一、泰素耐药相关基因-3细胞毒性T淋巴细胞表位负载树突状细胞疫苗的体外免疫效应研究（论文文献综述）
叶春梅[1]（2021）在《改造型TP53共享新抗原诱导抗肝癌作用的研究》文中认为目的近年来肿瘤新抗原作为免疫治疗的靶点备受关注,成为个体化免疫治疗的主力军。而共享新抗原因其在不同患者间通用,比个体化新抗原具有更广的适用性。本研究对TP53基因突变产生的共享新抗原进行氨基酸的替换修饰,探究改造后的共享新抗原是否能增强其免疫原性,从而更好地刺激和活化T细胞,进一步增强TP53共享新抗原的抗肿瘤作用,为肝癌患者以及存在相同突变的其他肿瘤患者提供更好的新抗原疫苗奠定基础。方法1.通过文献找出肝癌TP53基因热点突变,经抗原多肽预测算法获得共享新抗原,生物信息学软件预测共享新抗原的亲和力。选择亲和力较低的TP53-Y220C共享新抗原进行氨基酸残基改造。合成改造前TP53-Y220C新抗原和改造后TP53-Y220C（L2）新抗原,用T2细胞检测改造前、改造后新抗原的亲和力和稳定性。2.将合成的新抗原肽负载于树突状细胞（Dendritic cell,DC）中,并诱导细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic lymphocyte,CTL）。通过酶联免疫吸附测定法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）的分泌,通过CFSE染色于流式细胞仪上检测CTL细胞的增殖,乳酸脱氢酶（Lactic dehydrogenase,LDH）释放法检测不同新抗原刺激的CTL对负载TP53-Y220C新抗原T2细胞的杀伤。3.将改造前、改造后TP53-Y220C新抗原刺激活化的CTL作为效应细胞,选取存在或不存在TP53-Y220C新抗原突变位点的肝癌细胞作为靶细胞。在体外,通过LDH释放试验检测不同新抗原刺激的CTL对肿瘤细胞的杀伤。在体内,将肝癌细胞接种至斑马鱼卵黄囊内,然后注射不同新抗原刺激活化的CTL,24h后观察CTL对肝癌细胞的生长抑制情况。4.LDH试验检测不同新抗原刺激的CTL对含有或未含有TP53-Y220C新抗原突变位点的胃癌细胞、胰腺癌细胞、食管癌细胞的杀伤。ELISA法、酶联免疫斑点实验（Enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT）检测靶细胞和效应细胞共培养后IFN-γ、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor,TNF-α）的释放情况。结果1.生物信息学软件预测结果显示,改造后TP53-Y220C（L2）新抗原的亲和力有提升。体外亲和力检测结果显示,改造前TP53-Y220C新抗原的亲和力为3.10±0.35,改造后TP53-Y220C（L2）新抗原的亲和力为3.61±0.31。稳定性检测结果显示,改造前TP53-Y220C新抗原的稳定性<18h,改造后TP53-Y220C（L2）新抗原的稳定性>18h,两者在12h和18h的解离率有显着差异（P<0.01）。2.T细胞增殖试验和ELISA试验结果显示,与改造前TP53-Y220C新抗原相比,改造后TP53-Y220C（L2）新抗原能刺激更多的T细胞增殖,分泌更多的IFN-γ。3.从交叉实验结果可见,改造前TP53-Y220C新抗原和改造后TP53-Y220C（L2）新抗原刺激的CTL均能识别提呈有TP53-Y220C新抗原的T2细胞。且与改造前相比,改造后新抗原刺激的CTL与T2细胞共培养后分泌更多的IFN-γ和TNF-α。4.肝癌体外杀伤结果提示,与改造前相比,改造后TP53-Y220C（L2）新抗原刺激的CTL能杀伤更多的肝癌细胞Hu H7-HLA-A0201,且IFN-γ和TNF-α的分泌量更多。斑马鱼试验显示,与改造前相比,改造后TP53-Y220C（L2）新抗原刺激的CTL能在24h内使斑马鱼体内的肝癌细胞荧光面积减少更多（P<0.01）。5.LDH释放试验结果显示,TP53-Y220C新抗原和TP53-Y220C（L2）新抗原刺激的CTL均能识别和杀伤存在TP53-Y220C突变位点的胃癌细胞、胰腺癌细胞、食管癌细胞,且TP53-Y220C（L2）新抗原刺激的CTL组分泌更多的IFN-γ和TNF-α。结论1.改造的TP53-Y220C（L2）新抗原比未改造的TP53-Y220C新抗原的亲和力有所增加,稳定性显着增加,并且具有更强的免疫原性,可以更好地刺激T细胞增殖。2.肝癌细胞的体外杀伤试验和斑马鱼体内试验证明,TP53-Y220C（L2）新抗原活化的CTL比TP53-Y220C新抗原活化的CTL对肝癌细胞具有更好的细胞毒性。3.TP53-Y220C（L2）新抗原和TP53-Y220C新抗原活化的CTL对存在TP53-Y220C突变新抗原的胃癌细胞、胰腺癌细胞、食管癌细胞均有杀伤,且改造新抗原刺激的CTL可诱导更强的杀伤活性。说明TP53-Y220C新抗原符合共享新抗原特性,亲和力和稳定性增强的TP53-Y220C（L2）新抗原有望作为多种肿瘤的DC疫苗或者多肽疫苗用于抗肿瘤免疫治疗。
尹良伟[2]（2021）在《黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究》文中提出自20世纪70年代末,全球乳腺癌（Breast Cancer）发病率一直呈上升趋势,在我国乳腺癌已经成为女性发病首位的恶性肿瘤,而且呈现年轻化趋势;年轻女性乳腺癌的发病,往往侵袭性更高,病理分级及预后更差。手术、化疗、放疗和内分泌治疗是乳腺癌传统的四大治疗手段,生物治疗为进入本世纪以来乳腺癌的第五大治疗手段,免疫治疗从属于生物治疗的范畴。然而,乳腺癌免疫治疗的发展一直较为缓慢。因此,如何合理选择人群和合理的治疗模式,让更多的乳腺癌患者从免疫治疗中获益,是未来该领域的重点发展方向。树突状细胞（Dendritic Cells,DC）作为抗原提呈功能细胞的主要效应细胞之一,将固有免疫和适应性免疫紧密连接在一起,尤其是在特异性免疫反应中发挥独特的免疫学效应。根据不同阶段DC生物学特性的不同,有些学者设想利用改善DC功能的手段来增强其抗肿瘤效应。黏蛋白1（Mucins1,MUC1）是I型跨膜糖蛋白,正常情况下可表达于多种组织、器官的上皮细胞近管腔或腺腔面,亦可见于腺癌上皮细胞的表面,而且呈高表达态势。相关研究显示,MUC1表达程度越高,往往预示着肿瘤侵袭性越强,预后越差,而且更容易出现局部浸润、淋巴结转移和血行转移。结合近年来MUC1在肿瘤生物治疗中的新发现以及基因修饰技术的成熟和推广,我们以MUC1作为出发点,以基因修饰DC作为主要技术路线,分以下3部分系统探讨MUC1基因转染后的DC对乳腺癌的免疫作用,旨在探索乳腺癌新的肿瘤免疫治疗途径与方法。一、黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备目的:验证MUC1在人乳腺癌中高表达,并构建和包装MUC1重组慢病毒,感染DC,制备过表达MUC1的DC疫苗。材料和方法:（1）应用免疫组织化学技术检测90例乳腺癌组织和30例癌旁正常组织以及三种细胞（神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y与两种乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231）中MUC1蛋白的表达,q PCR检测26例新鲜乳腺癌组织和癌旁正常组织以及三种细胞MUC1 m RNA水平,验证MUC1在乳腺癌组织及细胞系中的表达;（2）应用GV657载体,经目的基因扩增、PCR产物与载体交换、测序、质粒提取及纯化、病毒包装,获取重组MUC1慢病毒;（3）通过密度梯度离心法,体外分离获得人外周血单个核细胞;采用无血清培养基,经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rh GM-CSF）、重组人白介素-4（rh IL-4）和肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor,TNF）-α诱导产生成熟DC;流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平;（4）MUC1慢病毒感染DC,分为MUC1基因感染DC组（MUC1-DC组）、空载体感染DC组（GFP-DC组）以及对照组（DC组）;（5）RT-PCR检测感染后DC的MUC1 m RNA水平;（6）Western blotting检测感染后DC的MUC1蛋白表达。结果:（1）90例乳腺癌组织中,MUC1表达明显高于癌旁正常组织,92.2%（83/90）乳腺癌组织中显示MUC1高表达,30例癌旁组织中5例为高表达（16.7%）,其余25例者（83.3%）为阴性或细胞质内弱表达。在26例乳腺癌组织中有92.3%（24/26）的MUC1 m RNA水平明显高于配对的癌旁对照组织（P<0.01）,仅2例乳腺癌中MUC1 m RNA表达水平与癌旁组织相当;与神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y比较,两种乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的MUC1 m RNA水平和蛋白表达均显着增高（均为P<0.01）;（2）MUC1重组质粒测序结果与目的基因一致,经包装获得病毒滴度为1×109TU/m L的重组MUC1慢病毒;（3）相差显微镜观察体外培养的外周血来源DC形态变化过程,培养至5～7d大部分细胞脱壁悬浮,体积明显增大且大小不等,形态不规则,表面可见很多粗细不一、参差不齐、形态各异的毛刺状突起,呈现典型的树突状细胞形态;培养7d的DC流式检测结果显示,CD1a、CD80、CD83及CD86分子表达率分别为（21.6±2.4）%、（22.7±1.6）%、（24.9±2.1）%及（95.4±4.3）%,表明获得成熟DC;（4）采用MUC1重组慢病毒感染DC后,于24 h时可见特异性GFP表达,24h、48 h、72 h的转染效率分别为（11.7±1.0）%、（12.9±0.9）%和（36.8±1.6）%;（5）与空载体组和对照组相比,MUC1-DC组RT-PCR检测到346 bp扩增带;（6）同时Western blotting检测MUC1-DC组可见明显的MUC1蛋白条带。结论:（1）验证了MUC1在人乳腺癌组织以及两种人乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231中呈高表达;（2）成功构建MUC1重组质粒,并包装获得携带MUC1基因重组慢病毒;（3）以MUC1重组慢病毒感染DC,成功获得过表达MUC1的DC,即MUC1-DC疫苗。二、MUC1-DC免疫功能的体外研究目的:探究前一部分实验获得的MUC1-DC疫苗在体外诱导CTL的免疫作用及对人乳腺癌细胞MCF7的杀伤活性。材料和方法:（1）诱导培养特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,免疫荧光技术检测不同转染时间后MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-α情况;（2）ELISA法检测比较MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL和DC-CTL IL-12、TNF-α含量;（3）以人乳腺癌细胞MCF7为靶细胞,以MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL、DC-CTL为效应细胞,采用LDH释放法检测CTL的杀伤活性,CTL特异性杀伤率（%）=（试验孔值-效应细胞对照值）/（最大杀伤对照值-最小杀伤对照值）×100%。结果:（1）经免疫荧光检测,转染的MCU1-DC培养2d后诱导CTL开始表达IL-12和TNF-α,但荧光强度较弱;与MCU1-DC培养3d相比,培养4d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的量均明显升高,荧光强度增强,差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.05）;MCU1-DC培养5d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α荧光强度最强;MCU1-DC培养6d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的荧光强度逐渐下降;（2）ELISA结果显示:GFP-DC诱导CTL分泌细胞因子IL-12、TNF-α能力较低,分别为（101.83±5.79）ng/m L、（119.26±11.52）ng/m L,与DC组比较差异无统计学意义（P>0.05）;而MUC1-DC诱导CTL分泌这两种因子的能力明显增强,分别为（202.52±17.10）ng/m L和（349.07±79.42）ng/m L,与DC组和GFP-DC组比较,差异均有明显统计学意义（均为P<0.01）;（3）LDH释放法检测结果显示,三组杀伤活性均随效靶比的升高而增强;相同效靶比时,与DC-CTL组或GFP-DC-CTL组比较,MUC1-DC-CTL组对靶细胞MCF7具有更明显的杀伤活性,差异具有明显统计学意义（均为P<0.01）。结论:（1）MUC1基因转染的DC诱导CTL即MUC1-DC-CTL在5 d时分泌IL-12和TNF-α的能力最强,用于本研究后续实验;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC诱导CTL具有更强的产生IL-12、TNF-ɑ细胞因子的免疫活性;（3）MUC1-DC-CTL对人乳腺癌MCF-7细胞比单纯DC-CTL具有更明显的杀伤活性,而且随着效靶比的升高,CTL的杀伤活性逐渐增强。三、光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用目的:通过活体监测MCF7荷瘤裸鼠的成瘤生长情况,评价MUC1基因转染的DC疫苗对乳腺癌免疫作用的效果及其可能的机制。材料和方法:（1）GFP慢病毒转染MCF7细胞（GFP-MCF7）;（2）BALB/c裸鼠皮下种植GFP-MCF7 1×107个/只,成瘤后随机分为3组,各组裸鼠首先尾静脉注射体外活化的CIK细胞1×108个/只,治疗组于皮下注射MUC1-DC（MUC1-DC组）或DC细胞（DC组）1×107个/只,体积0.2 ml/只,对照组（Ct组）注射等体积生理盐水,每天治疗1次,连续5d;（3）采用小动物活体光学成像系统在开始治疗前及开始治疗后第35d进行成像观察移植瘤荧光成像,分析荧光强度和荧光面积;（4）免疫组化法检测三组裸鼠移植瘤组织中Caspase3的表达情况;（5）TUNELl法检测三组裸鼠移植瘤组织中的细胞凋亡率。结果:（1）裸鼠于GFP-MCF7荷瘤后7d,成瘤率100%。开始治疗前和开始治疗后35d活体光学分子成像结果显示,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号强度无明显差异（F=0.4341,P>0.05）;开始治疗后第35d,MUC1-DC组的荧光信号强度明显低于Ct组（F=7.864,P<0.05）;DC与Ct、MUC1-DC与DC组间均无显着性差异（均为P>0.05）,但MUC1-DC比DC组荧光信号更低。从荧光信号面积上进行统计分析,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号分布面积无显着差异（F=1.084,P>0.05）;开始治疗后第35d,Ct组荧光信号呈多处散在分布,MUC1-DC组和DC组的荧光信号面积均明显低于Ct组（均为P<0.01）,但MUC1-DC组与DC组的荧光信号面积无显着性差异（P>0.05）;（2）Ct组Caspase3表达最少,DC组次之,MUC1-DC组呈高表达Caspase3,三组间比较,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;（3）TUNEL结果显示,三组细胞凋亡率分别为:Ct组（4.11±2.61%）、DC组（9.63±2.27）%、MUC1-DC组（25.30±8.24）%,三组间比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）GFP荧光标记的人乳腺癌细胞在裸鼠内可以持续表达荧光信号,可以通过光学分子成像系统检测光密度值观察肿瘤的部位及生长情况,是一种活体内实时动态观察肿瘤的生长和转移、评价抑瘤作用的有效方法;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC免疫治疗人乳腺癌荷瘤小鼠能够更有效地抑制肿瘤生长和扩散;（3）MUC1-DC发挥了更好的促进肿瘤细胞凋亡的作用。
徐泽[3]（2020）在《半细菌化类鼻疽杆菌载体制备LL/2肺癌疫苗及其抗肿瘤效应研究》文中研究说明目的:肺癌是全世界恶性肿瘤死亡相关的首要原因。免疫系统可识别肿瘤细胞,肿瘤疫苗可以增强机体的抗肿瘤免疫力,特别是激活抗肿瘤免疫特异性CD8+T淋巴细胞来消除肿瘤细胞。虽然在过去十年中肿瘤疫苗研发方面取得了很大进展,但临床实践效果仍不理想,有必要寻找更好的制备方法。细菌天生就有病原模式分子（PAMP）,而免疫细胞则有PAMP的模式识别受体（PRR）,因此免疫系统能对细菌产生有效的免疫反应。本研究利用细菌这种特性,将类鼻疽伯克霍尔德杆菌细胞壁孔隙化,并使部分内容溢出变成一种具有缝隙中空的药物载体（称为半细菌）,用小鼠Lewis肺癌细胞（LL/2）裂解物作为抗原,在小鼠肿瘤模型中探讨这种“半细菌”作为抗肿瘤疫苗载体的可行性,寻找一种制备肿瘤疫苗的新办法。方法:在本论文研究中通过放射减毒、适当加热和酶解的方法将类鼻疽伯克霍尔德杆菌（简称类鼻疽杆菌）细胞壁孔隙化,制备成一个可以通透细胞裂解物的载体（称之为“半细菌”,SB）,测定其特点、活性及表征;然后装载LL/2肿瘤裂解物（LTL）和疫苗佐剂CpG,通过共聚焦显微镜观察,证明了能有效将LL/2肿瘤裂解物和CpG装载进入半细菌,表明LL/2肿瘤裂解物半细菌疫苗（命名为SB-LC）制备成功;体外实验评估SB-LC对树突状细胞成熟、活化能力,分组与树突状细胞（DC）培养,流式细胞术测定树突状细胞（DC）成熟相关（CD40、CD80和CD86）表达情况及细胞因子（INF-γ、TNF-α）分泌情况是否提示有效刺激树突状细胞的成熟。使用同源C57BL/6小鼠构建LL/2肿瘤模型,右胁肋部注射肿瘤细胞（1×106）此作为预防组、治疗组方案模型,每3天观察小鼠LL/2肿瘤生长情况,观察SB-LC疫苗能否抑制肿瘤生长;制备脾脏效应细胞进行细胞毒T淋巴反应（CTL）证明特异性抗肿瘤免疫效应,流式细胞仪测定表达INF-γ的CD8+细胞量百分比;同样我们为了验证体液免疫产生效应,使用Western Blot检测小鼠血清相关抗体,酶联免疫吸附实验（ELISA）方法测定树突状细胞培养上清液细胞因子及血清特异性抗体含量;使用酶联免疫斑点试验（ELISPOT）方法测定脾脏分泌特异性抗体淋巴细胞含量。此外,分选小鼠肿瘤中的肿瘤浸润淋巴细胞,通过流式细胞分析不同组别表达INF-γ的CD8+T细胞数量比例,对CD4+进行设门测定表达CD25+、FOXP3+双阳调节性T细胞（Tregs）数量。了解LL/2肿瘤裂解物半细菌疫苗（SB-LC）是否能够改变肿瘤免疫抑制的微环境。结果:本课题成功制备了LL/2肿瘤裂解物半细菌疫苗（SB-LC）,体外实验表明能够诱导DC细胞成熟、活化,诱导成熟标志CD40、CD80、CD86的表达,并释放细胞因子。预防组、治疗组小鼠模型证明了可以有效地抑制肿瘤生长,SB-LC组CTL反应效应最为显着,经治疗后的荷瘤小鼠血清中可测得特异性IgG抗体产生。分离荷瘤小鼠模型的肿瘤浸润淋巴细胞,SB-LC疫苗处理的调节T细胞（Treg）减少,逆转免疫抑制肿瘤免疫微环境。结论:LL/2肿瘤裂解物半细菌疫苗（SB-LC）在体外可有效诱导树突状细胞成熟,在预防性和治疗性实验组可有效抑制肿瘤生长,可有效杀伤肿瘤细胞。
杨浩[4]（2020）在《CTP介导BCR-ABL来源抗原肽段增强DC抗原交叉提呈诱导抗CML效应》文中研究表明慢性髓系白血病（Chronic myeloid leukemia,CML）是一组起源于骨髓造血干细胞的恶性增殖性血液系统肿瘤,其主要致病机制是9号染色体上的abl基因和22号染色体上的bcr基因断裂易位形成bcr-abl融合基因,该基因可以持续编码具有强烈酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白,从而形成严重威胁人类健康的重大疾病。酪氨酸激酶抑制剂如伊马替尼、达沙替尼等可特异性的抑制BCR-ABL酪氨酸激酶活性,使慢性髓系白血病的治疗取得了长足进展。然而,仍然有部分CML恶性克隆残留在病人体内,从而导致部分患者出现复发或耐药。还有一部分患者对于酪氨酸激酶抑制剂存在不耐受的情况。因此,急需探索一种全新的治疗方法。目前,免疫疗法在肿瘤治疗中受到广泛关注。bcr-abl编码的BCR-ABL融合蛋白是慢性髓系白血病的遗传学标志,其抗原特异性限定在融合位点内。来源于BCR-ABL融合位点的抗原肽段GFKQSSKAL（GF）,SSKALQRPV（SS）可以被MHC I类分子特异性递呈于CML细胞表面,因此该序列可以作为CML特异性抗原,是非常理想的免疫治疗理想靶标。已有研究证实,通过这些抗原负载DC,将外源性抗原递呈给CD8+T淋巴细胞可以诱导CML特异性CTL应答。但由于外源性抗原经DC递呈效率不高,导致治疗效果不显着。因此,如何增强DC提呈外源性抗原的效率,提高CML治疗效果迫在眉睫。胞质转导肽（Cytoplasmic transduction peptide,CTP）是一种具有高效细胞胞质定位能力的肽段,包含11个氨基酸残基。这为外源性抗原的高效转导入胞核提供了可能性。在本研究中,我们运用胞质转导肽的高效转导能力,介导外源性BCR-ABL来源抗原肽段定位于DC胞质中,使外源性抗原内源化,经由MHC I类分子递呈至CD8+T淋巴细胞,形成CML特异性细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte,CTL）,从而杀伤CML细胞。本实验旨在为CML免疫治疗提供理论基础和实验依据。采取的主要研究方法是:1.多肽的设计与合成及其定位效应观察。通过文献查阅,选择合适的BCR-ABL蛋白融合位点来源的抗原多肽,与改造后的CTP共同合成。体外培养小鼠骨髓来源树突状细胞,将合成肽段与鼠源DC共同培养,通过直接荧光观测筛选出最佳肽段转导时间。之后,通过免疫荧光和激光共聚焦实验来观测合成肽段在DC中的定位情况,以探究合成的CTP肽段是否具有高效的胞质定位功能。2.CTP融合抗原对DC细胞毒性以及激发抗原交叉提呈效应的观察。用两段CTP融合肽段与DC分别以不同浓度共孵育不同时间,通过CCK-8来检测细胞的活力。用CTP-GF,CTP-SS,GF,SS分别以最佳浓度与DC共孵育,之后与新鲜提取CD8+T淋巴细胞共培养,通过酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）对IL-2分泌量进行测定。3.CTP融合肽段介导免疫应答效能及其对BP210杀伤效应检测。设置CTP-GF,CTP-SS,GF,SS,CTP,DC,BLANK各实验组,分别将各组肽段与DC共培养后免疫小鼠,提取小鼠脾脏淋巴细胞。通过流式细胞术检测免疫后小鼠淋巴细胞增殖,活化以及脱颗粒能力;酶联免疫斑点实验（Enzyme linked immunospot assay,ELISPOT）分析其分泌细胞因子能力;乳酸脱氢酶释放实验（Lactate dehydrogenase release assay,LDH release assay）检测效应T淋巴细胞对靶细胞的杀伤能力。4.CTP融合肽段对BP210细胞致小鼠白血病的免疫治疗效应和免疫记忆效应。先将BP210细胞通过尾静脉注射入七组小鼠体内。一周后将CTP-GF,CTP-SS,GF,SS,CTP,DC,Blank各组树突状细胞通过腹股沟注射免疫小鼠,每周一次,共免疫两次。记录各组小鼠生存状态,体重称量以及外周血白细胞计数;当小鼠出现跛行,后肢瘫痪,精神萎靡,体重快速下降时断颈处死,将肝脾进行称重拍照;取小鼠骨髓涂片,肝脾印片,瑞氏染色检查原始细胞浸润情况,免疫荧光法检查BCR-ABL的表达;将肝脾用4%多聚甲醛组织固定过夜,石蜡包埋,切片,HE染色观察肝脾中白血病细胞浸润情况;同时记录小鼠生存周期,比较存活时间。待免疫治疗观察期结束后,进行CTP融合肽段对BP210细胞二次攻击免疫记忆效应验证。重新设置Blank组,将BP210细胞通过尾静脉注射入4中实验组存活小鼠以及新设置Blank组小鼠体内。观察各组小鼠生存情况,实验检测方法同上文。取得的实验结果与结论如下:1.设计合成各组肽段,CTP融合肽段具有良好胞质定位能力。根据文献报道和实验需求,我们设计出相应肽段,并耦联FITC,添加HA标签。流式结果显示树突状细胞培养成功。直接荧光观测显示CTP融合肽段在浓度10μmol/L,孵育30 min可达到最佳转导效率。免疫荧光结果显示CTP融合肽段具有良好的胞质定位效能。激光共聚焦显微镜观测结果进一步证明CTP的胞质定位能力。2.CTP融合肽段具有良好生物安全性,成功刺激出交叉抗原提呈反应。CCK-8实验结果显示树突状细胞的生存不受CTP影响。ELISA实验结果显示,CTP融合肽段负载树突状细胞与淋巴细胞共培养,IL-2分泌水平更高,说明在此组交叉抗原提呈反应被成功刺激出,抗原提呈效率更高。3.CTP融合肽段免疫组T淋巴细胞增殖能力、活化能力、脱颗粒能力、细胞因子分泌能力以及靶细胞杀伤效应明显高于其他组。经由CTP融合肽段抗原负载树突状细胞能诱导出更有效的细胞免疫应答,从而杀伤BP210靶细胞。4.CTP融合肽段免疫的小鼠具有更长的生存时间,身体各项指标维持良好,HE染色检查肝脾骨髓检查白血病细胞的浸润情况明显好于其他各对照组。CTP融合肽段免疫小鼠,可以更好地刺激出CML特异性细胞免疫应答,对具有CML类似症状的小鼠具有相对良好的治疗效应。同时,肿瘤的二次攻击对CTP融合肽段组小鼠并没有影响,说明记忆性T淋巴细胞在小鼠体内存在,免疫记忆能力更强。综上所述,我们成功利用CTP介导BCR-ABL蛋白来源抗原多肽定位于树突状细胞胞质中,刺激树突状细胞交叉抗原提呈反应,将外源性抗原递呈至CD8+T淋巴细胞,诱导CML特异性细胞免疫反应产生,从而杀伤BP210靶细胞。本课题首次从交叉抗原提呈的角度出发,将CTP引入慢性髓细胞白血病的免疫治疗,并初步取得了较好地实验结果,这可能为慢性髓细胞白血病患者提供一种全新的治疗策略。
杨鹏翔[5]（2019）在《自组装短肽水凝胶抗肿瘤疫苗的制备及其免疫治疗研究》文中认为肿瘤免疫治疗是最具前景的治疗方式,而疫苗是为了根除肿瘤细胞而采取的一种疗法。疫苗属于主动免疫治疗,通过激发或调动机体的免疫系统,增强其在微环境中的抗肿瘤免疫力,从而控制和杀伤肿瘤。肿瘤治疗需要激活较强的细胞毒T淋巴细胞反应以对抗癌变细胞的快速增长,而目前的疫苗存在着诱导细胞免疫应答弱、持续时间短等问题。基于纳米生物材料开发的疫苗递送系统在增强免疫原性和提高抗肿瘤应答方面具有重要作用,自组装短肽水凝胶在肿瘤疫苗的研究中正在成为新的热点。目的:树突状细胞（Dendritic cells,DCs）疫苗存在着体内存活时间短、归巢效率低、免疫激活能力弱等缺陷。本研究采用自组装短肽水凝胶支架负载DCs疫苗,通过局部注射的方式,以期提高细胞的体内活性、归巢能力及抗肿瘤的效率,明确免疫途径与作用机制,提高其肿瘤免疫治疗的效果;而表位疫苗由于分子量小,化学结构简单,导致其免疫原性较弱。本研究通过将表位以共价键的方式连接到自组装的短肽上,形成纳米结构的水凝胶疫苗,从而改变表位肽在疫苗中的存在形式,以期提高免疫原性,改善表位疫苗的细胞免疫应答效应,获得良好的抗肿瘤免疫治疗效果。方法:针对新型DCs疫苗的研究,合成并表征自组装短肽水凝胶材料RADA16。将细胞置于支架材料中,采用死活染色和流式细胞仪检测等方法分析水凝胶对DCs活力及功能的影响;采用绿色荧光蛋白阳性的DCs进行体内分布实验,将培养的DCs、抗原与水凝胶共孵育后皮下注射至小鼠的右侧后背部,在不同时间点收集注射的水凝胶和腹股沟引流淋巴结,流式细胞仪及组织切片检测注射的细胞在体内的分布情况以及DCs向淋巴结的归巢效率。采用水凝胶负载DCs疫苗联合抗PD-1抗体进行小鼠体内免疫效果和预防及治疗性抗肿瘤研究。针对表位疫苗的研究,将成胶因子KKFKFEFEF（KKEF）与CD8+T细胞表位TRP2180-188（SVYDFFVWL）通过二硫键连接,制备键合表位的短肽疫苗。与DCs混合培养后,通过共聚焦显微镜检测细胞对表位疫苗的摄取情况;采用死活染色和流式细胞仪检测等方法分析多肽疫苗对DCs活力及成熟的影响;将致敏DCs与免疫小鼠分离的脾细胞混合培养,采用CCK-8和ELISA等方法检测细胞增殖和细胞因子分泌水平。通过表位疫苗联合抗PD-1抗体进行小鼠体内抗肿瘤作用及机制研究。结果:合成了短肽水凝胶材料RADA16,通过质谱和液相色谱验证了材料的纯度,水溶液溶解自组装后形成了具有β折叠的纳米纤维结构。DCs的加入并不影响水凝胶的成胶能力,水凝胶也没有改变细胞对抗原的摄取和成熟。将短肽水凝胶材料RADA16负载的DCs疫苗和抗原,注射到小鼠体内皮下形成DCs疫苗结节,水凝胶作为DCs疫苗和抗原的递送载体能够提高外源性DCs存活率,促进DCs向引流淋巴结的迁移;同时,抗原从水凝胶中缓释,能够原位募集机体自身DCs,产生内源性DCs疫苗。荷瘤小鼠体内免疫结果表明,该新型DCs疫苗促进了效应CD8+T细胞浸润到肿瘤组织内,并表现出良好的肿瘤预防和免疫治疗效果。与抗PD-1抗体联合使用,可以进一步提高肿瘤免疫治疗效果。将KKEF-TRP2溶解在水中,加入少量的饱和盐溶液后,形成了具有纳米纤维状结构的水凝胶。与免疫细胞混合培养后,DCs能够摄取水凝胶表位多肽,且提高了细胞表面成熟标志物CD86和MHCI的表达,促进了脾细胞特异性的增殖。荷瘤小鼠体内免疫结果表明,该表位疫苗促进效应CD8+T细胞浸润到肿瘤组织内,并表现出良好的肿瘤治疗效果。与抗PD-1抗体联合使用,同样可以提高肿瘤免疫治疗效果。结论:短肽水凝胶材料RADA16负载DCs和抗原所形成的疫苗结节,提高了外源性DCs活性并募集了内源性DCs,通过促进效应CD8+T细胞浸润到肿瘤组织内表现出良好的肿瘤预防和免疫治疗效果。键合表位的多肽疫苗KKEF-TRP2能够形成宏观可见的水凝胶,通过表位自组装使其分子量增大,形成的纳米结构提高了疫苗的免疫原性与体内稳定性,通过促进DCs的摄取和提呈激活了特异性的淋巴细胞增殖,提高了抗肿瘤作用。
宋会娟[6]（2018）在《可注射水凝胶肿瘤疫苗的制备与肿瘤免疫治疗效果的研究》文中提出免疫治疗作为一种特异性治疗手段在肿瘤治疗领域显示出良好的前景。目前为止,尽管免疫细胞治疗在特定血液肿瘤方面获得了良好的治疗效果,但是对于实体瘤,现行的免疫细胞治疗只是显示出一定的清除肿瘤细胞的潜力,并没有完全地治愈癌症。近年来,缓释免疫细胞刺激因子的生物材料支架在原位募集、调控抗原递呈细胞和淋巴细胞方面显示出了良好的作用。本研究的核心目标是采用生物相容性良好的水凝胶为抗原、免疫调节剂的递送载体或免疫细胞的培养基质,联合肿瘤免疫检查点抑制剂抗体治疗调控肿瘤微环境,通过该联合免疫治疗策略以获得具有临床转化价值的肿瘤疫苗制剂。近年来,抗原表位作为一种新型肿瘤疫苗,在肿瘤个性化免疫治疗领域受到极大关注。然而,表位肽分子量小,化学结构简单,导致其免疫原性弱,在体内容易被降解,无法诱发足够强度的免疫反应,抑瘤效果不明显。通过化学修饰和自组装技术设计、构建新型表位疫苗,提高表位免疫原性和特异性细胞免疫反应,进而促进个性化肿瘤疫苗和肿瘤免疫治疗的发展。目的:在生物材料载体方面,通过调控聚合物材料的化学组成,获得性质可灵活调节的水凝胶载体,应用于肿瘤免疫治疗。在肿瘤免疫治疗方面,通过治疗性肿瘤疫苗与免疫检查点抑制剂联合的方式,期望促进机体自身免疫应答,降低肿瘤细胞免疫抑制,以及采用双抗原表位水凝胶疫苗,进一步提高癌症免疫治疗效果,获得具有临床转化潜力的疫苗制剂。方法:首先,通过L-缬氨酸N-羧酸酐（L-valNCA）的开环聚合反应（ROP）制备出了 mPEG-b-聚（L-缬氨酸）（PEV）两嵌段聚合物。改变L-Val-NCA的聚合度来研究多肽链的长度与二级结构、自组装行为以及水凝胶特性之间的关系。然后用小鼠成纤维细胞NIH/3T3细胞考察合成的四种水凝胶聚合物的细胞毒性和对细胞进行三维培养的能力。其次,从合成的四种不同分子量的多肽水凝胶中筛选出一种最适宜的水凝胶用于抗原（肿瘤细胞裂解物TCL）和TLR3激动剂（poly（I:C））的递送载体。通过在原位长效缓释肿瘤特异性抗原和免疫调节剂,考察其在体内募集、调控DCs的能力。通过小鼠的黑色素瘤治疗模型来研究这种新型水凝胶疫苗的抗肿瘤效应,并探讨其作用机制。再次,从合成的多种多肽水凝胶中筛选出可注射的自组装的聚乙二醇-聚（L-丙氨酸）多肽水凝胶用于负载抗原（肿瘤细胞裂解物TCL）,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和免疫检查点抑制剂（ICIs）。在体内和体外分别考察其对DCs的募集、调控能力。通过小鼠的黑色素瘤治疗模型来研究这种新型水凝胶疫苗联合治疗模式的抗肿瘤效果,并探讨其作用机制。最后,通过固相合成技术将表位以共价键的方式连接到能够自组装的小分子多肽上,制备含有抗原表位的多肽序列。在水溶液中键合表位的多肽共聚物组装成为具有纳米结构的溶液或水凝胶疫苗。再将键合不同抗原表位的多肽进行共组装制备多价表位疫苗。在细胞或动物水平考查新型表位疫苗激起细胞免疫应答的能力,评价其安全性与肿瘤免疫治疗效果,验证表位疫苗的优越性。结果:首先,制备了一系列聚乙二醇多肽共聚物,在水溶液中可以自组装形成纳米结构,获得纳米水溶液或水凝胶。SEM结果显示其水凝胶具有多孔互穿的网络结构。通过细胞增殖-细胞毒性检测试剂盒验证PEV共聚物具有良好的细胞相容性。三维细胞培养结果显示细胞能在水凝胶中存活并稳定增殖。其次,构建了一种同时负载抗原和免疫调节剂的可注射多肽水凝胶疫苗制剂。多肽水凝胶能够持续释放TCL或poly（I:C）超过一周,充当有效的疫苗递送载体系统。这种疫苗制剂可以在体外和体内募集,激活和成熟DCs。多肽水凝胶递送载体的使用延长了注射部位抗原的持续时间,并且促进了抗原向淋巴结回流的百分比。在B16荷瘤小鼠体内的免疫结果表明,含有TCL和poly（I:C）的多肽水凝胶疫苗制剂能够有效诱导活化的DCs迁移到回流淋巴结,并引发强烈的CTL应答而抑制肿瘤生长。再次,构建了一种同时负载抗原和免疫检查点抑制剂的可注射多肽水凝胶疫苗制剂。水凝胶可以持续释放肿瘤细胞裂解物TCL,GM-CSF以及ICIs长达10天。水凝胶疫苗可以有效地激活DCs并刺激全身的CTL反应,联合免疫检查点抑制剂获得了更强的抗黑色素瘤治疗效果。水凝胶共递送抗原和免疫检查点抑制剂能够增强免疫小鼠脾脏和肿瘤内的效应CD8+T细胞的扩增,同时降低脾脏内Treg细胞的比例。最后,以组份更加明确,特异性更强,安全性和效率更高的表位多肽为抗原,通过化学修饰和自组装方法制备具有纳米结构的溶液或水凝胶表位疫苗,其在小鼠体内产生的IgG抗体水平及血清中分泌的IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-2细胞因子明显提高。脾脏中CD4+T和CD8+T细胞群显着增殖。该疫苗提高了表位的免疫原性,增强特异性免疫应答。结论:我们制备的该水凝胶疫苗能够在体内有效募集大量树突状细胞,并促进其成熟,从而激活肿瘤特异性细胞毒性T细胞免疫反应,杀伤肿瘤细胞。与免疫检查点抑制剂的联合治疗抑制了免疫微环境,显着性降低了 Tregs的产生,从而进一步提高了抗肿瘤效果。双表位水凝胶疫苗的设计与构建大大提高了表位多肽的免疫原性,与裸表位和蛋白抗原相比,可以激起更加强烈的细胞和体液免疫应答。本论文研究工作表明,可注射多肽水凝胶是一种有效的疫苗和免疫检查点抑制剂的递送载体,在肿瘤疫苗的构建方面可以提供新型载体,为肿瘤的免疫治疗提供了潜在的治疗新手段。同时,基于多肽的自组装技术可以作为一种改善表位多肽免疫原性、构建新型个性化疫苗的有效手段。
王海龙[7]（2014）在《PSMA在肺癌表达及免疫治疗临床应用价值的初步研究》文中认为研究目的研究前列腺特异性膜抗原（prostate specific membrane antigen,PSMA）在肺癌组织的肿瘤细胞和血管内皮细胞上的表达情况。分析PSMA在肺癌中表达情况与患者的年龄、性别、病理类型、肿瘤大小、临床分期等因素的关系。构建AAV/PSMA质粒,制备AAV/PSMA病毒,用AAV/PSMA病毒转染树突状细胞,诱导生成细胞毒性T淋巴细胞。研究方法1.从天津医科大学附属肿瘤医院标本库选取非小细胞肺癌标本87例（包括鳞癌30例、腺癌29例、大细胞癌28例）,小细胞肺癌30例,正常肺组织标本33例。这些标本同时用PSMA抗体和CD31抗体进行了免疫组化。免疫组化的阳性对照选择前列腺癌组织,阴性对照选用PBS。2.复苏培养扩增高表达目的基因PSMA的LNcap细胞。用Trizol法从高表达目的基因的LNcap细胞中提取总RNA。用mRNA抽提试剂盒从总RNA中抽提mRNA。 RT-PCR方法将mRNA逆转录为cDNA并将逆转录的cDNA进行扩增。利用QIAGEN公司的凝胶抽提试剂盒抽提凝胶中的目的基因。用T4连接酶将目的基因与腺相关病毒载体进行连接。将连接产物与感受态细胞混合进行转化和涂菌。挑选生长良好的单克隆菌落用LB培养基进行扩增培养。单克隆菌落扩增之后进行质粒抽提。抽提的AAV/PSMA质粒分别用PCR和基因测序两种方法进行验证并与GenBank公开的PSMA序列对比吻合。无腺病毒参与的包装系统制备AAV/PSMA病毒。3. AAV/PSMA转染DC并诱导生成CTL取健康人外周血,采用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞PBMC。取无菌10cm培养皿,按约8×107-12×107个细胞/皿,将PBMC加入培养皿中,补充AIM-V培养液。置二氧化碳培养箱培养,37℃,5%CO2,3小时。3小时后加入AAV/PSMA病毒,继续培养8小时。8小时后将悬浮的T淋巴细胞转移至T75或以上的细胞培养瓶中。根据悬浮细胞密度,决定需要培养液体积和细胞培养瓶的数量。培养瓶中加入细胞因子白介素-2,置二氧化碳培养箱中,37℃,5%CO2培养。培养皿底部贴壁细胞为树突状细胞。培养皿中加入AIM-V培养基、重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-4。第六天将DC和淋巴细胞混合培养（DC：淋巴细胞为1：20）。混合培养阶段应每天在倒置显微镜下观察细胞集落情况,若观察到细胞集落稍有松散,则可判定细胞毒性T淋巴细胞（CTL）已经被激活,CTL细胞培养完成。流式细胞仪检测树突状细胞的表型CD83、CD80和CD86; CTL抗肿瘤杀伤活性的检测：用带荧光标记的CD4、CD8、CD25、CD69抗体标记CTL细胞,以流式细胞仪进行检测,得到所培养的CTL细胞中CD4+CD8+、CD25+CD4+、CD69+CD8+的表达情况；用FITC-anti-IFN-γ标记CTL,以流式细胞仪检测,得到CTL细胞中IFN-γ的表达情况。用不同MOI的病毒转染DC并用流式细胞仪进行检测,得至AAV/PSMA病毒转染DC的最佳MOI数值。研究结果1.在非小细胞肺癌中,PSMA在肿瘤细胞上的阳性表达率为54.02%,在肿瘤血管内皮细胞上的阳性表达率为85.06%；在小细胞肺癌中,肿瘤细胞上没有PSMA阳性表达,在肿瘤血管内皮细胞上PSMA阳性表达率为73.33%；在与肿瘤相邻的正常肺组织上没有发现PSMA表达。2.成功构建AAV/PSMA质粒并制备AAV/PSMA病毒；经PCR验证,构建的质粒中成功插入PSMA基因,长度为720bp；树突状细胞中CD80、CD83和CD86的表达比例分别为54%、83%和72%；CTL中CD8/CD4为1.12,CD25+CD4+、CD69+CD8+和IFN-γ的表达分别为9.052%、42.76%和39%。研究结论PSMA特异性的表达于非小细胞肺癌的肿瘤细胞和血管内皮细胞；PSMA特异性表达于小细胞肺癌的肿瘤血管内皮细胞而不表达于肿瘤细胞；与肿瘤相邻的正常肺组织无PSMA表达；PSMA可能成为肺癌早期筛查的新标志物和治疗新靶点。以AAV为载体介导抗原基因PSMA转染DC可以成功诱导生成细胞毒性T淋巴细胞,PSMA作为肿瘤相关抗原在肺癌免疫治疗中具有潜在的临床应用价值。
王国珍[8]（2011）在《肝素酶CTL表位多抗原肽（MAP）疫苗的设计及其抗肿瘤免疫效应研究》文中进行了进一步梳理[背景和目的]肿瘤生物治疗是继手术、放疗及化疗之后的第四种肿瘤治疗方式。而以树突状细胞（Dendritic cells, DCs）为基础的肿瘤免疫治疗是当今肿瘤生物治疗研究的热点。DC是目前发现的具有强大抗原提呈功能的免疫细胞,将肿瘤相关抗原（Tumor-asscociated antigen, TAA）与DC相结合是肿瘤免疫治疗的方式之一。目前所发现的TAA大多具有组织特异性,如AFP抗原只在肝癌中表达,PSA抗原只在前列腺癌中表达,以这些TAA为基础进行肿瘤免疫治疗只能杀伤表达该抗原的肿瘤组织或细胞,其治疗窗窄。因此,寻找可用于大多数肿瘤免疫治疗的肿瘤共有抗原是肿瘤免疫治疗的关键。肝素酶是一种内源性糖苷内切酶,它通过降解基底膜（Basement Membrane,BM）和细胞外基质（Extracellular Matrix ,ECM）中的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（Heparan Sulfate Proteoglycans,HSPG）促进细胞的迁移。国内外许多研究表明,肝素酶在绝大多数中晚期肿瘤中表达,与肿瘤患者的预后密切相关。抑制肝素酶的表达可以抑制肿瘤的转移,而将肝素酶转染至肝素酶阴性的肿瘤细胞中可以促进肿瘤的转移。我们过去的研究表明,肝素酶全长cDNA负载的DC可以诱导产生肝素酶特异性的细胞毒T淋巴细胞（Cytotic T Lymphocyte,CTL）,对肝素酶阳性且MHC相匹配的胃癌细胞具有明显的杀伤效应,该研究不仅提示肝素酶可作为肿瘤共有抗原用于肿瘤的免疫治疗,而且在肝素酶的全长氨基酸序列中一定存在能诱导产生肝素酶特异性的CTL表位（Epitopes）。为此,我们进一步采用生物信息学及反向免疫学技术,预测并鉴定了3条人肝素酶抗原表位和2条小鼠肝素酶抗原表位。结果表明,上述多肽表位在体内外均可诱导机体产生肝素酶特异性CTL反应,对肝素酶阳性且MHC相匹配的不同来源的各肿瘤细胞具有明显的杀伤效应;动物实验表明,小鼠肝素酶抗原表位对肿瘤荷瘤小鼠具有明显的免疫治疗和免疫保护作用。与肝素酶腺病毒疫苗相比,多肽疫苗可以体外合成,没有病毒载体的参与,安体性明显提高,因此具有更广阔的应用前景。但多肽疫苗由于分子量小,免疫原性弱,易降解,体内可能不能诱导足够强的免疫效应,因此限制了其临床应用。为解决这一弊端,1988年Tam首先提出了多抗原肽（Multiple antigen peptides, MAP）的设计策略,即采用分子量小且免疫原性弱的赖氨酸为核心基质,将若干条（一般为4条或8条）抗原表位单体耦联在一起,形成树枝样结构。这种MAP疫苗的设计原理不仅适用于B细胞表位,而且适用于T细胞表位。基于以上分析,本研究拟在以往研究的基础上,将成功鉴定出的3条人肝素酶CTL表位[277-285（KMLKSFLKA,Hpa277）, 525-533（PAFSYSFFV,Hpa525）和405-413 （WLS LLFKKL, Hpa405）]和2条小鼠肝素酶CTL表位[519-526（FSYGFFVI, mHpa519）和398-405（LSLLFKKL,mHpa398）分别构建成四分枝肽的MAP疫苗,研究其体内及体外的抗肿瘤活性,并与肝素酶CTL表位单体多肽疫苗诱导的CTL活性进行对比,为肝素酶T细胞MAP疫苗抗肿瘤效应的临床应用提供理论依据。[方法]1、将三条人肝素酶CTL表位[ 277-285（KMLKSFLKA, Hpa277） , 525-533 （PAFSYSFFV,Hpa525）和405-413（WLSLLFKKL, Hpa405）]以及两条小鼠肝素酶CTL表位[519-526（FSYGFFVI, mHpa519）和398-405（LSLLFKKL, mHpa398）]设计成MAP结构,采用标准固相肽合成法（SPSS）合成MAPs;采用反相高压液相色谱仪（RP-HPLC）分析其纯度;采用液相色谱/质谱联用（LC/MS）测目标多肽分子量。阴性对照肽选用人HLA限制性流感病毒HLA-A2.1限制性表位（NYKHCFEI）。2、按文献分离培养人外周血单个核细胞（PBMC）来源的DCs。采用光学显微镜观察其形态,并采用流式细胞术鉴定其细胞表面CD分子的表达。然后以人肝素酶MAP肽、相应单肽分别负载DC后,诱导产生肝素酶特异性CTL,制备效应细胞。采用标准51Cr释放实验检测肝素酶特异性CTL对不同靶细胞[SW480结肠癌细胞（Hpa+, HLA-A2.1+）、KATO-Ⅲ胃癌细胞（Hpa+, HLA-A2.1+）、U2OS骨肉瘤细胞（Hpa+, HLA-A2.1+）、MCF-7乳腺癌细胞（Hpa-, HLA-A2.1+）、转染了肝素酶cDNA的MCF-7/Hpa乳腺癌细胞（Hpa+, HLA-A2.1+）、HepG2肝癌细胞（Hpa+, HLA-A2.1-）、转染了HLA-A2.1cDNA的HepG2/HLA-A2.1肝癌细胞（Hpa+, HLA-A2.1+）]的免疫杀伤效应;采用同样方法检测上述效应细胞对少量表达肝素酶的自体淋巴细胞和DC的免疫杀伤活性以研究其毒副作用;采用ELISPOT技术检测上述效应细胞IFN-γ释放情况。3、按文献分离培养C57BL/6-Tg（HLA-A2.1+）小鼠骨髓来源的树突状细胞（mDC）,采用光学显微镜观察其形态,采用流式细胞术鉴定细胞表面CD分子的表达。将所选人肝素酶CTL表位MAP肽、相应单肽负载mDC后,免疫小鼠三次,每周一次。取其脾淋巴细胞作为效应细胞,采用51Cr释放实验检测肝素酶特异性CTL对上述的靶细胞以及自体淋巴细胞和树突状细胞的杀伤效应;采用ELISPOT检测效应细胞IFN-γ释放。4、按文献方法分离培养获得C57BL/6（H-2Kb）小鼠骨髓来源的成熟树突状细胞（mDC）,光学显微镜观察其形态和流式细胞术检测其细胞表面CD分子的表达。用小鼠肝素酶CTL表位多抗原肽、相应单肽分别负载的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠三次,每周一次,然后取其脾淋巴细胞当作效应细胞,采用标准51Cr释放试验检测肝素酶多肽诱导的特异性CTL对不同肿瘤细胞[EL-4淋巴瘤细胞(mHpa+,H-2Kb+)、B16黑色素瘤细胞(mHpa+,H-2Kb+)、Lewis肺癌细胞(mHpa+,H-2Kb+)、P815肥大细胞瘤细胞（mHpa+,H-2Kb-）]以及自体淋巴细胞和mDC的免疫杀伤效应。采用ELISPOT检测上述效应细胞IFN-γ释放。5、为研究肝素酶MAP肽对荷瘤小鼠的免疫保护,先将肝素酶多肽负载的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠三次,每周一次,再将B16黑色素瘤细胞接种到C57BL/6小鼠背部皮下,每10天测一次肿瘤直径,一月后处死,比较肿瘤大小。为研究肝素酶MAP肽对荷瘤小鼠的免疫治疗作用,先将B16黑色素瘤细胞接种到C57BL/6小鼠皮下,待肿瘤长至1mm左右时,再用肝素酶多肽负载的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠三次,每周一次,一月后处死,比较肿瘤大小。为研究肝素酶MAP肽对荷瘤小鼠的生存时间的影响,采用免疫治疗的研究方法,观察肝素酶疫苗接种后,记录死亡小鼠的死亡时间、数量及组别,观察时间为三个月。6、实验数据以x±SD表示,采用SPSS11.5统计软件进行t检验,当P﹤0.05时认为有统计学意义。[结果]1、采用标准固相肽合成法（SPSS）合成人及小鼠肝素酶MAP肽及相应的单肽。采用反相高压液相色谱仪（RP-HPLC）分析其纯度。采用液相色谱/质谱联用（LC/MS）测其分子量。结果表明合成的多抗原肽及相应单肽的纯度均在90%以上,达到国际多肽实验标准。所得肽的分子量理论值与实测值之间无明显差异,说明所合成的肽是我们所需的目的多肽。2、体外（In vitro）和离体（Ex vivo）实验表明,人肝素酶特异性CTL对于肝素酶阳性且HLA-A2.1匹配的SW480、U2OS和KATO-Ⅲ细胞具有明显的杀伤效应,且肝素酶MAP肽诱导的杀伤效应明显高于相应单肽诱导的杀伤效应;但对HLA-A2.1阳性但肝素酶阴性的MCF-7细胞和肝素酶阳性但HLA-A2.1阴性的HepG2细胞均无杀伤效应,而对肝素酶阳性且HLA-A2.1匹配的MCF-7/Hpa细胞和HepG2/HLA-A2.1细胞,且MAP肽诱导的杀伤效应亦明显高于相应单肽诱导的杀伤效应。提示人肝素酶MAP肽能激发较相应单肽更强的特异性抗肿瘤效应;肝素酶MAP肽诱导的CTL反应具有肝素酶特异性且受HLA-A2.1限制。进一步检测了肝素酶特异性CTL对少量表达肝素酶的自体淋巴细胞和DC是否具有免疫杀伤效应,结果表明无论是肝素酶MAP肽诱导的效应细胞,还是相应单肽诱导的效应细胞,均对上述两种靶细胞无明显杀伤效应,提示肝素酶MAP肽疫苗的安全性。ELISPOT检测效应细胞IFN-γ的分泌情况,结果表明MAP肽可以诱导更多的效应细胞产生IFN-γ。在删除CD4+T淋巴细胞后,肝素酶MAP肽及相应单肽诱导效应细胞分泌IFN-γ的水平均下降,提示CD4+T淋巴细胞在CD8+ T淋巴细胞的生成过程中具有重要作用。3、小鼠肝素酶多肽疫苗的研究表明,小鼠肝素酶特异性CTL对肝素酶阳性且H-2Kb阳性的EL-4淋巴瘤细胞、Lewis肺癌细胞以及B16黑色素瘤细胞具有明显的杀伤效应,且小鼠肝素酶MAP肽诱导的杀伤效应明显高于相应单肽诱导的杀伤效应;而对肝素酶阳性但H-2Kb阴性的P815肥大细胞瘤细胞不具有杀伤效应,对少量表达肝素酶的自体淋巴细胞和mDC亦不具有杀伤效应。进一步采用ELISPOT检测肝素酶特异性效应细胞IFN-γ的分泌能力,结果显示肝素酶MAP肽促进效应细胞IFN-γ的分泌能力明显高于相应的单肽;在删除CD4+T淋巴细胞后,上述效应细胞IFN-γ分泌水平均明显下降。4、在体研究小鼠肝素酶MAP肽及其相应的单肽对小鼠的免疫保护及免疫治疗效应。免疫保护效应结果表明小鼠肝素酶MAP肽及其相应的单肽免疫保护组小鼠皮下肿瘤体积明显小于阴性肽组及未保护组（PBS组）（p<0.05）,且MAP肽组小鼠皮下肿瘤体积明显小于相应单肽组（p<0.05）,提示小鼠肝素酶MAP肽对荷瘤小鼠免疫保护效应高于相应的单肽组。免疫治疗效应结果表明,小鼠肝素酶MAP肽及其相应的单肽免疫治疗组小鼠皮下肿瘤体积明显小于阴性肽组及未治疗组（PBS组）（p<0.05）,且多抗原肽组小鼠皮下肿瘤体积小于相应单肽组（p<0.05）,提示小鼠肝素酶多抗原肽对荷瘤小鼠免疫治疗效应强于相应的单肽组。进一步研究肝素酶多肽疫苗对荷瘤小鼠的生存时间的影响,结果表明,肝素酶MAP肽组荷瘤小鼠生存时间明显长于阴性肽组及未治疗组（PBS组）,同样长于相应的单肽组。[结论]1、采用标准固相肽合成法（SPSS）合成三条人及两条小鼠肝素酶多抗原肽[MAP4-Hpa（525-533）（PAFSYSFFV）,MAP4-Hpa（277-285）（KMLKSFLKA）, MAP4-Hpa（405-413）（WLSLLFKKL）, MAP4-mHpa（398-405）（LSLLFKKL）, MAP4-mHpa （519-526） （FSYGFFVI）]及相应的单肽,采用反相高压液相色谱仪（RP-HPLC）分析其纯度,采用液相色谱/质谱联用（LC/MS）测其分子量。结果表明合成的多抗原肽及相应单肽的纯度达到国际多肽实验标准,所合成的肽的分子量理论值与实测值无明显差异,为我们所需的目的多肽。2、无论人还是小鼠的肝素酶MAP肽体外及离体均可诱导产生较相应单肽更强的抗肿瘤反应,这种抗肿瘤免疫效应是肝素酶特异、且受MHC限制。肝素酶特异性CTL,无论是MAP肽诱导的,还是相应单肽诱导的,对少量表达肝素酶的自体淋巴细胞和DCs均无明显的杀伤效应,提示这种疫苗的安全性。此外,肝素酶MAP肽促进效应细胞IFN-γ的分泌能力强于相应的单肽,这种IFN-γ分泌能力在CD4+T淋巴细胞删除后明显减少,提示肝素酶MAP可以通过促进IFN-γ的分泌以增强非特异性的抗肿瘤效应,CD4+T淋巴细胞在CD8+T淋巴细胞的生成过程中发挥重要作用。3、体内研究证实小鼠肝素酶MAP肽可以增强荷瘤鼠的免疫保护及免疫治疗效应,并且可以明显增加荷瘤鼠的生存率,延长荷瘤鼠的生存时间。以上研究表明,肝素酶MAP肽不仅能激发较相应单肽更强的特异性的抗肿瘤效应,而且还能诱导一个较相应单肽更强的非特异性抗肿瘤的良性循环,这种肝素酶MAP疫苗具有高效、特异、安全的特点,为肝素酶MAP肽疫苗的临床应用提供了理论和实验依据。
阳志军[9]（2008）在《卵巢上皮癌相关抗原的筛选、鉴定、血清学检测及抗原基因生物学功能的初步研究》文中提出卵巢癌是严重危胁女性生命健康的恶性肿瘤,具有起病隐藏、复发死亡率高的特点。因早期缺乏典型临床症状,75%患者确诊时已是晚期,这些患者的5年生存率也从临床Ⅰ期患者的95%下降到约20～25%,因此早期诊断对于提高生存率、改善患者预后具有重要的意义。然而,目前仍缺乏有效的早期诊断方法,没有能有效用于卵巢癌早期诊断的标志物。SEREX技术的建立不仅为肿瘤抗原的筛选提供了一种新的方法,而且通过对肿瘤抗原自身抗体的检测为肿瘤的诊断提供了新的血清标志物。目前对肿瘤抗原自身抗体的研究主要集中在IgG型抗体,对于IgM型抗体的报导很少。本研究在已有的研究基础上,用SMARTA法对从卵巢浆液性囊腺癌腹水肿瘤cDNA表达文库中筛选出10个抗原克隆进行血清学检测,对其中6个（TM4SF1、C1D、TIZ、OV-142、FXR1、OV-189）在卵巢癌血清中阳性率明显高于正常对照血清的抗原克隆进行测序分析;用RT-PCR法检测它们在卵巢癌组织中的表达情况;构建、表达、纯化了原核重组融合蛋白;建立了间接ELISA法,检测了血清中这些抗原IgG、IgM型自身抗体的相对含量,分析了这些卵巢肿瘤相关抗原自身抗体（谱）在卵巢癌诊断及预后中的作用;并对其中一个相关抗原基因FXR1在卵巢癌细胞中的生物学功能进行了初步研究。第一部分卵巢上皮癌相关抗原异体血清筛选及生物学信息分析目的:检测候选卵巢上皮癌相关抗原克隆与卵巢癌、正常对照血清中相应IgG、IgM型自身抗体反应情况,并对阳性反应率差异显着的抗原克隆进行测序及生物信息学分析。方法:用SMARTA法对10个候选卵巢上皮癌相关抗原克隆与62例卵巢癌、62例正常对照血清中IgG、IgM型自身抗体反应情况进行定性检测,从中选出在癌血清中抗体阳性反应率与正常对照血清相比差异显着的抗原克隆,进行核苷酸测序,在相关网站上进行生物信息学分析。结果:其中6个抗原克隆与卵巢癌血清中自身抗体阳性反应率显着高于正常对照血清,在癌血清中的阳性率为12.9%～27.4%,在正常血清中的阳性率为1.6%～11.3%,其中IgM型自身抗体的阳性率为19.4%～27.4%。对这6个抗原克隆进行核苷酸测序,经比对分析发现这6个抗原克隆其中4个是已知基因（TM4SF1、C1D、TIZ、FXR1）,一个是与卵巢癌相关基因高度相似的基因（OV-142）,一个是Genbank中无相似序列的新基因（OV-189）。TM4SF1蛋白是一种有四个疏水跨膜区的细胞表面蛋白,该蛋白在对调节细胞生长、活化、迁移的信号转换中起媒介作用,在肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢上皮性癌等上皮细胞恶性肿瘤中高表达,是一种细胞表面抗原,可作为抗体免疫治疗的靶向。C1D基因编码的是一个保守的DNA绑定蛋白,C1D蛋白是一个隐藏的凋亡激活剂,是多发性肌炎硬皮病重叠综合征的自身抗原。FXR1蛋白是一种RNA绑定蛋白,可在在核与胞浆间穿梭,与多聚核糖体有关,具有细胞生长依赖的翻译活性功能,有可能是硬皮病的一种自身抗原,并且在肺鳞状细胞癌中检测到FXR1基因的过表达。TIZ是一个锌指蛋白,通过调节肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）的信号活性,在破骨细胞分化过程中起一定作用。尚未见有C1D、TIZ、FXR1与卵巢癌相关的报导。其中OV-142有可能是BARD1基因的剪切变异体,可能有MHC-Ⅰ类抗原表位肽,可能成为卵巢癌免疫治疗的新靶点。初步认为OV-189是LINE中有转录活性的一种—L1家族中的一个新成员,可能有MHC-Ⅰ类抗原表位肽,有可能成为卵巢癌免疫治疗的靶点。结论:我们的研究显示卵巢上皮癌相关抗原不仅能够介导IgG体液免疫反应而且能够诱导机体产生特异性的IgM自身抗体,这些抗原克隆在异体癌血清中较高的抗体阳性反应率,提示这些抗原的自身抗体有可能成为卵巢癌诊断的血清标志物。这些抗原基因有进一步研究的价值。第二部分RT-PCR检测卵巢上皮癌相关抗原基因在卵巢癌组织中的相对表达水平目的:检测卵巢上皮癌相关抗原基因在卵巢癌、良性卵巢肿瘤、正常卵巢组织中的相对表达水平。方法:用RT-PCR方法检测上述6个卵巢上皮癌相关抗原基因在36例卵巢癌、15例良性卵巢肿瘤及13例正常卵巢组织中的相对表达水平。结果:这6个抗原基因在癌、良性肿瘤、正常卵巢组织中几乎都有表达,只是在癌组织中的表达水平明显高于良性肿瘤及正常卵巢组织。显示出三种表达趋势:一类是癌组织中的表达水平显着高于正常卵巢组织,而良性肿瘤组织中的表达水平高于正常组织,癌组织中的表达水平稍高于良性肿瘤组织（TIZ、C1D、TM4SF1、OV-142）;一类是癌组织中的表达水平显着高于良性肿瘤及正常卵巢组织,而良性与正常组织中表达相当（OV-189）;一类是癌组织中的表达水平明显高于良性,癌与良性肿瘤组织中的表达水平均显着高于正常组织,且晚期癌组织中表达水平显着高于早期,分化差的组织表达水平显着高于分化好的（FXR1）。结论:我们在mRNA水平证实这6个卵巢上皮癌SEREX抗原基因均与癌组织有很好的相关性。第三部分卵巢上皮癌相关抗原蛋白的表达、纯化目的:在原核表达系统中构建、表达、纯化这6个抗原蛋白。方法:用RT-PCR克隆这些抗原基因的CDS,在pET-30b（+）系统中构建原核表达质粒,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达重组融合蛋白,采用Ni-NTA His-Bind Resins和SDS-PAGE制备胶电洗脱进行纯化,复性、浓缩得到有活性的目的蛋白。结论:成功构建、表达、纯化了这6个抗原蛋白,得到浓度在0.3～0.8mg/ml之间,纯度都在90%以上、有活性的重组融合抗原蛋白。第四部分卵巢癌上皮癌相关抗原自身抗体谱的研究目的:用自己制备的抗原蛋白建立间接ELISA法,检测这些卵巢上皮癌相关抗原在血清中相应自身抗体的相对含量,并分析它们的临床价值。方法:建立间接ELISA法,检测126例治疗前、24例治疗后卵巢癌、42例良性卵巢肿瘤、20例乳腺癌、20例食管癌、20例肺癌癌患者、142例正常女性对照血清中卵巢上皮癌相关抗原IgG、IgM型自身抗体的相对含量。绘制ROC曲线,确定cut off值,单独或用Logistic回归分析法联合分析这些自身抗体/抗体谱的临床价值。同时测量CA125的含量,比较自身抗体谱与CA125在卵巢癌诊断上的效能。结果:分析单个自身抗体时,卵巢癌血清中这些抗原IgG型自身抗体反应的阳性率为34.1%～47.6%,非癌患者的阳性率为13.0%～17.9%;癌血清中IgM型自身抗体反应的阳性率为39.7%～53.2%,非癌患者的阳性率为12.0%～33.2%,分析单个卵巢癌相关抗原自身抗体在卵巢癌诊断时意义均不大,但TIZ、FXR1、OV-189抗原IgM型自身抗体在早期病人中的阳性率均高于晚期病人,两者相比较差异有统计学意义。当联合多个自身抗体（抗体谱）:TM4SF1 IgG、C1D IgG、TIZ IgG、TIZ IgM、FXR1 IgG、FXR1 IgM分析时敏感为75.4%,特异性为78.2%,准确性为76.5%,与单独分析CA125相比较敏感性明显提高（61.1%）,特异性降低（89.1%）,准确性相当（77.7%）,但该自身抗体谱在早期（76.6%versus 51.1%）尤其是Ⅰ期（83.3%versus 44.4%）卵巢癌诊断的敏感性显着高于CA125,差异有统计学意义。将多个卵巢癌相关抗原自身抗体（TM4SF1 IgG、TM4SF1 IgM、C1D IgG、TIZ IgM、FXR1 IgG）与CA125联合分析时,诊断卵巢癌的敏感性为86%,特异性为91%,准确率为88.7%,与CA125相比,在敏感性、特异性、准确性均提高,阳性预测值、阳性似然比、阴性预测值明显提高,阴性似然明显降低;并且与CA125联合后在上皮性癌（包括浆液、粘液性癌）的诊断敏感性显着高于CA125,统计学上差异有显着性;同时对于早期、晚期卵巢癌的诊断敏感性亦显着高于CA125,统计学上差异有显着性。比较了配对的24例卵巢癌患者治疗前后卵巢癌自身抗体谱变化情况,结果显示治疗后自身抗体谱的阳性率显着低于治疗前。乳腺癌、食管癌、肺癌血清的检测,结果发现卵巢癌自身抗体谱的阳性率分别为30%、20%、25%。结论:卵巢癌患者血清中存在IgG型、IgM型肿瘤自身抗体,并且可用于卵巢癌早期诊断。联合多个卵巢癌肿瘤自身抗体可达到与CA125相当的诊断效果,且该自身抗体谱在早期特别是Ⅰ期卵巢癌的诊断上优于CA125。将多个自身抗体与CA125联合可显着提高卵巢癌的诊断效能。卵巢上皮癌相关抗原自身抗体谱对疗效也有一定的监测作用。第五部分真核转染上调FXR1基因表达对卵巢癌细胞生物学行为影响的初步研究目的:了解上调FXR1基因表达对卵巢癌细胞系H08910生物学行为的影响。方法:RT-PCR扩增FXR1 CDS,构建FXR1真核表达载体,脂质体介导下转染H08910细胞,经G418筛选获得稳定转染株,检测转染后细胞相应生物学行为。结果:成功构建了FXR1基因的真核表达载体,并稳定转染了H08910细胞。生长曲线显示上调FXR1基因表达可促进细胞的生长;克隆形成实验显示上调FXR1基因表达可促进细胞增殖,基质粘附实验显示上调FXR1基因表达可加强细胞对基质的粘附能力,流式细胞周期检测亦发现与对照（80%）相比,转染FXR1基因后G1期细胞（67.1%）比例明显减少,这说明转染FXR1后细胞的增殖更旺盛。同时发现FXR1对细胞侵袭、迁移的能力无明显影响。凋亡检测虽提示转染FXR1基因后早期凋亡细胞的比例较对照增多,但总的凋亡细胞比例太少仅0.31%,意义可能不大。结论:真核载体稳定转染技术是一种可靠、行之有效的研究基因功能的方法。上调FXR1基因表达可能有促进卵巢癌细胞的生长、增殖、加强细胞对基质粘附能力的作用。第六部分RNA干扰FXR1基因对卵巢癌细胞系生物学行业影响的初步研究目的:了解抑制FXR1基因表达对卵巢癌细胞系A2780生物学行为的影响。方法:设计、合成、筛选有效的FXR1基因siRNA,将有效siRNA商业化构建siRNA表达载体,脂质体介导下转染A2780细胞,经G418筛选获得稳定转染株,检测转染后细胞相应生物学行为。结果:设计并成功筛选出了抑制效率达80%的FXR1基因siRNA,将商业构建的siRNA表达载体成功稳定转染了A2780细胞,抑制效率约60%。细胞生长曲线显示出下调FXR1表达可轻度抑制细胞的生长;克隆形成实验结果显示,下调FXR1基因的表达对A2780细胞的增殖能力有的抑制作用;流式细胞周期分析发现下调FXR1基因的表达G1期细胞比例为49.2%多于转染阴性对照组（40%）,S期与G2期比对照比例稍少,提示抑制FXR1基因的表达可延缓细胞增殖;同时发现下调FXR1基因的表达对A2780细胞体外侵袭、迁移能力、基质粘附能力及凋亡无明显影响。结论:RNAi技术是一种强有力的研究基因功能的方法。抑制FXR1基因的表达可轻度抑制A2780细胞的生长、明显抑制细胞增殖。
李昌[10]（2008）在《新型抗HIV-1蛋白西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂构建、表达与活性研究》文中提出本研究针对当前AIDS/HIV治疗中面临的病毒变异快、病毒感染细胞贮存池难以清除、病毒感染造成机体免疫功能损伤等关键问题,以构建具特异杀伤和免疫治疗双重功能的基因工程制剂为目标,筛选能够与HIV-1膜蛋白特异结合的抗病毒蛋白西诺维恩（CVN）、格瑞弗森（GRFT）以及免疫诱导因子金黄色葡萄球菌外毒素A（SEA）为研究对象,利用细菌和酵母表达系统,获得了重组抗病毒蛋白CVN、GRFT及其偶联SEA的重组导向制剂CS、GS,对其进行初步活性分析。同时制备了稳定表达中国流行株HIV-1膜蛋白的靶细胞模型,利用该模型,通过免疫印迹（Western blot）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光测定（IFA）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤试验等,对CVN、GRFT及其重组导向制剂CS、GS的体外结合活性、细胞结合活性及细胞杀伤活性进行研究。结果表明,成功获得了抗病毒蛋白和重组导向制剂,并且都具有良好的细胞结合活性。重组导向制剂可非特异性活化PBMCs、特异性介导CTLs杀伤表达HIV-1膜蛋白的靶细胞,为该制剂进一步推向临床奠定了基础。
二、泰素耐药相关基因-3细胞毒性T淋巴细胞表位负载树突状细胞疫苗的体外免疫效应研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、泰素耐药相关基因-3细胞毒性T淋巴细胞表位负载树突状细胞疫苗的体外免疫效应研究（论文提纲范文）
（1）改造型TP53共享新抗原诱导抗肝癌作用的研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 肝癌TP53 共享新抗原的改造及其对肝癌细胞的抑制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 改造型TP53 共享新抗原诱导的T细胞对消化系统肿瘤细胞的抑制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 新抗原在实体肿瘤中的应用进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 致谢 |
（2）黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备 |
| 材料和方法 |
| 1.标本来源 |
| 2.材料及试剂 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1. MUC1在人乳腺癌组织中表达情况 |
| 2.MUC1在乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞中的表达 |
| 3.过表达MUC1慢病毒质粒的构建结果 |
| 4.分离培养DC的形态学特征及表型分子表达 |
| 5.转染效率测定 |
| 6.MUC1-DC中MUC1 mRNA和蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MUC1-DC免疫功能的体外研究 |
| 材料和方法 |
| 1.试剂与仪器 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.MCU1-DC诱导CTL条件的优化 |
| 2.MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-ɑ的含量 |
| 3.MUC1-DC对CTL杀伤活性的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用 |
| 材料和方法 |
| 1.动物来源 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.慢病毒转染条件优化 |
| 2.光学分子成像活体检测MUC1-DC对裸鼠乳腺癌移植瘤的抑制作用 |
| 3. MUC1-DC对裸鼠移植瘤体积和重量的影响 |
| 4.MUC1-DC对裸鼠移植瘤Caspase3表达的影响 |
| 5.TUNEL法检测裸鼠移植瘤中的细胞凋亡率 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 基因修饰的树突状细胞在抗肿瘤免疫中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 博士在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（3）半细菌化类鼻疽杆菌载体制备LL/2肺癌疫苗及其抗肿瘤效应研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 一、实验材料、试剂及仪器 |
| 1.1 实验对象动物 |
| 1.2 实验材料、试剂 |
| 1.3 主要实验耗材仪器设备 |
| 1.4 CpG序列 |
| 1.5 试剂溶液配置 |
| 二、实验方法 |
| 2.1 LL/2 肿瘤裂解物制备 |
| 2.2 半细菌疫苗骨架制备 |
| 2.3 LL/2 肿瘤裂解物半细菌疫苗(SB-LC)制备 |
| 2.4 LL/2 肿瘤裂解物半细菌疫苗(SB-LC)体外对DC成熟、活化影响 |
| 2.5 ELISA法 |
| 2.6 流式细胞术 |
| 2.7 免疫接种实验分组 |
| 2.8 荷瘤小鼠模型建立 |
| 2.9 肿瘤疫苗治疗性实验组研究 |
| 2.10 肿瘤疫苗预防性实验组研究 |
| 2.11 细胞毒实验CTL诱导杀伤反应 |
| 2.12 Western Blot检测 |
| 2.13 酶联免疫斑点实验ELISPOT |
| 2.14 LL/2 动物模型肿瘤浸润淋巴细胞表型分析 |
| 2.15 统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 1.半细菌骨架及LL/2 肿瘤裂解物半细菌疫苗制备/表征 |
| 2.SB-LC疫苗处理诱导BMDC成熟及活化 |
| 3.SB-LC疫苗在治疗性实验组中对小鼠LL/2 肿瘤生长影响 |
| 4.SB-LC疫苗在预防组模型中对小鼠LL/2 肿瘤生长影响 |
| 5.SB-LC疫苗在LL/2 模型中诱导肿瘤细胞特异的CTL细胞毒反应 |
| 6.SB-LC疫苗对体液免疫反应影响 |
| 7.SB-LC疫苗处理组荷瘤小鼠免疫抑制微环境的改变 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肿瘤免疫治疗策略方法研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 附录 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（4）CTP介导BCR-ABL来源抗原肽段增强DC抗原交叉提呈诱导抗CML效应（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 CTP融合肽段胞质定位能力与交叉抗原提呈效应观察 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 CTP融合肽段诱导CML特异性免疫应答的体外探究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 CTP融合肽段负载DC后对BP210 致病BALB/c小鼠的免疫治疗和免疫记忆效应 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 课题的创新之处 |
| 课题的不足及后续研究计划 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的论文 |
（5）自组装短肽水凝胶抗肿瘤疫苗的制备及其免疫治疗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 肿瘤免疫治疗概述 |
| 1.1 肿瘤的特征 |
| 1.2 肿瘤的免疫逃逸 |
| 1.3 肿瘤的免疫治疗 |
| 2 肿瘤疫苗 |
| 2.1 DCs疫苗 |
| 2.1.1 DCs的来源及生物学特征 |
| 2.1.2 DCs抗肿瘤的作用机制 |
| 2.1.3 DCs疫苗存在的问题 |
| 2.2 表位疫苗 |
| 2.2.1 表位疫苗的分类 |
| 2.2.2 表位疫苗的载体 |
| 2.2.3 表位疫苗的应用及存在的问题 |
| 3 免疫检查点 |
| 3.1 免疫检查点的概念 |
| 3.2 PD-1/PD-L1和CTLA-4 |
| 3.3 免疫检查点药物 |
| 4 短肽水凝胶 |
| 4.1 短肽水凝胶的概念 |
| 4.2 短肽水凝胶的设计与制备方法 |
| 4.3 短肽水凝胶的应用 |
| 5 课题的提出及研究内容 |
| 第二章 水凝胶负载DCs疫苗联合PD-1抗体的抗肿瘤研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料、仪器与实验动物 |
| 2.1 实验试剂材料 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 细胞和动物 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 短肽水凝胶的制备 |
| 3.2 短肽水凝胶的表征 |
| 3.2.1 透射电子显微镜 |
| 3.2.2 圆二色光谱 |
| 3.2.3 流变检测 |
| 3.2.4 内毒素检测 |
| 3.3 BMDCs的培养 |
| 3.4 短肽水凝胶与BMDCs混合培养 |
| 3.5 鬼笔环肽/DAPI染色 |
| 3.6 短肽水凝胶与BMDCs生物相容性 |
| 3.6.1 BMDCs死活检测 |
| 3.6.2 BMDCs摄取 |
| 3.6.3 BMDCs成熟表面标志物 |
| 3.7 水凝胶负载BMDCs疫苗的迁移和释放 |
| 3.7.1 抗原OVA体外释放 |
| 3.7.2 水凝胶疫苗的体内释放和募集 |
| 3.7.3 水凝胶疫苗的体内迁移 |
| 3.8 水凝胶负载BMDCs疫苗诱导体内免疫应答 |
| 3.8.1 疫苗制剂及免疫方案 |
| 3.8.2 淋巴结细胞分群 |
| 3.8.3 脾细胞增殖 |
| 3.8.4 ELISA检测 |
| 3.8.5 LDH检测细胞杀伤 |
| 3.9 EG7-OVA细胞的复苏及传代培养 |
| 3.10 水凝胶负载BMDCs疫苗预防淋巴肿瘤 |
| 3.11 肿瘤裂解物的制备 |
| 3.12 蛋白浓度测定 |
| 3.13 水凝胶负载BMDCs疫苗治疗淋巴肿瘤 |
| 3.13.1 治疗方案 |
| 3.13.2 制备肿瘤单细胞悬液 |
| 3.13.3 肿瘤内T细胞亚群分选与检测 |
| 3.14 实验数据分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 短肽水凝胶的制备和表征 |
| 4.2 水凝胶负载DCs的体外功能研究 |
| 4.2.1 水凝胶与DCs生物相容性 |
| 4.2.2 水凝胶对DCs摄取和成熟的影响 |
| 4.2.3 水凝胶中抗原的释放 |
| 4.3 水凝胶负载DCs的体内募集和迁移能力 |
| 4.3.1 水凝胶中DCs疫苗的体内释放 |
| 4.3.2 水凝胶疫苗体内募集内源性DCs |
| 4.3.3 水凝胶中DCs迁移到引流淋巴结 |
| 4.4 水凝胶DCs疫苗诱导体内免疫应答 |
| 4.4.1 水凝胶DCs疫苗的免疫方案 |
| 4.4.2 检测淋巴结细胞亚群 |
| 4.4.3 脾细胞增殖及特异性杀伤 |
| 4.5 水凝胶DCs疫苗的预防性抗肿瘤作用 |
| 4.5.1 肿瘤体积 |
| 4.5.2 生存期 |
| 4.5.3 淋巴结和脾中T细胞比例 |
| 4.6 水凝胶DCs疫苗的治疗性抗肿瘤作用 |
| 4.6.1 水凝胶DCs疫苗的治疗方案 |
| 4.6.2 肿瘤体积 |
| 4.6.3 肿瘤重量 |
| 4.6.4 肿瘤浸润性淋巴细胞分群 |
| 5 讨论 |
| 6 本章小结 |
| 第三章 自组装抗原表位水凝胶疫苗的抗肿瘤研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料、仪器与实验动物 |
| 2.1 实验试剂材料 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 细胞和动物 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 键合表位短肽水凝胶疫苗的制备 |
| 3.2 键合表位短肽水凝胶疫苗的表征 |
| 3.2.1 透射电子显微镜 |
| 3.2.2 圆二色光谱 |
| 3.2.3 流变检测 |
| 3.3 BMDCs的培养 |
| 3.4 键合表位水凝胶疫苗诱导BMDCs摄取和成熟 |
| 3.4.1 BMDCs死活检测 |
| 3.4.2 BMDCs摄取 |
| 3.4.3 BMDCs成熟表面标志物 |
| 3.5 键合表位水凝胶疫苗诱导体内免疫应答 |
| 3.5.1 免疫方案 |
| 3.5.2 脾单个核细胞分离 |
| 3.5.3 脾细胞增殖 |
| 3.5.4 ELISA检测 |
| 3.6 键合表位水凝胶疫苗治疗黑色素肿瘤 |
| 3.6.1 黑色素肿瘤细胞B16的复苏培养 |
| 3.6.2 黑色素体内移植瘤模型建立与治疗 |
| 3.6.3 肿瘤内T细胞亚群分选与检测 |
| 3.7 实验数据分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 键合表位短肽水凝胶的制备 |
| 4.2 键合表位短肽水凝胶的表征 |
| 4.3 键合表位水凝胶疫苗体外功能的研究 |
| 4.3.1 DCs对水凝胶表位疫苗的摄取 |
| 4.3.2 键合表位水凝胶疫苗对DCs活性的影响 |
| 4.3.3 键合表位水凝胶疫苗对DCs成熟的影响 |
| 4.4 键合表位水凝胶疫苗激活T细胞的能力 |
| 4.5 键合表位水凝胶疫苗的治疗性抗肿瘤作用 |
| 4.6 键合表位水凝胶疫苗诱导瘤内T细胞亚群 |
| 5 讨论 |
| 6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 存在的问题与展望 |
| 英文缩略语中英文对照表 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（6）可注射水凝胶肿瘤疫苗的制备与肿瘤免疫治疗效果的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 肿瘤免疫治疗现状 |
| 1.2 常见的肿瘤免疫疗法 |
| 1.2.1 DC肿瘤疫苗 |
| 1.2.1.1 非靶向性DC疫苗 |
| 1.2.1.2 体内靶向DC疫苗 |
| 1.2.1.3 体外负载肿瘤抗原的DC疫苗 |
| 1.2.2 肿瘤过继性细胞免疫治疗(ACT) |
| 1.2.2.1 淋巴因子激活的杀伤性(LAK)细胞 |
| 1.2.2.2 肿瘤浸润的淋巴细胞(TILs) |
| 1.2.2.3 细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞 |
| 1.2.2.4 γδT细胞 |
| 1.2.2.5 自然杀伤NK细胞 |
| 1.2.2.6 T细胞受体基因修饰T细胞(TCR-T) |
| 1.2.2.7 嵌合型抗原受体修饰T细胞(CAR-T) |
| 1.2.3 肿瘤抗体治疗 |
| 1.2.3.1 肿瘤靶向抗体 |
| 1.2.3.2 肿瘤免疫调节性抗体 |
| 1.2.4 肿瘤表位疫苗治疗 |
| 1.2.5 联合免疫治疗 |
| 1.2.5.1 免疫治疗与化疗联合 |
| 1.2.5.2 免疫治疗与放疗联合 |
| 1.2.5.3 免疫治疗与小分子靶向药物联合 |
| 1.2.5.4 多种免疫检查点抑制剂的联合 |
| 1.2.5.5 免疫检查点抑制剂与其他免疫治疗的联合 |
| 1.2.5.6 免疫治疗与纳米技术的联合 |
| 1.3 课题的提出及研究内容 |
| 1.4 参考文献 |
| 第二章 自组装的PEG-聚(L-缬氨酸)多肽水凝胶的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.1.1 主要试剂 |
| 2.2.1.2 细胞 |
| 2.2.1.3 主要仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 mPEG-b-聚(L-缬氨酸)聚合物(PEV)的合成和表征 |
| 2.2.2.2 差示扫描量热法(DSC)检测 |
| 2.2.2.3 PEV聚合物水溶液的自组装行为和形貌学分析 |
| 2.2.2.4 圆二色光谱(CD) |
| 2.2.2.5 流变学测量和SEM分析 |
| 2.2.2.6 PEV聚合物的细胞毒性试验 |
| 2.2.2.7 细胞的三维培养 |
| 2.2.2.8 实验数据分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 聚乙二醇多肽共聚物的合成和表征 |
| 2.3.2 PEV共聚物在水溶液中的自组装 |
| 2.3.3 聚乙二醇多肽水凝胶的流变学分析 |
| 2.3.4 PEV共聚物的细胞毒性以及用于3D细胞培养 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 参考文献 |
| 第三章 双重递送肿瘤抗原和TLR3激动剂的可注射多肽水凝胶疫苗的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.1.1 主要试剂 |
| 3.2.1.2 细胞系 |
| 3.2.1.3 动物 |
| 3.2.1.4 主要仪器与设备 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 B16黑色素肿瘤细胞裂解物(TCL)的制备 |
| 3.2.2.2 水凝胶疫苗制剂的制备和表征 |
| 3.2.2.3 体外控制释放动力学研究 |
| 3.2.2.4 小鼠骨髓树突状细胞(BMDCs)的分离培养 |
| 3.2.2.5 水凝胶疫苗对BMDCs的体外促成熟实验 |
| 3.2.2.6 负载TCL和poly (I:C)的不同水凝胶疫苗制剂体外募集DC实验 |
| 3.2.2.7 小动物活体成像检测水凝胶疫苗递送的抗原在体内靶向迁移至回流淋巴结的情况 |
| 3.2.2.8 皮下注射空白水凝胶的组织学分析 |
| 3.2.2.9 水凝胶疫苗对正常小鼠的免疫实验 |
| 3.2.2.10 多肽水凝胶疫苗制剂的抗肿瘤实验 |
| 3.2.2.11 实验数据分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 多肽水凝胶可以有效地包裹肿瘤抗原TCL和免疫增强剂poly(I:C) |
| 3.3.2 多肽水凝胶疫苗制剂能够通过抗原TCL和poly(I:C)的持续释放体外募集DCs |
| 3.3.3 多肽水凝胶的疫苗制剂可以在体外活化和成熟DCs |
| 3.3.4 多肽水凝胶可以在注射部位延长抗原的持久性,并促进体内抗原向淋巴结回流 |
| 3.3.5 负载抗原和poly(I:C)的多肽水凝胶增强体内免疫应答 |
| 3.3.6 负载Gel+TCL+poly (I:C)的多肽水凝胶疫苗诱导有效的抗黑素瘤活性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 参考文献 |
| 第四章 可注射的自组装多肽水凝胶疫苗与免疫检查点抑制剂联合治疗的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.2.1 mPEG-b-聚(L-丙氨酸)嵌段共聚物(PEA)的合成与表征 |
| 4.2.2.2 水凝胶疫苗制剂的制备和表征 |
| 4.2.2.3 细胞毒性评价 |
| 4.2.2.4 体外控制释放动力学研究 |
| 4.2.2.5 小鼠骨髓树突状细胞(BMDCs)的分离培养与体外促成熟实验 |
| 4.2.2.6 水凝胶在体内对细胞的募集,免疫小鼠血清中中和抗体的浓度以及相应的细胞因子的含量测定 |
| 4.2.2.7 DC和T细胞在体内的鉴定 |
| 4.2.2.8 体外细胞毒性T淋巴细胞(CTL)测定 |
| 4.2.2.9 多肽水凝胶疫苗制剂的抗肿瘤实验 |
| 4.2.2.10 实验数据分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 PEG化多肽水凝胶和疫苗制剂的制备和表征 |
| 4.3.2 多肽水凝胶疫苗制剂能够持续释放抗原TCL和GM-CSF来体外募集DCs |
| 4.3.3 水凝胶疫苗免疫正常小鼠后水凝胶对细胞的募集情况,血清中中和抗体IgG的浓度以及细胞因子的含量测定 |
| 4.3.4 多肽水凝胶疫苗诱导有效的抗黑色素瘤活性以及CTL反应 |
| 4.3.5 多肽水凝胶疫苗对荷瘤小鼠体内T细胞的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 参考文献 |
| 第五章 可注射的自组装抗原表位水凝胶疫苗的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.1.1 主要试剂 |
| 5.2.1.2 动物 |
| 5.2.1.3 主要仪器与设备 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.2.2.1 键合表位的小分子多肽共聚物组装体的制备及疫苗组装 |
| 5.2.2.2 小分子多肽共聚物组装体及自组装抗原表位疫苗的表征 |
| 5.2.2.3 不同多肽共聚物对BMDCs的体外促成熟实验 |
| 5.2.2.4 抗原表位水凝胶疫苗对正常小鼠的免疫实验 |
| 5.2.2.5 实验数据分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 键合表位的小分子多肽共聚物组装体的制备及表征 |
| 5.3.2 不同多肽共聚物对BMDCs的体外促成熟实验 |
| 5.3.3 不同抗原表位水凝胶疫苗制剂免疫正常小鼠后血清中中和抗体IgG的浓度以及细胞因子的含量测定 |
| 5.3.4 不同抗原表位水凝胶疫苗促进正常小鼠体内抗原向淋巴结回流 |
| 5.3.5 不同抗原表位水凝胶疫苗制剂对正常小鼠体内T细胞的影响 |
| 5.3.6 不同抗原表位水凝胶疫苗制剂免疫正常小鼠后对脾脏记忆性T细胞的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 参考文献 |
| 第六章 全文总结 |
| 论文相关综述 用于免疫调控的水凝胶支架 |
| 参考文献 |
| 英文缩略语中英文对照表 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（7）PSMA在肺癌表达及免疫治疗临床应用价值的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、PSMA在肺癌中表达情况的研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、AAV/PSMA转染DC诱导CTL |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述一 |
| 综述参考文献 |
| 综述二 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（8）肝素酶CTL表位多抗原肽（MAP）疫苗的设计及其抗肿瘤免疫效应研究（论文提纲范文）
| 中英文缩写对照 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一部分 人肝素酶 HLA-A2 限制 CTL 表位MAP 疫苗的设计及体内、外抗肿瘤免疫效应研究 |
| 前言 |
| 第一节 人肝素酶 HLA-A2 限制性 CTL 表位 MAP 疫苗的设计、合成及鉴定 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第二节 外周血单个核细胞来源树突状细胞分离、培养及鉴定 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第三节 肝素酶 CTL 表位多抗原肽(MAP)负载的树突状细胞疫苗体外抗肿瘤免疫效应研究 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第四节 小鼠骨髓来源的DC 分离、培养及鉴定 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第五节 人肝素酶 CTL 表位多抗原肽(MAP)负载的树突状细胞疫苗诱导小鼠体内肝素酶特异性CTL 反应的研究 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 主要参考文献 |
| 第二部分 小鼠肝素酶 H-2K~b 限制CTL 表位MAP 疫苗的设计及体内抗肿瘤免疫效应研究 |
| 前言 |
| 第一节 小鼠肝素酶H-2K~b限制性CTL 表位MAP 疫苗的设计、合成及鉴定 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第二节 小鼠骨髓来源树突状细胞的分离、培养及鉴定 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第三节 小鼠肝素酶H-2K~b限制性CTL 表位MAP 肽负载的mDC 疫苗体内抗肿瘤免疫效应研究 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第四节 小鼠肝素酶 CTL 表位 MAP 肽对荷瘤小鼠的免疫保护和免疫治疗效应研究 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 主要参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 照片 |
| 文献综述 多肽疫苗抗肿瘤研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生在读期间发表的文章 |
（9）卵巢上皮癌相关抗原的筛选、鉴定、血清学检测及抗原基因生物学功能的初步研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 主要英文缩写 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 一、文献综述 |
| 综述参考文献 |
| 实验技术流程 |
| 二、卵巢上皮癌相关抗原异体血清筛选及生物学信息分析 |
| 1、前言 |
| 2、材料和方法 |
| 3、结果 |
| 4、讨论 |
| 5、参考文献 |
| 三、RT-PER检测卵巢上皮癌相关抗原基因在卵巢癌组织中的相对表达水平 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、参考文献 |
| 四、卵巢上皮癌相关抗原蛋白的表达、纯化 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、参考文献 |
| 五、卵巢上皮癌相关抗原自身抗体谱的研究 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、参考文献 |
| 六、真核转染上调FXR1基因表达对卵巢癌细胞生物学行为影响的初步研究 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、参考文献 |
| 七、RNA干扰FXR1基因对卵巢癌细胞系生物学功能的影响 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、参考文献 |
| 小结 |
| 就读期间所发表论文 |
（10）新型抗HIV-1蛋白西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂构建、表达与活性研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 HIV 感染分子机制及其防治研究现状 |
| 1 AIDS/HIV 的流行情况 |
| 2 HIV 病原学 |
| 3 HIV 感染与致病分子机制 |
| 4 HIV 的进化与变异 |
| 5 AIDS/HIV 防治研究现状 |
| 6 问题与展望 |
| 第二章 抗HIV 重组导向制剂与免疫治疗研究进展 |
| 1 AIDS 靶向治疗的历史、原理及研究现状 |
| 2 AIDS 靶向治疗运载工具研究 |
| 3 AIDS 靶向治疗生物弹头研究 |
| 4 AIDS 新的免疫治疗策略研究 |
| 5 问题与展望 |
| 6 研究目的与意义 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 新型抗病毒基因西诺维恩、格瑞弗森的合成构建、原核表达及多克隆抗体制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 抗HIV 重组导向制剂CS、GS 的构建及原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 重组抗病毒蛋白及其导向制剂的纯化与复性 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 HIV-1 感染靶细胞模型的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂活性检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂在酵母中表达探索研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的学术论文及其他成果 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| CURRICULUM VITAE |
四、泰素耐药相关基因-3细胞毒性T淋巴细胞表位负载树突状细胞疫苗的体外免疫效应研究（论文参考文献）
- [1]改造型TP53共享新抗原诱导抗肝癌作用的研究[D]. 叶春梅. 福建医科大学, 2021(02)
- [2]黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究[D]. 尹良伟. 大连医科大学, 2021(01)
- [3]半细菌化类鼻疽杆菌载体制备LL/2肺癌疫苗及其抗肿瘤效应研究[D]. 徐泽. 海南医学院, 2020(01)
- [4]CTP介导BCR-ABL来源抗原肽段增强DC抗原交叉提呈诱导抗CML效应[D]. 杨浩. 重庆医科大学, 2020(01)
- [5]自组装短肽水凝胶抗肿瘤疫苗的制备及其免疫治疗研究[D]. 杨鹏翔. 北京协和医学院, 2019(02)
- [6]可注射水凝胶肿瘤疫苗的制备与肿瘤免疫治疗效果的研究[D]. 宋会娟. 北京协和医学院, 2018(02)
- [7]PSMA在肺癌表达及免疫治疗临床应用价值的初步研究[D]. 王海龙. 天津医科大学, 2014(01)
- [8]肝素酶CTL表位多抗原肽（MAP）疫苗的设计及其抗肿瘤免疫效应研究[D]. 王国珍. 第三军医大学, 2011(12)
- [9]卵巢上皮癌相关抗原的筛选、鉴定、血清学检测及抗原基因生物学功能的初步研究[D]. 阳志军. 广西医科大学, 2008(10)
- [10]新型抗HIV-1蛋白西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂构建、表达与活性研究[D]. 李昌. 吉林大学, 2008(11)