一、烟草bar基因的转化及其转化体快速检测方法的研制（论文文献综述）
温宁[1]（2021）在《RNAi抗虫水稻Csu260-16对靶标害虫二化螟的抗性评价》文中提出水稻是我国最重要的粮食作物之一,二化螟是我国主要水稻产区的重要鳞翅目害虫之一,每年给我国的水稻生产造成严重损失。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是一种通过降解或抑制靶标信使RNA（m RNA）的翻译来抑制基因表达的生物学过程。随着RNAi技术的不断发展,基于RNAi的抗虫基因工程作物（Insect-Resistant Genetically Engineered,IRGE）逐渐成为一种害虫治理的有效手段。microRNA（miRNA）通路是三种RNAi信号通路中的一种,因其高效率、精准作用靶点等优点,被认为是一种极具潜力的控制农作物害虫的新策略。表达二化螟内源miRNA Csu-novel-260的IRGE水稻通过抑制disembodied（dib）基因的表达对二化螟具有显着的抗性,从而为控制二化螟提供了一种有价值的策略。在RNAi转基因抗虫作物大规模商业化应用之前,我们要对其进行系统性的抗性评价。本研究以RNAi转基因抗虫水稻转化体Csu260-16和其对照亲本中花11（ZH11）为材料,系统开展了其对靶标害虫二化螟的抗性评价,研究结果可为制定RNAi作物环境安全评价指南提供理论依据和科学数据,为政府监管提供技术支撑。本文主要研究结果如下:1、RNAi抗虫水稻转化体Csu260-16中Csu-novel-260的时空表达分析。qRT-PCR分析表明,Csu260-16转化体叶片中Csu-novel-260水平在苗期表达量最高,分蘖期和孕穗期的表达量显着下降,而在成熟期则再次上升,呈先下降后上升的趋势。与叶片相反,茎秆中Csu-novel-260水平在苗期表达量最低,分蘖期表达量显着增加,之后保持稳定。由此可知,Csu-novel-260在RNAi抗虫水稻不同生育期和不同组织器官中均呈现显着的时空表达特性。为明确靶标害虫在田间对Csu-novel-260的最大暴露量,确定二化螟饲料取食生测中Csunovel-260的剂量梯度,同时又通过绝对qRT-PCR测定了Csu260-16水稻中苗期叶片Csu-novel-260表达量为233.70±68.39 fmol/g鲜重。2、二化螟饲料取食生测和离体水稻组织生测及靶基因表达量测定。采用饲料涂表法对二化螟1龄幼虫进行饲料取食生测。生测前,我们通过qRT-PCR明确了化学合成的Csu-novel-260agomir在二化螟人工饲料中的稳定性,结果表明:Csu-novel-260在人工饲料中超过24 h后,含量显着下降,由此确定:在饲料取食生测中,每隔24 h更换一次涂有Csu-novel-260 agomir的人工饲料。设定7个不同的Csu-novel-260 agomir浓度梯度,分别以添加Csu-novel-260无义序列和蒸馏水处理作为阴性对照和空白对照,对二化螟1龄幼虫进行整个生活史的处理。结果表明:不同浓度处理的二化螟幼虫死亡率显着高于两对照组,但不同浓度Csu-novel-260 agomir处理间没有显着差异。在200 fmol/g Csu-novel-260 agomir浓度处理下,二化螟蛹畸形率最高,且显着高于空白对照组;相应的,在该浓度处理下,二化螟羽化率最低。但Csu-novel-260 agomir不同浓度梯度处理对二化螟幼虫虫重和蛹重无显着影响。采用离体水稻茎秆生测法对二化螟分别进行了为期7 d和28 d的短、长期生测。结果表明:二化螟Cry1C抗性品系和敏感品系在Csu260-16水稻上取食7 d后,与亲本ZH11相比,两品系幼虫存活率均显着下降,同时也说明二化螟Cry1C抗性品系与Csu260-16水稻中表达的Csu-novel-260不存在交互抗性。离体水稻茎秆28 d的长期生测结果表明,Csu260-16水稻上二化螟的死亡率显着高于亲本对照ZH11,且处理28 d后,二化螟死亡率高达87.05%,Csu260-16水稻表现了良好的抗性效果。通过qRT-PCR分析可知,与对照相比,取食Csu260-16水稻的二化螟Csdib基因的表达水平显着下降,说明RNAi抗虫水稻中表达的Csu-novel-260能显着抑制二化螟靶基因的表达。
魏广利[2]（2021）在《核桃赤霉素2-ODDs家族氧化酶基因的克隆与功能分析》文中研究指明赤霉素（GAs）是调控植物生长发育的五大激素之一,在细菌、真菌、植物中广泛存在。GAs的生物合成与代谢是多步骤的酶促反应过程,涉及的关键酶主要来源于3个基因家族:萜烯合成酶基因家族（Terpene synthases,TPSs）、细胞色素P450单加氧酶家族（Cytochrome P450 monooxygenases,P450s）和最后阶段发挥效应的2-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族（2-oxoglutarate-dependent dioxygenases,2-ODDs）。赤霉素GA20ox、GA3ox、GA2ox氧化酶同属于2-ODDs家族,参与调控植物的正常生长发育以及对非生物逆境胁迫的响应。核桃作为世界着名的“四大坚果”之一,随着现代加工产业的发展,人们对其需求量不断增加。然而,核桃树体高大、抗逆性差、优质砧木缺乏等因素严重制约了核桃的种植范围,影响了核桃产业的健康发展。本文以核桃为研究对象,通过对赤霉素氧化酶基因的基因克隆及载体构建、遗传转化、PEG模拟干旱胁迫的功能分析、转基因微型嫁接等研究,以期获得矮化抗干旱的核桃优良砧木,为核桃产业的可持续发展提供理论依据。本研究的主要研究结果如下:（1）成功构建了核桃赤霉素2-ODDs家族氧化酶基因的过表达和干扰载体本研究通过对JrGA3ox基因PCR扩增,采用同源重组的方法,将目的基因与PC1300-GFP过表达载体连接,成功构建了35S::JrGA3ox::GFP过表达载体。将JrGA3ox、JrGA2ox基因克隆得到的保守片段与PTCK303干扰载体连接,成功构建了PTCK303-JrGA3ox、PTCK303-JrGA2ox干扰载体。（2）成功构建农杆菌介导的核桃赤霉素2-ODDs家族氧化酶基因遗传转化体系将过表达载体35S::JrGA20ox::GFP、35S::JrGA3ox::GFP、35S::JrGA2ox::GFP和干扰载体PTCK303-JrGA20ox、PTCK303-JrGA3ox、PTCK303-JrGA2ox以核桃体细胞胚为受体进行农杆菌介导的遗传转化,GFP荧光鉴定显示JrGA20ox、JrGA3ox、JrGA2ox过表达体胚E3代的阳性率分别为91%、88%、89%,GUS组织染色鉴定显示JrGA20ox、JrGA3ox、JrGA2ox干扰体胚E3代的阳性率为87%、83%、86%,体式显微镜下观察到阳性体胚发育经历了球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶形胚4个阶段;对体胚萌发获得的再生株系PCR电泳检测及定量分析,表明成功获得核桃JrGA20ox、JrGA3ox、JrGA2ox基因过表达和干扰阳性再生株系。（3）核桃赤霉素2-ODDs家族氧化酶基因调控植株株高对JrGA20ox、JrGA3ox、JrGA2ox过表达和干扰株系进行表型、株高及节间长度分析,发现JrGA20ox-RNAi、JrGA3ox-RNAi及JrGA2ox-OE植株,表现出半矮化表型,植株更矮,节间更短,与WT植株相比,株高分别减少了33.4%、28.8%、35.9%,节间长度分别减少了30.3%、28.2%、50.0%。JrGA20ox-OE、JrGA3ox-OE及JrGA2ox-RNAi植株表现出增高的表型,株高更高,节间长度更长,与WT相比,株高分别增加了46.5%、60.6%、37.2%,节间长度分别增加了74.4%、48.7%、28.9%。（4）核桃赤霉素2-ODDs家族氧化酶关键基因JrGA20ox响应干旱胁迫PEG模拟干旱胁迫的条件下,JrGA20ox-RNAi干扰株系NBT、DAB、Evans blue染色、H2O2、O2·ˉ、相对电导率、MDA、气孔开度、自然失水率含量均显着低于野生型和JrGA20ox-OE过表达株系;SOD、POD、CAT活性、脯氨酸、叶绿素含量显着高于野生型和JrGA20ox-OE过表达株系;相关抗性基因SOD、POD、LEA、P5SC、GAI相对表达量在胁迫时间内显着高于野生型和JrGA20ox-OE过表达株系,VPE表达量显着低于野生型和JrGA20ox-OE过表达株系。表明核桃JrGA20ox基因表达量与植株抗干旱胁迫能力成反比。（5）核桃赤霉素2-ODDs家族氧化酶基因JrGA20ox响应嫁接植株干旱胁迫分别以JrGA20ox-OE过表达植株和JrGA20ox-RNAi干扰植株为砧木,野生型植株为接穗进行微型嫁接,嫁接15天后发现嫁接植株愈合良好,微型嫁接植株的存活率达90%。通过对嫁接植株的JrGA20ox基因实时荧光定量q PCR在接穗和砧木之间的差异分析,结果显示嫁接影响了JrGA20ox基因的表达。在干旱胁迫条件下,与野生型自嫁接植株相比,JrGA20ox-RNAi干扰株系作为砧木的嫁接植株叶片较绿,植株生长健壮,接穗中的抗旱基因SOD、LEA、P5SC表达量显着升高,VPE基因表达量显着下降,表明JrGA20ox基因负调控嫁接植株的抗旱性。
刘双[3]（2020）在《基于PCR技术的转基因耐除草剂大豆ZH10-6检测方法研究》文中研究表明近些年,随着转基因作物种类及种植面积的增多,含转基因成分的食品种类也在不断丰富。转基因大豆是目前最主要的转基因作物,经济效益巨大。针对其建立检测方法,对转基因食品的有效管理和食品安全具有重要意义。转基因大豆ZH10-6是含有G2-EPSPS基因和GAT基因的耐除草剂大豆新品系,对广谱型除草剂草甘膦具有耐受性,在我国产业化应用前景广阔。本研究以该品系为试验材料,对其分子特征进行测定,设计引物并建立了转基因耐除草剂大豆ZH10-6的定性、定量检测方法。主要结果如下:（1）确定了转基因耐除草剂大豆ZH10-6的分子特征。该材料含有的外源基因为G2-EPSPS基因、GAT基因,含有CaMV35S启动子、CarMV35S终止子、NOS终止子等调控元件,外源基因插入拷贝数CaMV35S启动子为4拷贝、G2-EPSPS基因和NOS终止子为2拷贝、GAT基因、3’端侧翼序列和5’端侧翼序列均为单拷贝,外源基因插入位点为大豆基因组第17号染色体7980527-7980541之间。（2）建立了转基因耐除草剂大豆ZH10-6的普通PCR定性检测方法。引物浓度为0.4 μmol/L,退火温度为54℃时,对转基因耐除草剂大豆ZH10-6的扩增灵敏度可达到0.025 ng/μL,检出限为0.1%,经过加工品测试,该方法特异性高,满足2259号公告-4-2015对定性方法建立的要求,可用于转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体的定性检测。（3）建立了转基因耐除草剂大豆ZH10-6的多重PCR定性检测方法。边界A、边界B、边界C、边界D、内源Lectin引物终浓度分别为0.6μmol/L、0.3 μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.05 μmol/L,退火温度选择为56℃,当ZH10-6含量大于等于1%时,可用本方法检测到。特异性测试显示特异性良好,可用于转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体的定性检测。（4）建立了转基因耐除草剂大豆ZH10-6的实时荧光PCR相对定量检测方法。经试验确定体系引物浓度为0.4μmol/L,探针浓度为0.2μmol/L,特异性测试结果良好,检出限为0.032%,定量限为0.16%。建立的标准曲线为:Y=-3.416X+30.257,在模板含量为0.0064%～100%范围内线性度大于0.995,扩增效率为95.4%～96.2%,满足2259号公告-5-2015对实时荧光PCR检测方法建立的要求,适合应用于转基因耐除草剂大豆ZH10-6的进一步定量分析。（5）建立了转基因耐除草剂大豆ZH10-6的微滴式数字PCR精准定量检测方法。确定引物探针浓度为0.5 μmol/L,退火温度为60℃,本方法在RSD小于25%的情况下检出限为0.016%,定量限为0.08%,DNA含量与拷贝数间的线性关系为:Y=23.593X+40.205,线性度大于0.998。经加工品测试,本方法可应用于转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列含量的精准定量研究。综上,本研究通过分子特征测定确定了转基因耐除草剂大豆ZH10-6准确的序列信息,再设计引物,建立了转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体的单重PCR定性检测方法、多重PCR定性检测方法、实时荧光PCR相对定量检测方法、微滴式PCR精准定量检测方法,为转基因耐除草剂大豆ZH10-6的定性、定量检测提供了新的技术手段,为该转基因大豆品系商品化后转基因产品成分检测提供了技术支撑。
张秀杰[4]（2020）在《转基因水稻检测方法与标准物质研究》文中研究指明转基因水稻的研发技术日益成熟,越来越多的转化体获得不同国家的安全许可或进入田间试验,但作为重要主粮,其产业化及安全性问题引起社会广泛关注,近年来,有关转基因水稻的突发事件时有发生,引起了不必要的贸易摩擦和民众恐慌,国内外都高度重视转基因水稻的安全评价与监管检测工作。因此,加强转基因水稻检测方法与标准物质的研究,提升监管能力水平十分必要。本研究首先针对基于硅基质膜柱的基因组DNA提取方法进行优化,开发了新型植物种子基因组DNA提取试剂盒,同时对水稻种子研磨粒度与基因组DNA提取质量之间关系进行分析,提高基因组DNA质量和得率,为下一步PCR检测提供基础;其次对已发现的和本研究开发的水稻内标准基因,以及反应体系与程序进行优化筛选、深入研究,研制了水稻内标准基因检测方法标准;再次对转基因水稻的筛选元件进行统计分析,建立了转基因水稻筛查检测方法,构建了检测用阳性标准质粒;最后成功研制了转基因抗虫水稻克螟稻基因组DNA标准物质,为检测提供物质基础。这些结果为我国转基因水稻安全评价与管理、标识制度的实施,以及监管检测提供了数据基础和技术支撑。本研究我们取得的主要成果如下:1.研发了一种新型植物种子DNA提取试剂盒。基于核酸的PCR技术是转基因检测最稳定、可靠、高效的方法,而获取高质量的基因组DNA是保证检测结果的重要基础,各生物公司也相继开发了多种DNA提取的试剂盒,但在实际应用中,存在提取质量和得率不高以及成本较高的问题,本研究基于硅基质膜柱的方法,通过对过柱缓冲液的pH值和盐浓度的优化,研发一种植物种子DNA提取试剂盒,与市售业内评价较高的试剂盒相比,在基因组DNA提取质量和得率上都有显着提高,并针对水稻种子研磨粒度对基因组DNA提取效率开展研究,为下一步PCR检测提供了基础;2.研制了转基因水稻内标准基因检测的国家标准。国内外相继建立了多种转基因水稻转化体特异性检测方法,但由于不同内标准基因的使用,影响了检测结果间的可比性。本研究以国内外标准、文献中已发表的水稻内标准基因,以及通过本研究筛选的新水稻内标准基因为对象,设计引物及探针,比较不同内标准基因在不同水稻品种中的差异性和检测的灵敏度,进行深入的分析和比较,筛选出具有较好的种间特异性、种内一致性、拷贝数稳定,以及灵敏度较高的水稻内标准基因,并对其PCR扩增检测相关的反应程序和反应体系进行优化,建立标准化水稻内标准基因的普通PCR及实时荧光PCR定性检测方法,进一步为我国转基因水稻安全管理、标识制度的实施,以及转基因检测标准化提供技术支撑;3.建立了转基因水稻筛选检测方法,构建了阳性标准质粒。在转基因水稻日常检测中,各检测机构没有确定统一的检测参数,时而会出现相同样品在不同检测机构之间检测结果不同的现象,给客户及政府执法带来了不确定性,也给检测机构带来了不必要的纠纷。本研究收集、统计了国内外报导的转基因水稻外源元件,并分析这些元件的使用频率及覆盖率,进一步建立了转基因水稻的筛查检测方法,同时构建了筛查与特定转化体检测用阳性标准质粒,为转基因水稻的监管检测提供了统一标准;4.研制了转基因水稻克螟稻基因组DNA标准物质。转基因抗虫水稻克螟稻在我国已进入生产性试验研究阶段,国内外都非常关注,其检测方法及检测标准已相继发布,但至今尚未有检测用标准物质或标准品。本研究以克螟稻为基础材料,建立了克螟稻数字PCR检测方法,提取其基因组DNA,通过均匀性和稳定性测试,以数字PCR方法通过8家实验室联合定值,成功研制了克螟稻基因组DNA标准物质,填补了国内空白,也为水稻的监管检测提供重要的物质基础。
姚兴兰[5]（2020）在《维生素E和植酸酶性状聚合转基因玉米的获得和鉴定》文中研究表明玉米是动物饲料的主要原料,但玉米籽粒中高活性的α-生育酚含量较低,而且玉米籽粒中的磷主要是以有机磷—植酸磷的形式存在,单胃动物不能有效吸收利用。因此,饲料中需要添加合成的DL-α-生育酚醋酸酯和无机磷或者微生物来源的植酸酶来满足动物生长发育的需要,这使得饲料成本大大增加,而且未被消化的植酸磷还会随动物粪便排出体外造成磷污染。为此,本研究构建了多基因串联表达载体,利用农杆菌侵染法转化玉米,获得了维生素E含量和植酸酶酶活均提高、且具有草铵膦抗性的转基因玉米材料,并对转基因玉米的分子特征、农艺性状以及籽粒营养成分等进行了分析。主要结果如下:1、构建了含有多基因表达盒的表达载体pCAMBIA3301ZTAO和pCAMBIA3301ZTGHAO,载体pCAMBIA3301ZTAO含有胚特异性启动子13387驱动、Glb1终止子终止的玉米γ-生育酚甲基转移酶基因ZmTMT表达盒,胚乳特异性启动子123387驱动、LEG1终止子终止的植酸酶基因AO表达盒和组成型启动子CaMV35S驱动、CaMV35S polyA终止子终止的草铵膦抗性基因Bar表达盒三个表达盒;载体pCAMBIA3301ZTGHAO含有上述三个表达盒和胚特异启动子2941驱动、NOS终止子终止的大豆尿黑酸植基转移酶基因Gm HPT表达盒共四个表达盒。采用农杆菌侵染的方法侵染玉米幼胚,获得了具有草铵膦抗性的转基因玉米ZTAO和ZTGHAO转化体。ZTAO转化体有2个转化事件;ZTGHAO有4个转化事件。ZTAO和ZTGHAO的转基因植株与自交系郑58/昌7-2杂交获得F1,然后郑58/昌7-2再回交5代,自交2代获得BC5F3。2、Southern blot初步推断ZTAO-1#和ZTGHAO-1#的外源插入均为1个拷贝;ZTAO-1#和ZTGHAO-1#的5’端和3’端侧翼序列均已分析清楚:ZTAO-1#插入位点为>chromosome:AGPv4:8:8179701353,处于基因间隔区,插入导致外源序列和基因组序列分别缺失93 bp和131bp;ZTGHAO-1#的插入位点为>chromosome:AGPv4:7:6967877,处于基因间隔区,插入导致外源序列和基因组序列分别缺失258 bp和18 bp;缺失未对基因表达产生影响;RT-PCR和Western blot实验结果显示,ZmTMT,AO,GmHPT,Bar基因在转录水平和蛋白水平的表达量均显着高于对照材料。3、ZTAO、ZTGHAO转基因玉米籽粒中90%以上的γ-生育酚转化成α-生育酚,其中ZTAO-1#,2#的α-生育酚含量分别为51.58 mg/kg和66.18 mg/kg,是对照的4.9倍和6.3倍,ZTGHAO-1#、2#、3#、4#的α-生育酚含量分别达到54.91 mg/kg、52.32 mg/kg、44.73 mg/kg和37.54 mg/kg,是对照的5.4倍、5.17倍、4.42倍和3.6倍。ZTGHAO-1#,2#,3#,4#籽粒中维生素E总量达到101.03 mg/kg,96.99 mg/kg,86.24 mg/kg和66.07 mg/kg,是对照的1.37倍、1.31倍、1.17倍和1.09倍。4、ZTAO-1#,2#籽粒中植酸酶酶活分别为10884.74 U/kg和12864.53 U/kg;ZTGHAO-1#,2#,3#,4#籽粒中植酸酶酶活分别达到9104.70 U/kg,10412.16 U/kg,14509.70 U/kg和15549.37U/kg。5、ZTAO-1#籽粒中主要营养成分——18种氨基酸、粗脂肪、粗蛋白、干物质、钙与对照相比未发生显着变化,ZTAO-2#和ZTGHAO-1#,2#,3#籽粒中的氨基酸和粗蛋白含量总体稍高于对照,但未产生任何不利影响;ZTAO和ZTGHAO植株的农艺性状,包括株高、穗位、穗行数、行粒数、轴粗、穗长等与对照相比也未发生显着变化;ZTAO和ZTGHAO的籽粒萌发率和花粉活性均与对照无显着差异。综上所述,本研究获得的ZTAO和ZTGHAO转基因株系,在增加了α-生育酚含量、提高了植酸酶酶活、具有草铵膦抗性的同时,未对玉米本身的农艺性状、种子萌发率和营养成分产生不利影响,将来可以用作玉米杂交种的开发应用,降低饲料成本,提高磷的利用率,减少环境污染。
常英英[6]（2020）在《核桃WOX和SPL基因在不定根发生中的作用研究》文中认为核桃属较难诱导不定根的经济树种,这限制了核桃优良品种的产业化进程。通过连续嫁接和埋干黄化等复幼措施,可实现成龄植株的复幼,获得的嫩枝插穗同步性高、生根率稳定,且生根速度快,扦插生根率大幅度提高。前期研究发现,复幼处理诱导WOX和SPL转录因子及其下游靶基因表达模式的变化,可能是复幼提高核桃不定根发生能力的重要原因,然而,这些转录因子在核桃不定根发生过程中的功能还有待深入研究。体细胞胚是木本植物基因功能研究的良好受体,本研究以核桃幼胚为试材,分别构建体胚发生和遗传转化体系,为核桃基因功能研究奠定了基础。通过生物信息学技术在全基因组范围内鉴定和分析WOX和SPL转录因子家族,结合组织特异表达分析筛选在复幼促进核桃插穗不定根发生过程中的关键基因并进行遗传转化,分析关键基因在调控核桃不定根发生中的调控机制,主要研究结果如下:1.创建了核桃体胚发生和植株再生体系。以核桃早实品种‘早林香’和‘中林6号’花后42d～77d的幼胚为试材进行离体培养,通过统计体胚诱导率,筛选体胚的最佳诱导时期;统计多次继代的体胚畸变率,并筛选最适ABA调节浓度;选取发育成熟的体胚进行饱和NH4·NO3溶液脱水处理,分别处理0h～120h后统计失水量和转株率,探讨脱水程度对体胚植株再生的影响。结果表明,外植体的发育时期对体胚发生至关重要,以‘林早香’和‘中林6号’幼胚为外植体进行体胚诱导,最佳诱导时期分别为花后约49d和56d,体胚诱导率分别为88.32%和86.7%。最佳ABA调节浓度为1.0mg·L-1,不仅降低体胚畸变率,且提高体胚发生率。脱水72h时,‘早林香’和‘中林6号’的体胚萌发率达到最高,分别为56.67%和53.33%。2.建立了核桃体胚遗传转化体系。以‘中林6号’体胚为受体材料,进行遗传转化条件的优化,分别研究体胚预处理、农杆菌浓度及侵染时间对对核桃遗传转化的影响。通过正交试验分析显示,体胚预处理对核桃体胚侵染效果的影响达到显着水平,农杆菌浓度和侵染时间的影响则不显着。体胚预培养28d（7d换一次培养基）和农杆菌浓度为OD600值0.6,侵染处理15min的处理效果最好,侵染成活率达77.78%。3.在全基因组范围内鉴定了核桃WOX转录因子家族,并分析其在核桃不定根发生过程中的表达模式。核桃基因组中共鉴定出12个WOX家族基因,分为3个分支。组织表达特异性分析表明,JrWOX4a、JrWOX4b、JrWOX5、JrWOX11和JrWOX13基因在根中的表达量较高,其中JrWOX11在根中特异性表达。此外,复幼处理可显着提高除JrWOX4a、JrWOX4b和JrWOX13之外其他WOX基因的表达量。在不定根发生过程中,JrWOX11和JrWOX5表达水平显着提高,而其他WOX基因表达量变化不显着或降低。4.探讨了3个核桃JrWOX基因对银腺杨不定根发生的影响。在‘84K’杨中过表达JrWOX4、JrWOX5和JrWOX11基因均促进不定根的形成。JrWOX11和JrWOX5过表达分别促使不定根原基形成提前2d和1d,不定根数和根长显着增加;JrWOX4过表达导致不定根变短、增粗,不定根数增加。JrWOX11过表达还可提高‘84K’杨的抗渗透胁迫和耐盐能力。创制核桃JrWOX11基因的过表达和基因编辑材料,表型分析结果表明,在株高、基径和髓心宽度方面过表达植株>对照植株>编辑植株,形成层宽度方面过表达植株>编辑植株>对照植株,木质部宽度方面过表达植株<编辑植株<对照植株。不定根诱导试验结果显示,JrWOX11可显着促进核桃不定根形成。5.鉴定了核桃SPL家族基因并分析了其在不定根发生过程中的表达模式。利用生物信息学方法,从核桃基因组中鉴定出28个SPL家族基因,不均匀地分布在14条染色体上,分属于subgroupⅠ～Ⅹ等10个亚分支。各亚分支SPL家族基因结构差异较大,系统进化系相近的成员具有相似的内含子/外显子结构、基因长度和保守基序,这些基因可能有相似的功能。28个SPL家族成员均含有保守的SBP结构域,包含2个Zn-fingers和一个核定位信号序列（NLS）。复幼处理抑制了大多数JrSPL基因的表达;不定根发生过程中,JrSPL1.1和JrSPL7.2基因表达量变化显着,JrSPL1.1的表达量先升高后降低,JrSPL7.2的表达量逐渐降低。6.初步研究了2个核桃JrSPL基因的生物学功能。亚细胞定位结果显示,JrSPL1.1定位在细胞核,而JrSPL7.2在细胞核和细胞质中表达。烟草中过表达JrSPL7.2,显着抑制了不定根和侧根的形成,促进了主根伸长,开花时间显着提前;在核桃中,过表达JrSPL7.2抑制了植株生长。过表达JrSPL1.1促进核桃不定根的发生,同时促进植株生长,株高和叶片大小显着大于对照植株。
严泽埔[7]（2019）在《基于赤霉素矮化基因诱导的薄壳山核桃砧木的培育》文中研究指明薄壳山核桃（Carya illinoensis）又称长山核桃、美国山核桃,为世界着名的经济干果树种,其果实营养丰富,保健价值高。研究发现,长期食用美国山核桃有明显的防衰老、健肠胃、防治心脏病、心血管疾病等作用。然而,薄壳山核桃树体高大,不利于人工采摘果实及日常的养护管理,培育矮化砧木可为薄壳山核桃育种工作及果品的推广提供便利。赤霉素（Gibberellins,GAs）是调控植物株高的重要激素,与之生物合成与转运相关基因的克隆与分子机制研究对于合理调控植物生长发育和农业生产具有极其重要的利用价值。本论文对薄壳山核桃进行100 mg L-1的赤霉素喷施处理,通过实时荧光定量检测在不同时期（0d、7d、14d、21d、28d）CiGA20ox、CiGA3ox和 CiGA2ox 的相对表达量以及0d和28d三个基因的空间表达量,以初步了解CiGA20ox、CiGA3ox和CiGA2ox对赤霉素的响应规律;通过农杆菌介导法将目的赤霉素矮化基因转入薄壳山核桃体胚内,后脱菌增值培养,最后进行干燥萌发,以获得薄壳山核桃矮化植株。主要研究结果如下:1、外施赤霉素四周后,薄壳山核桃节间长度和主根伸长量与对照相比都显着增长。其中植株平均生长量达2.9cm,将近为对照的1.93倍,差异极显着。然而节间数没有发生变化。2、实时荧光定量PCR结果表明GA20ox、GA3ox和GA2ox在薄壳山核桃生长期存在时空表达差异。外施赤霉素能够使CiGA20ox的表达量持续下降,28d后的表达量仅为初始值的38.6%;而CiGA3ox表达量则是在7d时跌落低谷,下降至初始值的55.4%,28d后回升,表达量为初始值的350%;CiGA2ox表达量总体则呈波浪形变化,在7d后达到顶峰,之后有所回落至21d时恢复到了初始水平,28d后上升为初始值的220%。而CiGA3ox在薄壳山核桃植株茎秆内发生了累积,相较于CiGA20ox和CiGA2ox在转录水平上发生了较大的变化。3、薄壳山核桃CiGA2ox、CiGA20ox和CiGA3ox与山核桃和核桃的亲缘关系较近,且与山核桃的亲缘关系最近。可见同科植物的GA20ox、GA2ox和GA3ox蛋白同源关系较近,表明薄壳山核桃GA20ox、GA2ox和GA3ox蛋白在进化方面较为保守。4、将GA20ox的RNA干扰载体通过农杆菌介导法转入薄壳山核桃体胚内,获得了薄壳山核桃的阳性体胚及阳性再生植株。结果发现,RNA干扰使薄壳山核桃再生植株GA20ox基因表达量下降,为野生型的27.5%,差异极显着。RNA干扰后的薄壳山核桃再生植株株高显着降低,为野生型的45%。并且干扰后的再生植株节间缩短,叶片变小叶色变浅。为进一步验证RNA干扰结果的可靠性,本研究还进一步将GA20ox过表达载体转入薄壳山核桃体胚内,结果表明,过表达再生植株体内基因表达量下降,株高显着增高,节间伸长,叶片变大叶色变浅。5、将GA2ox的过表达载体通过农杆菌介导法转入薄壳山核桃体胚内,获得了薄壳山核桃的阳性体胚及阳性再生植株。qRT-PCR检测结果表明,阳性再生植株CiGA2ox基因表达量显着上升,为野生型的2.64倍,过量表达CiGA2ox基因的再生植株株高显着低于对照,为野生型的52%,节间缩短,叶片变小叶色变深。
高慧娟[8]（2019）在《梭梭适应模拟干旱的差异表达基因分析及HaASR基因的功能鉴定》文中研究说明我国荒漠化土地达261.2万km2,占国土面积的27.2%,已成为世界上受干旱与荒漠化影响最为严重的国家之一。在长期的演变过程中,植物逐渐形成了各种机制来适应干旱环境。藜科梭梭属植物是沙漠地区特有的超强抗逆小乔木,有着“沙漠卫士”的美誉。然而,目前关于梭梭适应干旱环境的机制尚不清楚,特别是分子生物学方面的研究很少。分析梭梭的抗逆机制,挖掘胁迫响应基因,对于优良牧草和农作物的遗传改良和生态环境恢复重建具有重要意义。因此,本研究以梭梭为材料,首先对模拟干旱（-0.75 MPa）处理下的梭梭幼苗进行转录组（RNA-seq）测序分析,解析其干旱胁迫响应通路,挖掘其重要的抗旱相关候选基因;并以模拟干旱胁迫下显着上调的HaASR1和HaASR2（abscisic acid,stress and ripening）基因为研究重点,克隆了它们的全长,分析了它们在拟南芥抵御非生物胁迫过程中的作用。取得如下主要结果:1.通过对梭梭进行RNA-seq分析,得到了平均长度为680 bp的Unigenes87,109个,同时鉴定到13,486个SSRs。DGE分析发现,模拟干旱处理下地上部分总共有3,353个差异表达基因（DEGs）,6和24 h下分别有811和1,220个基因上调表达;根部总共有4,564个DEGs,6和24 h下分别有508和1,219个基因上调表达,其中上调基因主要富集在茉莉酸、乙烯、水杨酸刺激响应、类黄酮代谢以及氧化和渗透胁迫响应通路。2.模拟干旱处理下,梭梭地上部与多酚氧化酶（PPO）、花青素合成以及谷胱甘肽过氧化物酶途径（GPX）相关的基因大多数呈上调表达,说明PPO、花青素以及GPX在梭梭地上部响应氧化胁迫过程中发挥主要作用。根部与超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸（AsA）、花青素合成以及GPX途径相关的基因大多数呈上调表达,说明干旱初期梭梭根部具有较强的的抗氧化能力来缓解活性氧造成的伤害。3.模拟干旱处理下,地上部与乙烯、脱落酸（ABA）和茉莉酸合成相关的基因大多数都上调表达,使之积累了较高水平的ABA、乙烯和茉莉酸。梭梭根部,氨基环丙烷羧酸氧化酶（ACO）和脂氧合酶（LOX）基因上调数目最多,且氨基环丙烷羧酸合酶（ACS）和丙二烯氧合酶（AOS）基因均上调表达。与光合相关的DEGs在6 h下有20个上调,22个下调,其中与叶绿素合成、细胞色素B6/F复合物以及光系统II相关的基因大多数呈上调表达,叶绿素降解基因大多数下调表达,说明干旱胁迫初期梭梭通过维持叶绿素和光合电子传递的稳定来保持一定的光合效率。4.模拟干旱处理下,地上部编码胚胎发育晚期蛋白（LEA）、ASR、海藻糖磷酸合酶（TPS）、甜菜碱醛脱氢酶（BADH）、磷酸乙醇胺甲基转移酶（PEAMT）以及甘露醇脱氢酶（MDH）蛋白的基因几乎全部上调表达,说明干旱胁迫下梭梭地上部积累了大量的LEA、ASR、海藻糖、甜菜碱以及甘露醇来应对渗透胁迫。梭梭根部编码LEA、ASR、△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）和TPS蛋白的基因大多数都呈上调表达,说明LEA、ASR、P5CS和TPS在梭梭根部应对渗透胁迫过程中发挥着重要作用。5.克隆得到了全长382 bp、ORF长为333 bp的HaASR1基因,全长479 bp、ORF长为324 bp的HaASR2基因。HaASR1和HaASR2均属于高亲水性蛋白,含有高度保守的ABA/WDS结构域。两个基因主要在根中表达,并受盐和干旱显着诱导。亚细胞定位发现HaASR1和HaASR2蛋白定位于烟草下表皮整个细胞内;通过酵母系统以及双分子荧光互补（BiFC）实验,发现HaASR1与HaPrxQ、HaBADH存在互作,HaASR2与HaNHX1存在互作。在此基础上,构建HaASR1和HaASR2过表达载体,并分别转化入拟南芥。6.HaASR1过表达植株中AtALDH10A9（与HaBADH同源性较高）和AtPrxQ（与HaPrxQ同源性较高）的表达显着高于野生型。ABA处理下,过表达HaASR1促进了拟南芥种子萌发和幼苗生长,减少了其对外源ABA的敏感性。NaCl处理下,过表达HaASR1增加了叶片脯氨酸和甜菜碱积累而降低了渗透势,降低了质膜透性,维持了体内水分含量、叶绿素含量、光合能力和植株的生长,从而提高了植株的耐盐性。干旱处理下,过表达HaASR1降低了叶片失水速率,增强了植株持水性,维持了体内水分稳定;降低了AtABA1和AtAAO3的表达,减少了ABA积累从而延缓了植株对干旱的感知;促进了AtCAT2、AtAPX1和AtPrxQ的表达,减少了H2O2积累,保护了叶肉细胞和叶绿体免于损伤,从而维持了光合能力和植株生长。7.HaASR2过表达植株中AtNHX2（与HaNHX1同源性较高）的表达显着高于野生型。ABA处理下,过表达HaASR2促进了种子萌发和幼苗生长,减少了对ABA的敏感性。NaCl处理下,过表达HaASR2增加了叶片脯氨酸含量,降低了渗透势,维持了体内水分含量;降低了质膜透性;维持了叶绿素含量、光合能力和植株的生长,从而提高了植株的耐盐性。干旱处理下,过表达HaASR2减少了叶片失水速率,增加了叶片脯氨酸和甜菜碱积累从而降低渗透势,维持了体内水分稳定;降低了AtABA1的表达,减少了ABA积累,延缓了植株对干旱的感应;促进了AtCAT2和AtAPX1的表达,降低了H2O2积累和质膜透性,增强了植株抗氧化能力,从而维持了光合能力和植株生长。以上结果表明,抗氧化蛋白（PPO、花青素、GPX、SOD和AsA）、茉莉酸、乙烯、ABA和渗透调节物（LEA、ASR、海藻糖、甜菜碱、脯氨酸和甘露醇）在梭梭响应渗透胁迫中发挥着重要功能;HaASR1和HaASR2在植物适应盐和干旱胁迫过程中发挥了重要作用。研究结果为阐明梭梭适应逆境的分子机理和挖掘其抗旱耐盐相关的重要功能基因奠定了一定的基础,为优良牧草和农作物的遗传改良提供了基因资源。
刘会君[9]（2019）在《核桃JrAMT基因的克隆与功能分析》文中研究表明氮素是生物体内蛋白质、氨基酸等多种物质的组成部分,也是植物生长最重要的矿质元素之一,被称为生命元素,植物可吸收利用的主要氮源是铵态氮和硝态氮。目前,农作物生长过程中普遍存在氮素利用率较低,大量施用氮肥仍是提高农作物产量的主要手段。研究表明,过多施用氮肥可导致作物抗逆能力下降、土壤结构破坏以及水体污染等。因此,开展氮素高效利用作物种质创新已成为提高氮素利用率的重要途径。核桃（Juglans regia L.）为世界最重要“四大坚果”之一,为国家木本油料发展战略树种。本论文以核桃为研究对象,开展了核桃铵转运蛋白（AMT,ammonium transporter）基因克隆、过表达载体构建,同源转化核桃体细胞胚等研究,以期获得生长良好的核桃铵态氮高效利用再生植株。本研究的主要研究结果如下:（1）成功克隆核桃JrAMT基因、构建过量表达载体并开展了亚细胞定位分析通过同源克隆法成功克隆了核桃JrAMT基因全长cDNA,进行生物信息分析结果表明,该基因长度为1464bp,经过NCBI在线序列比对显示该基因的序列编码的氨基酸序列属于Ammonium Transporter Family。该基因编码的蛋白分子量约为121.55kd,理论等电点为4.75,属于酸性蛋白。使用GFP作为融合报告基因,成功构建由CaMV35S（强启动子）启动的过量表达载体35S-JrAMT-GFP。烟草表皮亚细胞定位的结果显示,该融合蛋白定位于细胞膜。（2）成功开展核桃体细胞胚的遗传转化并获得阳性再生植株以核桃野生型体胚为受体,通过农杆功介导法开展了35S-JrAMT-GFP载体的遗传转化。结果表明:羧苄青霉素可以有效抑制由农杆菌导致的体胚污染;通过继代培养可以有效降低转化体胚的褐化,并提高转化体胚的诱导率;采用潮霉素筛选培养可以显着提高转化体胚的阳性率;对PCR检测获得2000bp左右目的片段的再生植株进一步进行RT-PCR荧光定量分析,JrAMT基因相对表达量显着高于对照的再生植株确定为核桃35S-JrAMT-GFP阳性植株。（3）核桃JrAMT基因的功能验证通过对核桃35S-JrAMT-GFP阳性植株的株高、叶绿素含量、氮素含量和干物质量观察检测发现,35S-JrAMT-GFP阳性植株的叶绿素含量、氮素含量、株高和干物质量均显着高于对照植株,说明核桃JrAMT基因可以促进植株叶绿素合成、氮素吸收和营养器官建成,在功能建成方面发挥重要作用。
石兴露[10]（2019）在《基因开关系统在两系杂交稻上的效果验证和应用研究》文中研究指明转基因粮食作物的食用安全性问题一直是公众争议的热点,也是转基因粮食作物迄今为止在全国乃至全球范围内尚未能得以商业化或广泛商业化种植的重要原因。2012-2016年期间,本课题组利用水稻绿色组织特异性表达启动子rbcS、位点特异性重组系统Cre/loxP、核定位信号krp2和终止子nosT等组件,致力开发了一种“基因开关”系统,使其控制的外源基因只在除种子外的绿色组织部位精确表达,为转基因作物食用安全性问题提供了全新和可行的解决途径。为了成功将“基因开关”系统由基础研究推向农业生产应用,本文以“基因开关”系统为核心,围绕胚乳零表达型两系抗虫及抗除草剂杂交水稻亲本种质创造及其组合选育工作展开研究,所获得的主要研究结果如下:一、“基因开关”系统在两系杂交水稻上的工作状况被证实是可行的:选用实验室已有的基因开关转化的两系亲本材料配制了 5个不同的抗虫杂交组合201S-K1/ZR6-LB2、201S-K4/ZR6-LB2、201S-K17/ZR6-LB2、201S-K17/551-LB6和604S-K5/ZR6-LB2,并分别于.水稻分蘖、抽穗和灌浆三个时期检测其叶片、茎秆以及灌浆完熟期糙米和精米中Cry1Ab/1Ac蛋白的含量。结果显示,抗虫蛋白Cry1Ab/1Ac在所配5个杂交组合的叶片及茎秆中都能有效表达,其中,叶片中测得的含量落在270ng/g-1020ng/g之间,而茎秆中测得的含量分布于160ng/g-410ng/g之间,且所有杂交组合的糙米及精米中的Cry1Ab/1Ac蛋白含量均与野生型对照无显着差异。室内人工接虫及田间自然爆发抗性鉴定结果显示:各基因开关杂交组合的抗虫性良好,其室内叶片样本二化螟致死率为100%,极显着高于阴性对照的12.04%;田间卷叶螟危害率仅0.72%,极显着低于对照的62.81%;农艺性状考察结果显示:各性状指标与野生型对照相比均无不利改变。这些结果因此表明,“基因开关”系统在这些两系杂交组合中如所预期一样工作正常,同时该结果也证明应用基因开关系统培育胚乳零表达抗虫蛋白的抗虫两系杂交水稻完全可行。二、成功地应用“基因开关”系统创制了无标记的抗虫两系杂交水稻:分别以本实验室自育的优质不育系201S和恢复系551为受体,进行新一轮的遗传转化和种质创新,获得了一批新的201S-KEY（含Cre基因）和551-LB（含Cry1Ab/1Ac基因）独立转化体,并通过PCR阳性检测和Southern杂交拷贝数鉴定筛选出无标记的转化系201S-KEY9和KEY12和551-LB1、LB7、LB13和LB16,其中,551-LB7、LB16为单拷贝纯系,将它们相互配组共获得5个杂交组合:201S-K9/551-LB1、201S-K9/551-LB7、201S-K9/551-LB13、201S-K9/551-LB16、201S-K12/551-LB1。杂种F1代苗期叶片的ELISA分析结果显示:Cry1Ab/1Ac蛋白在所有这5个无标记的单拷贝杂交组合中均有效表达,而且有效范围的蛋白含量正处在130ng/g-630ng/g之间。三、成功地应用“基因开关”系统创制了抗除草剂两系杂交水稻:以华中农业大学刘子铎教授提供的新型抗草铵膦除草剂基因RePAT为目的基因,以本课题组自育的优良恢复系112为受体进行农杆菌介导的遗传转化法,共获得数十份独立转化体,并通过PCR阳性检测和Southern杂交拷贝数分析,鉴定出一批无标记的单拷贝转化系。之后,选其部分转化系与前面获得部分的201S-KEY转化系配组,也配制出 5 个杂交组合:201S-K17/112-LR1、201S-K4/112-LR16、201S-K1/112-LR21、201S-K1/112-LR24、201S-K4/112-LR26。杂种F1 代qRT-PCR分析结果显示,在mRNA水平上,抗草铵膦基因RePAT在这5个杂交组合中均能正常表达;以在苗期及分蘖期叶片上涂抹草铵膦的方式进行的抗性鉴定结果显示,当草铵膦涂抹浓度在≤250mg/L时,转基因叶片完全不受影响,当草铵膦浓度达到350mg/L时,转基因叶片开始受轻微影响,达到500mg/L时才出现较严重的受害症状;而与之成鲜明对比的是,当草铵膦涂抹浓度在100mg/L时便开始对非转基因叶片产生影响,当达到150mg/L时便能使非转基因叶片呈现严重受害症状,以致变黄枯萎。这些结果说明基因开关控制的抗除草剂基因RePAT在两系杂交稻上也工作正常。
二、烟草bar基因的转化及其转化体快速检测方法的研制（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、烟草bar基因的转化及其转化体快速检测方法的研制（论文提纲范文）
（1）RNAi抗虫水稻Csu260-16对靶标害虫二化螟的抗性评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 水稻害虫二化螟 |
| 1.2.1 二化螟为害现状 |
| 1.2.2 二化螟防治现状 |
| 1.3 RNA干扰 |
| 1.3.1 RNA干扰的基本概况 |
| 1.3.2 RNA干扰途径和机制 |
| 1.3.3 RNA干扰技术的应用 |
| 1.4 基于RNAi技术的转基因抗虫作物的研发 |
| 1.5 基于RNAi技术的害虫防治的优点与风险 |
| 1.5.1 基于RNAi技术的害虫防治的优势 |
| 1.5.2 基于RNAi技术的转基因抗虫作物的生态安全性 |
| 1.6 本研究目的与意义 |
| 第二章 RNAi抗虫水稻中Csu-novel-260 的表达分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 主要试剂耗材及仪器设备 |
| 2.1.3 RNAi抗虫水稻中Csu-novel-260 的时空表达分析 |
| 2.1.4 RNAi抗虫水稻中Csu-novel-260的表达量分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 RNAi抗虫水稻中Csu-novel-260 时空表达 |
| 2.2.2 RNAi抗虫水稻中Csu-novel-260 绝对表达量 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 二化螟的生物测定及靶基因表达量分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试材料 |
| 3.1.2 主要试剂耗材及仪器设备 |
| 3.1.3 二化螟饲料取食生测 |
| 3.1.4 二化螟离体水稻组织生测 |
| 3.1.5 二化螟靶基因Csdib的表达分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 Csu-novel-260 agomir在人工饲料中的稳定性 |
| 3.2.2 二化螟饲料取食生测 |
| 3.2.3 二化螟离体水稻组织生测 |
| 3.2.4 二化螟靶基因Csdib的表达分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 4.1 主要结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）核桃赤霉素2-ODDs家族氧化酶基因的克隆与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 胡桃科坚果树种研究概述 |
| 1.1.1 坚果树种组织培养体系研究进展 |
| 1.1.2 坚果树种遗传转化体系研究进展 |
| 1.2 赤霉素GAs研究概述 |
| 1.2.1 赤霉素的研究进展 |
| 1.2.1.1 赤霉素合成代谢通路概括 |
| 1.2.1.2 赤霉素2-ODDs家族氧化酶基因研究进展 |
| 1.2.1.3 赤霉素信号转导通路研究概括 |
| 1.2.2 赤霉素合成代谢通路关键酶调控株高的研究进展 |
| 1.2.3 赤霉素关键酶调控抗旱性研究进展 |
| 1.2.3.1 赤霉素合成代谢通路关键酶基因参与抗旱胁迫响应 |
| 1.2.3.2 赤霉素信号转导通路关键基因参与抗旱胁迫响应 |
| 1.3 植物嫁接砧穗间相互作用研究进展 |
| 1.4 本文研究目的与意义 |
| 1.5 .本实验研究技术路 |
| 2 核桃赤霉素2-ODDs家族氧化酶基因的载体构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 核桃赤霉素氧化酶基因JrGA3ox、JrGA2ox的基因克隆 |
| 2.2.1.1 核桃总RNA的提取及反转录成cDNA |
| 2.2.1.2 PCR扩增 |
| 2.2.1.3 目的片段胶回收 |
| 2.2.2 核桃赤霉素氧化酶基因JrGA3ox的过表达载体的构建 |
| 2.2.2.1 基因片段与载体质粒PC-1300-GFP连接 |
| 2.2.2.2 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 |
| 2.2.2.3 菌检、测序、质粒提取 |
| 2.2.2.4 转化农杆菌 |
| 2.2.3 核桃赤霉素氧化酶基因JrGA3ox、JrGA2ox干扰载体的构建 |
| 2.2.3.1 保守片段与T载体连接 |
| 2.2.3.2 保守片段与载体质粒PTCK303 连接与酶切验证 |
| 2.2.3.3 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 |
| 2.2.3.4 菌检与测序 |
| 2.2.3.5 转化农杆菌 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 核桃赤霉素氧化酶基因JrGA3ox过表达载体的构建 |
| 2.3.2 核桃赤霉素氧化酶基因JrGA3ox,JrGA2ox干扰载体的构建 |
| 2.3.3 测序结果与序列分析 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 3 核桃赤霉素2-ODDs家族氧化酶基因遗传转化体系构建 |
| 3.1 .材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 农杆菌介导的核桃体细胞胚遗传转化 |
| 3.2.1.1 农杆菌的扩大培养 |
| 3.2.1.2 农杆菌的浓度测定及计算 |
| 3.2.1.3 农杆菌介导的核桃体胚转化 |
| 3.2.2 核桃转化体胚阳性鉴定及阳性率统计 |
| 3.2.2.1 转化体胚的荧光检测 |
| 3.2.2.2 转化体胚的GUS组织染色检测 |
| 3.2.3 核桃转化体胚的PCR凝胶电泳鉴定 |
| 3.2.3.1 体胚的DNA提取 |
| 3.2.3.2 PCR凝胶电泳验证 |
| 3.2.3.3 干扰载体转化体胚的PCR凝胶电泳鉴定 |
| 3.2.4 核桃再生植株的组织培养及阳性鉴定 |
| 3.2.4.1 核桃阳性体胚的脱水萌发及植株再生培养 |
| 3.2.4.2 核桃阳性再生植株的PCR凝胶电泳鉴定 |
| 3.2.5 核桃阳性再生植株相对表达量分析 |
| 3.2.5.1 核桃阳性再生植株相对表达量的分析 |
| 3.2.6 核桃阳性再生植株蛋白表达量分析 |
| 3.2.6.1 核桃组织蛋白的提取 |
| 3.2.6.2 western-blot检测样品蛋白表达量 |
| 3.2.6.3 western-blot结果分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 核桃体细胞胚遗传转化结果分析 |
| 3.3.2 核桃转化体胚阳性鉴定及阳性率统计 |
| 3.3.2.1 核桃JrGA20ox体胚鉴定及阳性率统计 |
| 3.3.2.2 核桃JrGA3ox体胚的鉴定及阳性率统计 |
| 3.3.2.3 核桃JrGA2ox体胚的鉴定及阳性率统计 |
| 3.3.3 核桃阳性体胚PCR凝胶电泳鉴定 |
| 3.3.4 核桃再生植株组织培养及阳性鉴定 |
| 3.3.4.1 核桃体胚转化为再生植株 |
| 3.3.4.2 核桃再生植株的PCR凝胶电泳鉴定 |
| 3.3.5 核桃阳性再生植株相对表达量分析 |
| 3.3.6 核桃JrGA20ox阳性再生植株蛋白表达量分析 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 4 核桃赤霉素2-ODDs家族氧化酶基因的功能分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 植株的表型观察,株高、节间长度分析 |
| 4.2.2 干旱胁迫下核桃JrGA20ox阳性植株表型分析 |
| 4.2.2.1 干旱胁迫条件下离体叶片表型分析 |
| 4.2.2.2 干旱胁迫条件下试管组培苗表型分析 |
| 4.2.3 干旱胁迫下核桃JrGA20ox阳性植株气孔分析 |
| 4.2.4 干旱胁迫下核桃JrGA20ox阳性植株组织染色分析 |
| 4.2.4.1 NBT(氯化硝基氮蓝四唑)化学染色分析 |
| 4.2.4.2 DAB(3,3-二氨基联苯胺)化学染色分析 |
| 4.2.4.3 Evans blue(伊文思蓝)化学染色分析 |
| 4.2.5 干旱物胁迫下核桃JrGA20ox阳性植株ROS含量测定 |
| 4.2.5.1 过氧化氢(H_2O_2)含量测定 |
| 4.2.5.2 超氧阴离子自由基(O_2~-)含量测定 |
| 4.2.6 干旱物胁迫下核桃JrGA20ox阳性植株生理指标测定 |
| 4.2.6.1 自然失水率测定 |
| 4.2.6.2 相对电导率测定 |
| 4.2.6.3 MDA含量测定 |
| 4.2.6.4 超氧化物歧化酶活性(SOD)测定 |
| 4.2.6.5 过氧化酶活性(POD)测定 |
| 4.2.6.6 过氧化氢酶活性(CAT)的测定 |
| 4.2.6.7 脯氨酸含量测定 |
| 4.2.6.8 叶绿素含量测定 |
| 4.2.7 干旱胁迫下核桃JrGA20ox阳性植株总m6A含量测定 |
| 4.2.8 干旱胁迫下核桃JrGA20ox阳性植株相关抗逆基因表达分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 核桃赤霉素2-ODDs家族氧化酶基因表达量对株高的影响 |
| 4.3.1.1 核桃JrGA20ox基因表达量对株高与节间长度的影响 |
| 4.3.1.2 核桃JrGA3ox基因表达量对株高与节间长度的影响 |
| 4.3.1.3 核桃JrGA2ox基因表达量对株高与节间长度的影响 |
| 4.3.2 核桃JrGA20ox表达量对植株响应干旱胁迫的影响 |
| 4.3.2.1 核桃JrGA20ox表达量对离体叶片响应干旱胁迫的影响 |
| 4.3.2.2 核桃JrGA20ox表达量对试管苗干旱胁迫的影响 |
| 4.3.3 核桃JrGA20ox表达量对离体叶片气孔形态和自然失水率的影响 |
| 4.3.4 核桃JrGA20ox表达量对ROS的含量的影响 |
| 4.3.5 核桃JrGA20ox表达量对膜脂损害程度的影响 |
| 4.3.6 核桃JrGA20ox表达量对生理指标的影响 |
| 4.3.6.1 干旱胁迫下抗氧化酶SOD、POD、CAT活性变化 |
| 4.3.6.2 干旱胁迫脯氨酸和叶绿素含量的变化 |
| 4.3.7 核桃JrGA20ox表达量对影m6A含量影响 |
| 4.3.8 核桃JrGA20ox表达量对下游抗逆基因的表达影响 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 5 核桃JrGA20ox基因在嫁接砧穗间的表达及功能分析 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 核桃组培苗微型嫁接与取样 |
| 5.2.2 核桃微型嫁接JrGA20ox基因表达量及蛋白表达量的分析 |
| 5.2.2.1 总RNA的提取 |
| 5.2.2.2 反转录成cDNA |
| 5.2.2.3 定量引物设计 |
| 5.2.2.4 嫁接植株砧木、接穗的蛋白提取, |
| 5.2.2.5 western blot实验, |
| 5.2.3 核桃微型嫁干旱胁迫处理及相关抗逆基因表达分析 |
| 5.2.3.1 总RNA的提取 |
| 5.2.3.2 反转录成cDNA |
| 5.2.3.3 定量引物设计 |
| 5.2.4 数据处理 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 核桃微型嫁接植株整体及微观表型影响 |
| 5.3.1.1 核桃嫁接整体表型分析 |
| 5.3.1.2 核桃嫁接微观表型分析及嫁接成活率统计 |
| 5.3.2 核桃微型嫁接对JrGA20ox基因表达量及蛋白表达量的影响 |
| 5.3.3 干旱胁迫对核桃JrGA20ox微型嫁接植株的表型影响 |
| 5.3.4 干旱胁迫下核桃JrGA20ox对嫁接植株相关抗逆基因表达影响 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（3）基于PCR技术的转基因耐除草剂大豆ZH10-6检测方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 转基因技术及转基因食品概况 |
| 1.1.1 转基因技术 |
| 1.1.2 转基因食品概况 |
| 1.2 转基因食品检测方法 |
| 1.2.1 基于蛋白的转基因检测方法 |
| 1.2.2 基于核酸的转基因检测方法 |
| 1.3 转基因大豆背景及研发情况 |
| 1.3.1 转基因大豆介绍 |
| 1.3.2 转基因大豆种类 |
| 1.3.3 转基因大豆获得方法 |
| 1.3.4 转基因耐除草剂大豆ZH10-6简介 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 1.5 研究内容和技术路线 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料与试剂 |
| 2.2 试验主要仪器 |
| 2.3 试验相关溶液及配置方法 |
| 2.3.1 琼脂糖电泳相关溶液配置 |
| 2.3.2 传统CTAB法DNA提取相关溶液配置 |
| 2.4 DNA提取 |
| 2.5 纯度检测 |
| 2.5.1 DNA提取 |
| 2.5.2 纯度测定 |
| 2.6 纯合性测定 |
| 2.7 外源基因筛查 |
| 2.7.1 普通PCR外源基因筛查 |
| 2.7.2 实时荧光PCR外源基因筛查 |
| 2.8 外源插入片段全序列及整合位点分析 |
| 2.9 转基因大豆外源插入片段拷贝数分析 |
| 2.10 转基因耐除草剂大豆ZH10-6特异性定性PCR检测方法的建立 |
| 2.10.1 基因组DNA提取 |
| 2.10.2 引物设计 |
| 2.10.3 引物初步筛选 |
| 2.10.4 特异性测试 |
| 2.10.5 体系和程序优化 |
| 2.10.6 灵敏度测试 |
| 2.10.7 检出限测试 |
| 2.10.8 适用性测试 |
| 2.11 转基因耐除草剂大豆ZH10-6多重PCR方法建立 |
| 2.11.1 样品基因组DNA提取 |
| 2.11.2 引物设计 |
| 2.11.3 引物特异性初筛 |
| 2.11.4 扩增体系建立及优化 |
| 2.11.5 灵敏度测试 |
| 2.11.6 检出限测试 |
| 2.11.7 适用性测试 |
| 2.12 转基因耐除草剂大豆ZH10-6实时荧光PCR相对定量检测方法的建立 |
| 2.12.1 基因组DNA提取 |
| 2.12.2 引物设计 |
| 2.12.3 引物初筛 |
| 2.12.4 体系优化 |
| 2.12.5 特异性检测 |
| 2.12.6 检出限和定量限测试 |
| 2.12.7 适用性测试 |
| 2.13 转基因耐除草剂大豆ZH10-6数字PCR精准定量检测方法的建立 |
| 2.13.1 基因组DNA提取 |
| 2.13.2 引物和探针设计 |
| 2.13.3 反应体系和条件 |
| 2.13.4 引物探针初筛 |
| 2.13.5 反应体系优化 |
| 2.13.6 特异性测试 |
| 2.13.7 定量线性范围测试 |
| 2.13.8 检出限和定量限验证 |
| 2.13.9 方法适用性测试 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 DNA提取 |
| 3.2 纯度检测 |
| 3.3 纯合性测定 |
| 3.4 外源基因筛查 |
| 3.4.1 普通PCR外源基因筛查 |
| 3.4.2 实时荧光PCR外源基因筛查 |
| 3.5 外源插入片段全序列及整合位点分析 |
| 3.6 转基因大豆外源插入片段拷贝数分析 |
| 3.7 转基因耐除草剂大豆ZH10-6特异性定性PCR检测方法的建立 |
| 3.7.1 引物初筛结果 |
| 3.7.2 特异性测试结果 |
| 3.7.3 反应体系和程序优化结果 |
| 3.7.4 灵敏度测试结果 |
| 3.7.5 检出限测试结果 |
| 3.7.6 适用性测试结果 |
| 3.8 转基因耐除草剂大豆ZH10-6多重PCR方法建立 |
| 3.8.1 引物特异性初筛 |
| 3.8.2 反应体系建立 |
| 3.8.3 反应体系优化 |
| 3.8.4 引物特异性测试 |
| 3.8.5 灵敏度测试结果 |
| 3.8.6 检出限测试结果 |
| 3.8.7 适用性测试结果 |
| 3.9 转基因耐除草剂大豆ZH10-6实时荧光PCR相对定量检测方法的建立 |
| 3.9.1 引物初步筛选 |
| 3.9.2 体系优化 |
| 3.9.3 特异性测试 |
| 3.9.4 标准曲线构建及线性度 |
| 3.9.5 检出限和定量限测试 |
| 3.9.6 适用性测试结果 |
| 3.10 转基因耐除草剂大豆ZH10-6精准定量数字PCR检测方法的建立 |
| 3.10.1 引物初筛结果 |
| 3.10.2 微滴式数字PCR体系优化结果 |
| 3.10.3 特异性测试结果 |
| 3.10.4 定量线性范围测试结果 |
| 3.10.5 检出限和定量限验证结果 |
| 3.10.6 适用性测试结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 附件 |
（4）转基因水稻检测方法与标准物质研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一篇 综述 |
| 第1章 国内外转基因作物研发与管理现状 |
| 1.1 国内外转基因作物的研发与应用 |
| 1.2 国内外转基因生物安全管理现状 |
| 第2章 转基因检测技术研究进展 |
| 2.1 基于外源插入核酸的检测方法 |
| 2.2 基于外源插入基因表达蛋白的检测方法 |
| 2.3 转基因检测新方法 |
| 2.4 转基因检测关键要素 |
| 第3章 转基因水稻检测标准物质研制 |
| 3.1 转基因检测标准物质类型 |
| 3.2 转基因检测标准物质量值表达方式 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 植物种子DNA提取与纯化的研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 水稻内标准基因研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 转基因水稻筛查检测方法与阳性标准质粒构建 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 转基因水稻检测标准物质的研制 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 导师简介 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（5）维生素E和植酸酶性状聚合转基因玉米的获得和鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 植物维生素E的研究进展 |
| 1.1.1 维生素E简介 |
| 1.1.2 维生素E的合成 |
| 1.1.3 维生素E的功能 |
| 1.1.4 植物维生素E基因工程的研究进展 |
| 1.1.5 小结和展望 |
| 1.2 植酸酶基因工程研究进展 |
| 1.2.1 动物磷营养和植酸酶简介 |
| 1.2.2 微生物发酵生产植酸酶 |
| 1.2.3 植物作为生物反应器生产植酸酶 |
| 1.2.4 小结和展望 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 1.4 实验室前期工作基础和本研究技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料和试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 仪器和设备 |
| 2.1.3 试剂盒 |
| 2.1.4 引物和测序 |
| 2.2 植物材料的种植与取材 |
| 2.2.1 玉米材料的种植 |
| 2.2.2 玉米材料的取材和保存 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 转基因玉米的获得 |
| 2.3.2 转基因植株的PCR鉴定 |
| 2.3.3 Southern blot |
| 2.3.4 侧翼序列分析 |
| 2.3.5 RT-PCR |
| 2.3.6 Western blot |
| 2.3.7 HPLC检测维生素E含量 |
| 2.3.8 植酸酶酶活、植酸磷和磷含量的测定 |
| 2.3.9 营养成分分析 |
| 2.3.10 农艺性状分析 |
| 2.3.11 离体玉米花粉活性的检测 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 转Zm TMT和 AO基因玉米植株的获得和鉴定 |
| 3.1.1 载体构建及转基因植株的获得 |
| 3.1.2 PCR鉴定 |
| 3.1.3 Southern blot验证目的基因的拷贝数 |
| 3.1.4 侧翼序列分析 |
| 3.1.5 转基因玉米的转录水平分析 |
| 3.1.6 转基因玉米的翻译水平分析 |
| 3.1.7 HPLC检测维生素E含量 |
| 3.1.8 植酸酶、植酸磷和磷的含量测定 |
| 3.1.9 营养成分测定和农艺性状分析 |
| 3.1.10 离体玉米花粉活性检测 |
| 3.2 转Zm TMT、Gm HPT和 AO基因玉米植株的获得和鉴定 |
| 3.2.1 载体构建及转基因植株的获得 |
| 3.2.2 PCR鉴定 |
| 3.2.3 Southern blot验证目的基因的拷贝数 |
| 3.2.4 侧翼序列分析 |
| 3.2.5 转基因玉米的转录水平分析 |
| 3.2.6 转基因玉米的翻译水平分析 |
| 3.2.7 HPLC检测维生素E含量 |
| 3.2.8 植酸酶、植酸磷和磷的含量测定 |
| 3.2.9 营养成分测定和农艺性状分析 |
| 3.2.10 离体玉米花粉活性测定检测转基因安全性 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）核桃WOX和SPL基因在不定根发生中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 国内外研究现状 |
| 1.2 主要研究内容 |
| 1.3 关键的科学问题与研究目标 |
| 1.3.1 研究提出的关键科学问题 |
| 1.3.2 研究目标 |
| 1.4 项目来源与经费支持 |
| 1.5 研究技术路线 |
| 2 核桃体细胞胚发生和遗传转化体系的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 影响核桃体细胞胚发生和植株再生的关键因素 |
| 2.2.2 核桃体胚遗传转化体系的建立 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 2.3.1 建立了核桃体胚发生和植株再生体系 |
| 2.3.2 建立核桃体胚遗传转化体系 |
| 3 核桃JrWOX基因家族的鉴定及在不定根发生过程中的表达分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 核桃JrWOX家族基因的鉴定及分析 |
| 3.1.2 核桃JrWOX基因的组织表达特异性分析 |
| 3.1.3 核桃不定根发生过程中JrWOX基因的表达量变化 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 核桃JrWOX家族基因的鉴定及分析 |
| 3.2.2 核桃JrWOX家族基因的组织表达分析 |
| 3.2.3 复幼前后核桃插穗不定根发生中JrWOX家族基因的表达分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 核桃中JrWOX基因的鉴定 |
| 3.3.2 核桃JrWOX基因家族的特征 |
| 3.3.3 核桃JrWOX基因的启动子区域分析 |
| 3.3.4 核桃JrWOX基因的进化和根的进化分析 |
| 3.3.5 核桃JrWOX基因的表达模式 |
| 3.3.6 不定根发生过程中核桃JrWOX基因的表达分析 |
| 3.4 小结 |
| 4 核桃JrWOX基因在杨树不定根发生中的功能分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 JrWOX4b、JrWOX5和JrWOX11基因的亚细胞定位分析 |
| 4.2.2 JrWOX4b、JrWOX5和JrWOX11基因在不定根中的表达分析 |
| 4.2.3 JrWOX4b、JrWOX5和JrWOX11基因转基因植株的检测与分析 |
| 4.2.4 JrWOX11基因对‘84K’杨的耐渗透胁迫能力的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 JrWOX4b、JrWOX5和JrWOX11在不定根发生和发育中的作用 |
| 4.3.2 JrWOX11基因调控不定根根系的建成 |
| 4.3.3 JrWOX11基因对植物耐渗透胁迫的影响 |
| 4.4 小结 |
| 4.4.1 JrWOX4b、JrWOX5和JrWOX11对不定根发生和发育的影响 |
| 4.4.2 JrWOX11对不定根根系形成的影响 |
| 4.4.3 JrWOX11对植物耐渗透胁迫的影响 |
| 5 JrWOX11 对核桃组培苗生长的功能分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 转基因植株的检测 |
| 5.2.2 核桃Crisper/Cas9编辑效果分析 |
| 5.2.3 JrWOX11 基因的功能分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 核桃Crispr/Cas9体系的建立 |
| 5.3.2 JrWOX11基因的功能分析 |
| 5.4 小结 |
| 6 核桃JrSPL家族基因的鉴定及其成员JrSPL1.1和JrSPL7.2的功能研究 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 试验方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 核桃JrSPL家族基因的鉴定及分析 |
| 6.2.2 核桃JrSPL基因的系统发育分析 |
| 6.2.3 核桃JrSPL基因的在核桃不定根发生过程中的表达分析 |
| 6.2.4 核桃JrSPL1.1和JrSPL7.2基因的亚细胞定位 |
| 6.2.5 JrSPL7.2基因的遗传转化 |
| 6.2.6 JrSPL1.1基因在核桃中的遗传转化 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 7 讨论与结论 |
| 7.1 讨论 |
| 7.2 结论 |
| 7.3 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间的学术研究 |
| 致谢 |
（7）基于赤霉素矮化基因诱导的薄壳山核桃砧木的培育（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 文献综述 |
| 1.1我国薄壳山核桃产业现状及存在问题 |
| 1.1.1 我国薄壳山核桃种质资源与产业现状 |
| 1.1.2 薄壳山核桃栽培现状与存在的问题 |
| 1.1.3 薄壳山核桃矮化栽培的途径 |
| 1.1.3.1 矮化砧木的选育 |
| 1.1.3.2 赤霉素的使用 |
| 1.1.3.3 组培快繁技术的研究 |
| 1.2 赤霉素生物合成与信号传递对植物株高的调控 |
| 1.2.1 赤霉素合成途径 |
| 1.2.2 赤霉素与植物矮化 |
| 1.2.2.1 GA合成基因与植物矮化 |
| 1.2.2.2 GA信号传导相关基因与植物矮化 |
| 1.2.2.3 GA代谢调控基因突变与植株矮化 |
| 1.2.3 GA20ox、GA3ox和GA2ox在GA代谢中的作用 |
| 1.2.3.1 GA20ox研究进展 |
| 1.2.3.2 GA3ox研究进展 |
| 1.2.3.3 GA2ox研究进展 |
| 1.3 薄壳山核桃遗传转化的研究进展 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 2 外施赤霉素对薄壳山核桃幼苗生长及相关代谢基因表达的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂与药品 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验处理 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 处理后薄壳山核桃幼苗形态指标测定 |
| 2.2.2.2 赤霉素代谢关键基因的生物信息学分析 |
| 2.2.2.3 赤霉素相关基因的时空表达分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 外源赤霉素处理对薄壳山核桃幼苗生长指标的影响 |
| 2.3.2 薄壳山核桃赤霉素代谢关键基因CiGA20ox、CiGA3ox和CiGA2ox的生物信息学分析 |
| 2.3.3 薄壳山核桃赤霉素代谢关键基因CiGA20ox、CiGA3ox和CiGA2ox的时间变化 |
| 2.3.4 薄壳山核桃赤霉素代谢关键基因CiGA20ox、CiGA3ox和CiGA2ox的空间变化 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 薄壳山核桃CiGA20ox和CiGA2ox在薄壳山核桃体胚内的遗传转化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 农杆菌制备 |
| 3.2.2 薄壳山核桃体胚侵染 |
| 3.2.3 转化体胚产物检测 |
| 3.2.3.1 转化体胚荧光检测 |
| 3.2.3.2 再生植株表型观察 |
| 3.2.3.3 再生植株阳性检测 |
| 3.2.3.4 薄壳山核桃再生植株形态指标测定 |
| 3.2.3.5 再生植株定量检测 |
| 3.2.3.6 再生植株叶绿素含量测定 |
| 3.2.3.7 体胚转化率、萌发率及再生植株生长速率的测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 薄壳山核桃GA20ox干扰及过表达载体的遗传转化 |
| 3.3.1.1 薄壳山核桃GA20ox干扰及过表达载体转化阳性体胚的鉴定 |
| 3.3.1.2 再生植株形态指标及生长速率的测定 |
| 3.3.1.3 阳性植株的鉴定 |
| 3.3.1.4 再生植株叶绿素含量的测定 |
| 3.3.1.5 薄壳山核桃GA20ox在再生植株中的转录表达 |
| 3.3.2 薄壳山核桃GA2ox过表达载体的遗传转化 |
| 3.3.2.1 薄壳山核桃GA2ox过表达载体转化体胚的鉴定 |
| 3.3.2.2 再生植株形态指标及生长速率的测定 |
| 3.3.2.3 阳性植株的鉴定 |
| 3.3.2.4 再生植株叶绿素含量的测定 |
| 3.3.2.5 薄壳山核桃GA2ox在再生植株中的转录表达 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 结论与讨论 |
| 4.1 外施赤霉素对薄壳山核桃幼苗表型相关指标的影响 |
| 4.2 外施赤霉素后薄壳山核桃CiGA20ox、CiGA3ox和CiGA2ox的时间变化 |
| 4.3 外施赤霉素后薄壳山核桃CiGA20ox、CiGA3ox和CiGA2ox的空间变化 |
| 4.4 薄壳山核桃GA20ox、GA3ox和GA2ox的生物信息学分析 |
| 4.5 薄壳山核桃GA20ox过表达及干扰载体转化再生植株 |
| 4.6 薄壳山核桃GA2ox过表达转化再生植株 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（8）梭梭适应模拟干旱的差异表达基因分析及HaASR基因的功能鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 第二章 国内外研究进展 |
| 2.1 植物响应干旱胁迫的研究 |
| 2.1.1 干旱对植物的影响 |
| 2.1.2 植物适应干旱胁迫的生理机制 |
| 2.1.3 植物响应干旱胁迫的分子机制 |
| 2.2 转录组学技术及其在植物抗逆研究中的应用 |
| 2.2.1 生物胁迫下植物转录组学研究 |
| 2.2.2 盐胁迫下植物转录组学研究 |
| 2.2.3 干旱胁迫下植物转录组学研究 |
| 2.2.4 低温及高温胁迫下植物转录组学研究 |
| 2.2.5 养分胁迫下植物转录组学研究 |
| 2.2.6 转录组学与其他功能基因组学相结合研究 |
| 2.3 植物ASR基因研究进展 |
| 2.3.1 ASR基因与蛋白 |
| 2.3.2 ASR基因家族的进化 |
| 2.3.3 ASR基因对胁迫的响应 |
| 2.3.4 ASR蛋白定位与功能 |
| 第三章 干旱胁迫下梭梭转录组测序 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料处理 |
| 3.1.2 RNA提取和转录组测序 |
| 3.1.3 测序数据的生物信息学分析 |
| 3.1.4 数字基因表达谱(DGE)测序 |
| 3.1.5 差异表达基因的qRT-PCR验证 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 转录组De novo组装及功能注释 |
| 3.2.2 转录组SSRs分析 |
| 3.2.3 DGE测序结果分析 |
| 3.2.4 与活性氧清除相关的差异表达基因分析 |
| 3.2.5 与有机渗透调节物相关的差异表达基因分析 |
| 3.2.6 与激素相关的差异表达基因分析 |
| 3.2.7 与光合相关的差异表达基因分析 |
| 3.2.8 qRT-PCR验证 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 活性氧清除相关基因的上调提高了梭梭抗氧化能力 |
| 3.3.2 有机渗透调节物相关基因的上调提高了梭梭渗透调节能力 |
| 3.3.3 激素信号相关基因的上调提高了梭梭对干旱胁迫的适应能力 |
| 3.3.4 干旱胁迫下光合作用相关基因的差异表达 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 梭梭HaASR1基因克隆及功能分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 实验所用菌株及载体 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 梭梭幼苗总RNA的提取和第一链cDNA的合成 |
| 4.2.2 HaASR1基因的克隆和生物信息学分析 |
| 4.2.3 qRT-PCR检测 |
| 4.2.4 HaASR1亚细胞定位与自激活验证 |
| 4.2.5 酵母双杂交分析 |
| 4.2.6 双分子荧光互补(BiFC)检测蛋白互作 |
| 4.2.7 HaASR1基因转化拟南芥 |
| 4.2.8 HaASR1转基因植株ABA敏感性检测 |
| 4.2.9 HaASR1转基因植株的耐盐性分析 |
| 4.2.10 HaASR1转基因植株的耐旱性分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 梭梭HaASR1基因的克隆与生物信息学分析结果 |
| 4.3.2 HaASR1的表达模式分析 |
| 4.3.3 与HaASR1互作的蛋白 |
| 4.3.4 过表达HaASR1拟南芥植株的获得 |
| 4.3.5 过表达HaASR1对拟南芥AtALDH10A9和AtPrxQ表达的影响 |
| 4.3.6 过表达HaASR1对拟南芥ABA敏感性的影响 |
| 4.3.7 过表达HaASR1对拟南芥耐盐性的影响 |
| 4.3.8 过表达HaASR1对拟南芥耐旱性的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 HaASR1可以与HaBADH和 HaPrxQ蛋白互作 |
| 4.4.2 过表达HaASR1提高了拟南芥的耐盐性 |
| 4.4.3 过表达HaASR1降低了拟南芥对ABA的敏感性 |
| 4.4.4 过表达HaASR1提高了拟南芥的耐旱性 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 梭梭HaASR2基因克隆及功能分析 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 实验所用菌株与载体 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 梭梭幼苗总RNA的提取和第一链c DNA的合成 |
| 5.2.2 HaASR2基因的克隆和生物信息学分析 |
| 5.2.3 qRT-PCR检测 |
| 5.2.4 HaASR2亚细胞定位与自激活验证 |
| 5.2.5 酵母双杂交分析 |
| 5.2.6 BiFC检测蛋白互作 |
| 5.2.7 HaASR2基因转化拟南芥 |
| 5.2.8 HaASR2转基因植株ABA敏感性检测 |
| 5.2.9 HaASR2转基因植株耐盐性分析 |
| 5.2.10 HaASR2转基因植株耐旱性分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 梭梭HaASR2基因的克隆和生物信息学分析结果 |
| 5.3.2 HaASR2的表达模式分析 |
| 5.3.3 与HaASR2互作的蛋白 |
| 5.3.4 过表达HaASR2拟南芥植株的获得 |
| 5.3.5 过表达HaASR2对拟南芥AtNHX2表达的影响 |
| 5.3.6 过表达HaASR2对拟南芥ABA敏感性的影响 |
| 5.3.7 过表达HaASR2对拟南芥耐盐性的影响 |
| 5.3.8 过表达HaASR2对拟南芥耐旱性的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 HaASR2可以与HaNHX1蛋白互作 |
| 5.4.2 过表达HaASR2提高了拟南芥的耐盐性 |
| 5.4.3 过表达HaASR2降低了拟南芥对ABA的敏感性 |
| 5.4.4 过表达HaASR2提高了拟南芥的耐旱性 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
（9）核桃JrAMT基因的克隆与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 植物对氮素吸收利用的研究进展 |
| 1.1.1 植物吸收氮素的生理和分子机制 |
| 1.1.1.1 植物吸收氮素的生理机制 |
| 1.1.1.2 植物吸收氮素的分子机制 |
| 1.1.2 氮素对植物生长发育的影响 |
| 1.1.2.1 氮素对植物光合作用的影响 |
| 1.1.2.2 氮素对植物体内抗氧化系统的影响 |
| 1.1.2.3 氮素营养对植物水分吸收利用的影响 |
| 1.1.2.4 氮素营养对植物内源激素的影响 |
| 1.2 植物中铵转运蛋白的研究进展 |
| 1.2.1 铵转运蛋白基因(AMT)的分离与鉴定 |
| 1.2.2 铵转运蛋白的转录及表达活性的调节 |
| 1.2.3 铵转运蛋白的结构功能分析 |
| 1.2.4 铵转运蛋白的亚细胞定位 |
| 1.2.5 植物铵态氮的吸收与转运机制 |
| 1.3 核桃研究进展 |
| 1.3.1 核桃的价值 |
| 1.3.1.1 核桃的营养价值 |
| 1.3.1.2 核桃的经济价值 |
| 1.3.2 核桃分子生物学研究进展 |
| 1.3.2.1 分子标记技术 |
| 1.3.2.2 核桃转基因体系的构建 |
| 1.3.2.3 基因克隆 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 2 核桃JrAMT基因的克隆与过量表达载体的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 所用载体 |
| 2.1.3 使用仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 核桃JrAMT基因的克隆 |
| 2.2.1.1 核桃体胚总RNA提取 |
| 2.2.1.2 反转录c DNA |
| 2.2.1.3 引物设计 |
| 2.2.1.4 PCR扩增 |
| 2.2.1.5 目的片段的回收 |
| 2.2.2 核桃JrAMT基因过量表达载体构建 |
| 2.2.2.1 目的片段与pc1300-GFP载体的连接 |
| 2.2.2.2 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 |
| 2.2.2.3 菌液PCR检测与测序 |
| 2.2.2.4 质粒提取 |
| 2.2.2.5 转化农杆菌 |
| 2.2.3 核桃JrAMT蛋白的烟草表皮亚细胞定位 |
| 2.2.3.1 烟草培养 |
| 2.2.3.2 农杆菌工程菌的活化 |
| 2.2.3.3 渗透液的制备 |
| 2.2.3.4 注射菌液 |
| 2.2.3.5 显微镜检测基因在细胞内的位置 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 体胚总RNA提取结果 |
| 2.3.2 核桃JrAMT基因全长扩增 |
| 2.3.3 核桃JrAMT过表达载体的鉴定与测序 |
| 2.3.4 核桃JrAMT基因的生物信息分析 |
| 2.3.4.1 核桃JrAMT基因的ORF开放序列框 |
| 2.3.4.2 核桃JrAMT基因编码蛋白同源性比较 |
| 2.3.4.3 核桃JrAMT基因编码蛋白系统进化分析 |
| 2.3.5 核桃JrAMT蛋白的烟草表皮亚细胞定位 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 3 核桃体细胞胚的遗传转化、植株再生及阳性检测 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 使用仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 核桃体细胞胚的遗传转化与植株再生 |
| 3.2.1.1 农杆菌的活化 |
| 3.2.1.2 浸染液的制备 |
| 3.2.1.3 农杆菌浸染与乙酰丁香酮(AS)共培养 |
| 3.2.1.4 筛选培养 |
| 3.2.1.5 转基因体胚植株再生 |
| 3.2.2 核桃基因体胚与再生植株的阳性检测 |
| 3.2.2.1 核桃转基因体胚与再生植株的荧光检测 |
| 3.2.2.2 再生植株的PCR检测 |
| 3.2.2.3 再生植株的RT-PCR检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 核桃体细胞胚的遗传转化与植株再生 |
| 3.3.1.1 农杆菌浸染与AS共培养对转化的影响 |
| 3.3.1.2 抗生素对转基因核桃体胚污染率的影响 |
| 3.3.1.3 继代培养对转基因核桃体胚褐化率和诱导率的影响 |
| 3.3.1.4 筛选培养对转基因核桃体胚阳性率的影响 |
| 3.3.1.5 35S-JrAMT-GFP转基因体胚的植株再生 |
| 3.3.2 35S-JrAMT-GFP转基因体胚和再生植株的阳性检测 |
| 3.3.2.1 转基因体胚和再生植株的荧光检测结果 |
| 3.3.2.2 核桃35S-JrAMT-GFP阳性植株的PCR检测结果 |
| 3.3.2.3 核桃35S-JrAMT-GFP阳性植株的JrAMT基因相对表达量检测 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 4 核桃JrAMT基因的功能鉴定 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 使用仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 核桃35S-JrAMT-GFP阳性植株株高的观察 |
| 4.2.2 核桃35S-JrAMT-GFP阳性植株生理指标检测 |
| 4.2.2.1 叶绿素含量的检测 |
| 4.2.2.2 干物质量的检测 |
| 4.2.2.3 铵态氮、硝态氮和总氮含量检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 过量表达JrAMT基因对核桃植株株高的影响 |
| 4.3.2 过量表达JrAMT基因对核桃植株生理指标的影响 |
| 4.3.2.1 过量表达JrAMT基因对再生植株叶绿素含量的影响 |
| 4.3.2.2 过量表达JrAMT基因对再生植株干物质量的影响 |
| 4.3.2.3 过量表达核桃JrAMT基因对再生植株氮含量的影响 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 5 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（10）基因开关系统在两系杂交稻上的效果验证和应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 转基因抗虫水稻 |
| 1.2.1 转基因抗虫水稻的研究进展 |
| 1.2.2 BT杀虫晶体蛋白基因及其转基因水稻研究进展 |
| 1.3 转基因抗除草剂水稻的研究进展 |
| 1.4 “基因开关”系统及涉及的相关基因组件 |
| 1.4.1 “基因开关”系统工作原理 |
| 1.4.2 “基因开关”系统涉及的基因组件 |
| 1.5 光温敏核不育系与两系法杂交水稻 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 “基因开关”系统在两系抗虫杂交水稻中的验证 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 转基因抗虫杂交组合 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 抗虫蛋白含量测定 |
| 2.2.2 转基因抗虫水稻抗虫性鉴定 |
| 2.2.3 农艺性状考察方法 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 转基因杂交组合抗虫蛋白含量的测定 |
| 2.3.2 转基因抗虫水稻的抗虫性鉴定 |
| 2.3.3 转基因抗虫水稻的农艺性状考察 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 3 利用“基因开关”系统选育胚乳零表达型两系抗虫杂交水稻 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 受体材料 |
| 3.1.2 载体及菌株 |
| 3.1.3 主要试剂及酶 |
| 3.1.4 引物 |
| 3.1.5 水稻遗传转化所用的培养基及其组成成分 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 农杆菌介导的水稻遗传转化 |
| 3.2.2 转基因植株的PCR分析 |
| 3.2.3 转基因植株的Southern杂交分析 |
| 3.2.4 抗虫蛋白含量测定 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 T_0代转基因植株的分子生物学鉴定 |
| 3.3.2 无抗性标记转基因植株的筛选 |
| 3.3.3 两系杂种F1代转基因植株苗期抗虫蛋白含量初步测定 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 4 利用“基因开关”系统创制两系抗除草剂杂交水稻 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植株材料 |
| 4.1.2 质粒及菌株 |
| 4.1.3 主要试剂及酶 |
| 4.1.4 引物 |
| 4.1.5 水稻遗传转化所用的培养基及其组成成分 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 载体构建 |
| 4.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 |
| 4.2.3 农杆菌介导的水稻遗传转化 |
| 4.2.4 转基因植株的PCR分析 |
| 4.2.5 转基因植株的Southern杂交分析 |
| 4.2.6 转基因植株的实时荧光定量PCR分析 |
| 4.2.7 转基因植株的草铵膦抗性检测 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 载体构建 |
| 4.3.2 T_0代转基因植株的分子生物学鉴定 |
| 4.3.3 无抗性标记转基因植株的筛选 |
| 4.3.4 转基因杂交组合的qRT-PCR分析 |
| 4.3.5 转基因杂交组合的草铵膦抗性鉴定 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 5 全文总结及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 超双元表达载体pSB130载体图谱 |
| 附录2 PCR引物信息 |
| 附录3 水稻遗传转化所用的培养基及其组成成分 |
| 附录4 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 |
| 附录5 水稻遗传转化 |
| 附录6 DNA及RNA提取方法 |
| 附录7 Southern杂交 |
| 致谢 |
四、烟草bar基因的转化及其转化体快速检测方法的研制（论文参考文献）
- [1]RNAi抗虫水稻Csu260-16对靶标害虫二化螟的抗性评价[D]. 温宁. 中国农业科学院, 2021
- [2]核桃赤霉素2-ODDs家族氧化酶基因的克隆与功能分析[D]. 魏广利. 浙江农林大学, 2021(02)
- [3]基于PCR技术的转基因耐除草剂大豆ZH10-6检测方法研究[D]. 刘双. 河北农业大学, 2020(05)
- [4]转基因水稻检测方法与标准物质研究[D]. 张秀杰. 吉林大学, 2020(08)
- [5]维生素E和植酸酶性状聚合转基因玉米的获得和鉴定[D]. 姚兴兰. 中国农业科学院, 2020(01)
- [6]核桃WOX和SPL基因在不定根发生中的作用研究[D]. 常英英. 中国林业科学研究院, 2020
- [7]基于赤霉素矮化基因诱导的薄壳山核桃砧木的培育[D]. 严泽埔. 浙江农林大学, 2019(01)
- [8]梭梭适应模拟干旱的差异表达基因分析及HaASR基因的功能鉴定[D]. 高慧娟. 兰州大学, 2019
- [9]核桃JrAMT基因的克隆与功能分析[D]. 刘会君. 浙江农林大学, 2019(01)
- [10]基因开关系统在两系杂交稻上的效果验证和应用研究[D]. 石兴露. 浙江大学, 2019(01)