca2+较术前相比下降（P<0.01）。DPMAS组:术后的电解质较术前相比均无统计学意义（P>0.05）。7.肝衰竭患者的PE组和DPMAS组术前与术后的肝功、凝血功能、急性感染三项、肾功能、血常规、电解质的对比,结果大致同高胆红素血症。[结论]1.无论是否合并肝衰竭,PE、DPMAS这两种人工肝方法均是治疗高胆红素血症患者的安全有效的人工肝治疗方法。PE、DPMAS均能在短期内（2周内）降低患者的肝酶、胆红素、降钙素原、超敏C反应蛋白水平。2. PE、DPMAS这两种人工肝方法各有其特点。PE在改善凝血功能、肾功能方面优于DPMAS,且治疗费用较DPMAS相对较低,但PE术后可能会引起血红蛋白、血小板的降低,术后发生轻度电解质紊乱。虽然DPMAS术后前白蛋白的下降率高于PE组,但DPMAS术后白蛋白丢失少,且可保持血常规、凝血功能、电解质的相对稳定。3.患者的病情不同,可选择不同的人工肝治疗方法。凝血功能相对较差,轻度肾功能损伤的患者,可以选择改善患者凝血功能效果更佳的PE术。DPMAS无需使用血浆,不会发生输血反应及输血相关传染病。对高敏体质或有血浆过敏史的患者,在血浆紧缺时,DPMAS无疑是一个很好的选择。

王永勤,潘留兰,贾胜男,柳思琪,金珍婧^[6]（2014）在《人工肝支持系统临床应用的研究进展》文中提出人工肝支持系统（ALSS）可用于治疗各种肝衰竭患者,其能缓解症状、减轻病情、延长生命、为等待肝移植争取时间。非生物型人工肝（NBAL）技术比较成熟,在临床已广泛应用,成为人工肝在临床应用上的主流技术,但还存在一定的缺陷和不足之处。生物型人工肝（BAL）能完全模拟人体肝脏复杂的生理功能,弥补NBAL的不足,但其受到技术水平限制,进展较为缓慢,尤其在临床方面。BAL和混合型人工肝（HBL）支持系统是临床应用的发展方向,且ALSS进展迅速。本文分类介绍了人工肝的特点和临床应用情况,对ALSS近年来发展现状作一简要综述。

饶小惠,简国登,张志,汪艳,潘明新,高毅^[7]（2013）在《中国人肝细胞系1运用于生物人工肝的生物代谢功能》文中研究指明背景:前期研究发现,中国人肝细胞系1细胞分化程度高且生物代谢功能良好,并且中国人肝细胞系1细胞组织学上来源于正常肝组织,较其他来源于肿瘤源性的肝细胞系更为安全。目的:探讨中国人肝细胞系中国人肝细胞系1细胞在混合型生物人工肝中的生物代谢功能。方法:15只食蟹猴随机分成对照组（n=5）和治疗组（n=10）,均建立急性肝功能衰竭模型,治疗组接受以全接触灌流型生物反应器接种微载体微重力中国人肝细胞系1细胞建立的人源细胞混合型生物人工肝进行治疗。结果与结论:急性肝功能衰竭食蟹猴血清谷氨酸转氨酶、总胆红素、总胆汁酸、尿素氮、肌酐、血氨均明显上升,而白蛋白、Fischer指数则显着下降;人源细胞混合型生物人工肝治疗后,急性肝功能衰竭食蟹猴血清谷氨酸转氨酶、总胆红素、总胆汁酸、尿素氮、肌酐、血氨和白蛋白均恢复。提示中国人肝细胞系1细胞在混合型生物人工肝中生物代谢功能良好,表现出良好的肝特异性生物合成及生物代谢功能。

潘康明^[8]（2013）在《第二代新型双向旋转灌注微重力生物反应器的研制与应用》文中进行了进一步梳理研究背景：肝脏是机体最重要的生命器官之一,其具有复杂的结构和多种生理功能,其主要生理功能为氧化解毒,储存糖原,代谢胆固醇,合成分泌型蛋白和某些激素以及分泌胆汁等[1]。肝功能衰竭（Acute liver failure, ALF）是一种严重的临床综合症,其病死率达到60%-90%[2]。目前治疗肝衰竭方法有：1.内科治疗。2.人工肝治疗。3.肝脏移植治疗[3]。迄今为止,肝衰竭最有效的治疗方法就是原位的肝移植[4]（Liver transplantation, LT）。但由于供体缺乏,患者病情危重,没有充分的时间来等待合适肝源,故病死率高,预后极差。以体外培养肝细胞为基础的生物人工肝等治疗手段的出现有望像人工肾一样作为肝功能肝脏移植手术的过渡治疗,维持患者的生命,使其能安全过渡到肝脏移植手术[5]。生物反应器是整个生物人工肝的核心部分,其性能将直接关系到生物人工肝的支持效果。通常来说,一个理想的生物反应器应该满足以下的几点：1、提供一个良好的环境给肝细胞生长以及代谢；2、使得血液（或者血浆）和肝细胞之间有充分的双向物质及气体交换；3、防止肝脏细胞受到自身免疫系统的损伤以保证血液（或者血浆）及肝细胞之间的高通量的物质交换；4、能够培养足够的细胞符合医疗的需要；5、反应器中的无效空间应该达到最小化[6,7]。如何设计最佳的新型生物反应器,实现体外肝细胞的大规模培养及其培养过程中肝细胞功能与活率的有效维持,同时能够满足临床应用的需要,仍是目前生物人工肝发展的核心问题。经过20余年发展,目前国内外在生物反应器的结构上,至今为止可以分为以下5大类：1、单层培养/平板式的生物反应器；2、中空纤维型的生物反应器；3、灌流床式/支架型生物反应器；4、包被悬浮生物反应器；5、其它的综合型反应器[8-12]。但是,现有的生物反应器仍未达到理想的效果,目前生物反应器存在的四个主要问题：1、无法模仿肝内的环境,维持肝细胞的3D结构。2、无法充分进行细胞的氧供及营养供给。3、无法在体外进行大规模细胞培养（理想的人工肝细胞量为正常肝脏细胞量的1/5-1/10,即1-2×1010[13]）,同时维持细胞的功能[14-16]。RCCS系统是由美国国家航空与宇宙航行局（national aeronautics and space administration, NASA）研制的,目前主要应用到组织及细胞培养领域,它是一种通过调整充满培养液的容器的旋转速度来抵消其内细胞的沉降率,从而实现模拟三维微重力环境的新型生物反应器。在这一体系中,细胞处于失重状态,使细胞更好更稳固底贴壁于微载体上,促进细胞聚集、三维生长。同时其还具有低剪切力,低湍流,能充分的氧气及营养物质交换等特点[17,18]。这种悬浮培养技术为多种细胞和组织块的生长和代谢提供良好的培养环境,可以进行高密度的组织培养,并保持所培养细胞的组织分化特异性。目前国内外研究者广泛的应用到脂肪干细胞、软骨细胞、成骨细胞及肝细胞、干细胞、神经细胞、淋巴细胞等细胞三维培养研究中[19]。张钰鹏[20]、江青艳[21]等利用大鼠原代肝细胞,采用旋转细胞培养系统进行模拟微重力培养。模拟微重力培养中肝细胞贴附微载体并出现三维结构,发展为独特的肝细胞、微载体聚球体。姚新宇[22]对肝干细胞模拟微重力下三维培养。证明模拟微重力环境能促进肝干细胞呈三维立体结构生长,有利于细胞快速增殖并维持细胞活性和表型。为进一步深入研究微重力生物反应器作为一种新型生物人工肝生物反应器的可行性,本课题组引进了美国航空航天局（National Aeronautics and SpaceAdministration简称NASA）设计的500ml体积的旋转灌注微重力生物反应器（Rotary Culture MWTM,简称RCMW）[23],但经过反复的实验研究表明[24,25],美国航空航天局生产的RCMW微重力生物反应器在设计上存在严重的缺陷：1.水平方向的力无法平衡；2.物质交换受到巨大限制,效率低下；3.系统中没有气体有效供应和交换,完全不能满足生物人工肝生物反应器的需求。本实验前期[25]通过对美国NASA公司RCMW旋转灌注微重力生物反应器内芯及循环模式的优化改进的基础上,加设了外置氧合器,成功研制了第一代新型双向旋转灌注微重力生物反应器系统,实现了有效的营养物质、氧气及代谢产物双向物质传输,最大可能减小了反应器内的培养死腔,为肝细胞提供低剪切力模拟微重力的良好生长和代谢环境,有效促进并维持体外培养人肝C3A细胞的功能；并可进一步扩大培养规模,满足临床治疗需求,能基本满足理想生物人工肝生物反应器的各项要求,为新型生物人工肝生物反应器的研制提供了一个新的方向。但其还存在不足之处,主要表现为以下4个问题：1.系统水平方向压力不平衡,由于各个泵精密度及管道变形性差异,造成反应器进出液体有差异,导致反应罐内压力不平衡,罐子内液体进入液体过多,出来液体过少,罐子内压力过大,反应器盖子被顶开,难以运行。2.循环模式的问题,使用新的流向控制系统后,由于只有一个泵,因此泵的位置非常的关键。如果将泵放前面,由于反应罐内阻力的作用,导致流出反应罐液体减少,少于进反应罐液体,液体进出不平衡,导致系统反应罐内压力过大,反应罐停止转动,系统停止运行。3.系统氧合器F6透析柱产生气体太多,管路气体影响系统运转,每隔3小时要排气一次,操作过于麻烦,同时反复打开孵箱排气,不利于反应器的内环境稳定。4.管路设计太复杂,不方便操作。气泡过滤器、双向管路太多、太长,太复杂,难以进行操作。为此,本课题拟通过对RCMW生物反应器设计上存在的问题进行优化改进,设计出第二代新型双向旋转灌注式微重力生物反应器,为新一代生物人工肝生物反应器的发展开辟一个新的方向与思路。研究目的：通过对第一代双向旋转灌注微重力生物反应器存在的问题进行优化改进,设计出第二代新型双向旋转灌注式微重力生物反应器。研究方法：在第一代双向旋转灌注微重力生物反应器的基础上,通过动力系统及供气系统优化构建,形成由细胞培养罐、培养液池、动力控制系统（蠕动泵、换向槽）、供气系统组成的第二代新型双向旋转灌注微重力生物反应器系统。第一代双向旋转灌注微重力生物反应器、第二代双向旋转灌注微重力生物反应器中,持续微载体三维培养7天,并通过MTT染色、细胞计数、培养上清中ALT、AST、白蛋白、尿素浓度等指标测定,比较两组肝细胞活力、数量和功能差异。统计方法：计量资料以均数±标准差（X±s）表示,采用SPSS 17.0统计软件分析。数据采用两组间均数比较采用t检验分析,显着性检验水平a=0.05.研究结果：美国NASA公司商品化RCMW微重力生物反应器存在微载体/细胞堵塞,双向物质交换效率低下及出现培养死腔等缺点。而改进后的第一代双向旋转灌注微重力生物反应器中双向物质交换效率明显提高,但其存在四大问题：1.系统压力不平衡,由于各个泵精密度差异,形成水平方向压力不平衡。2.泵位置问题。3.系统氧合器F6透析柱产生气体太多,管路气体影响系统运转,每隔3小时要排气一次。4.管路设计太复杂,不方便操作。重新改进的第二代双向旋转灌注微重力生物反应器,充分解决了这些问题。倒置显微镜下形态学及MTT细胞活力染色结果可见,第二代双向旋转灌注微重力生物反应器组人肝C3A细胞（C3A）的数量与活力均明显优于RCMW生物反应器组。电镜结果显示：第一代双向旋转灌注微重力生物反应器组中,载体上细胞较少,而第二代双向反应器培养组中,载体上的肝细胞相互紧密连接,组成的肝脏样组织。生长曲线结果显示,两组人肝C3A细胞密度均为先升高后逐渐下降,分别于第5天达肝细胞密度峰值。且第二代双向旋转灌注微重力生物反应器组人肝C3A细胞密度于第1至7天均明显高于第一代双向旋转灌注微重力生物反应器组,差异均有统计学意义（P<0.05）。肝细胞功能结果显示,两组白蛋白、尿素合成功能均为先升高后逐渐下降,分别于第5天达峰值,且第二代双向旋转灌注微重力生物反应器组上清白蛋白、尿素浓度于第1至7天均明显高于第一代双向旋转灌注微重力生物反应器组组,差异均有统计学意义（P<0.01）。此外,第二代双向旋转灌注微重力生物反应器中ALT、AST于第1至7天均明显低于第一代双向旋转灌注微重力生物反应器组,差异均有统计学意义（P<0.05）。研究结论：本研究通过对RCMW生物反应器设计上存在的问题进行优化改进,成功设计出了第二代新型双向旋转灌注式微重力生物反应器,可有效解决RCMW生物反应器中存在的各种设计缺点,大大提高体外培养人肝C3A细胞的密度、活力及功能,有望成为新一代生物人工肝生物反应器。研究结论：本研究通过对第一代双向旋转灌注微重力生物反应器设计上存在的问题进行优化改进,成功设计出了第二代新型双向旋转灌注式微重力生物反应器,可有效解决RCMW生物反应器中存在的各种设计缺点,大大提高体外培养人肝细胞的密度、活率及功能,有望成为新一代生物人工肝生物反应器。

郭予斌,李爱民,刘思德^[9]（2013）在《生物人工肝细胞材料的研究进展》文中提出近年来,许多学者对生物人工肝（bioartificial liver,BAL）多种来源的细胞材料进行了广泛深入地研究和探索,但生物人工肝细胞材料的来源问题至今仍未得到满意解决。本文对近年来生物人工肝细胞材料研究进展进行综述,以期为建立和选择理想的生物人工肝细胞材料的深入研究提供参考。

刘玉琢,谢本维,郭晓东,孟繁平^[10]（2012）在《生物人工肝研究和应用进展》文中认为人工肝支持系统是用来为肝衰竭患者提供体外肝脏功能支持的技术方法。非生物人工肝在已经广泛应用肝衰竭患者的临床治疗,生物人工肝（BAL）以分离的哺乳动物肝细胞构成的生物反应器为解毒系统,可有效替代肝脏的解毒功能和合成功能,并可预防肝性脑病、肝昏迷和脑水肿。可作为肝移植前的过渡辅助,同时改善患者自身肝脏的功能以利于其功能的恢复。本文主要对生物人工肝的研究及应用进展进行综述。生物人工肝研究虽然取得了重大进展,但仍然面临寻找理想肝细胞来源,长期维持肝细胞的活性和功能,进一步优化反应器设计等问题。

二、生物人工肝细胞材料研究进展（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、生物人工肝细胞材料研究进展（论文提纲范文）

（1）体外3D规模化扩增肝细胞的培养体系及自动化、智能化生物反应器的评估（论文提纲范文）

（2）仿生生物人工肝的构建及其治疗急性肝衰竭的作用研究（论文提纲范文）

（3）活化核受体FXR对生物人工肝种子细胞及肝性脑病的作用研究（论文提纲范文）

（4）生物人工肝的研究进展（论文提纲范文）

（5）PE、DPMAS治疗高胆红素血症的疗效对比研究（论文提纲范文）

（6）人工肝支持系统临床应用的研究进展（论文提纲范文）

（7）中国人肝细胞系1运用于生物人工肝的生物代谢功能（论文提纲范文）

（8）第二代新型双向旋转灌注微重力生物反应器的研制与应用（论文提纲范文）

（9）生物人工肝细胞材料的研究进展（论文提纲范文）

（10）生物人工肝研究和应用进展（论文提纲范文）

四、生物人工肝细胞材料研究进展（论文参考文献）

• [1]体外3D规模化扩增肝细胞的培养体系及自动化、智能化生物反应器的评估[J]. 李柯,张广浩,张丞,杨嘉屹,吴昌哲,霍小林. 中国组织工程研究, 2022(19)
• [2]仿生生物人工肝的构建及其治疗急性肝衰竭的作用研究[D]. 潘晨燕. 南京中医药大学, 2021(01)
• [3]活化核受体FXR对生物人工肝种子细胞及肝性脑病的作用研究[D]. 白校杰. 河南大学, 2020(03)
• [4]生物人工肝的研究进展[J]. 武之涛,彭青,高毅,潘国宇. 中国细胞生物学学报, 2019(04)
• [5]PE、DPMAS治疗高胆红素血症的疗效对比研究[D]. 王珊. 昆明医科大学, 2017(02)
• [6]人工肝支持系统临床应用的研究进展[J]. 王永勤,潘留兰,贾胜男,柳思琪,金珍婧. 吉林大学学报(医学版), 2014(02)
• [7]中国人肝细胞系1运用于生物人工肝的生物代谢功能[J]. 饶小惠,简国登,张志,汪艳,潘明新,高毅. 中国组织工程研究, 2013(18)
• [8]第二代新型双向旋转灌注微重力生物反应器的研制与应用[D]. 潘康明. 南方医科大学, 2013(08)
• [9]生物人工肝细胞材料的研究进展[J]. 郭予斌,李爱民,刘思德. 现代消化及介入诊疗, 2013(01)
• [10]生物人工肝研究和应用进展[J]. 刘玉琢,谢本维,郭晓东,孟繁平. 现代生物医学进展, 2012(35)

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