一、蚯蚓纤溶酶的分离纯化及其动力学性质研究（论文文献综述）
朱贺文[1]（2021）在《离子交换树脂有机物检测及其在应用过程中的迁移研究》文中研究指明离子交换色谱（IEC）是食品和医疗行业中应用最广泛的色谱分离方法之一。除了在生产过程中的应用研究外,很多研究都集中在与树脂接触的产品（食品、药品等）的安全性上。主要是要了解树脂中有哪些有害物质,以及这些有害物质从树脂向食品迁移的规律,不局限于重金属、邻苯二甲酸酯和苯乙烯,可能还存在其他有机残留物。目前关于离子交换树脂中有机残留物分析方法的研究较少,针对多种有机化合物同时检测方法的研究尚不成熟,有机残留物的种类和危害也尚不清楚,所以建立同时测定离子交换树脂中有机残留的方法是必要的。本文建立了用顶空气相色谱法测定离子交换树脂中甲基异丙基酮、丁酸甲酯、3-戊酮、1,3-二乙基苯、1,4-二乙基苯、二氯乙烷、间二氯苯和甲基丙烯酸甲酯等8种有机残留物的分析方法,研究了不同类型树脂中的有机残留物的种类和含量,为离子交换树脂在食品和药品中的安全使用提供依据;并将离子交换树脂应用于实际纯化案例以及研究有机残留物在纯化过程中的迁移规律,具体研究结果如下:（1）通过对影响8种有机溶剂分析准确性和灵敏度的主要因素（色谱柱、平衡温度、平衡时间、流速等）的优化,确定了顶空气相色谱的检测条件,并对该检测方法进行统计学试验。色谱条件为:采用DB-23（60 m×0.32 mm×0.25μm）色谱柱和氢火焰离子化检测器（FID）对8种有机溶剂进行检测,顶空进样器的平衡时间为30 min,平衡温度为80℃,进样器温度240℃,FID检测器温度为300℃,载气为氮气;色谱柱温度采用程序升温,在60℃下保持16 min,然后以20℃·min-1的升温速率增加到200℃,保持2min,检测流速为1.2 m L·min-1。采用外标法进行定量分析。结果表明,8种有机溶剂在0.02～200μg·m L-1范围内均呈现良好的线性关系,相关系数（R2）均大于0.9995,检出限（LOD）为0.002～0.015 ng·m L-1;8种有机溶剂在3个加标水平下的平均回收率为82.3%～109.2%,相对标准偏差（RSD,n=6）为1.06%～4.16%;用该方法检测了11种不同类型的树脂样品,在样品中均检测到含量不同的有机残留物,其中甲基丙烯酸酯型树脂Amberlite XAD761中甲基丙烯酸甲酯含量为414.37μg·g-1,苯乙烯型树脂Seplite LX-69B中甲基丙烯酸甲酯含量高达470.76μg·g-1。（2）甜菊糖苷纯化实验中,确立了脱色树脂为Seplite LX-T5,其脱色最适温度为35℃,动态脱色时由于低流速进样时色素分子和树脂接触更充分,脱色效果较好,最适流速为1 m L·min-1;大孔吸附实验时,由于温度升高会增加甜菊苷（ST）和莱鲍迪苷A（RA）在水相中的溶解度,使得被吸附的溶质减少,Seplite LX-69B对ST和RA的静态饱和吸附载量在25℃有最大吸附量,分别为648.09 mg·g-1,436.26 mg·g-1,解离常数为0.239 mg·g-1和0.243 mg·g-1;静态吸附时在吸附初始阶段（0～1.5 h）,树脂对溶质分子的吸附速率较快,1.5 h后,吸附速率明显减慢,3 h后,吸附量逐渐趋于平衡;动态吸附与解吸时Seplite LX-69B树脂吸附STV的饱和动态载量为252 mg·g-1,Seplite LX-69B树脂吸附RA的饱和动态载量为263.04 mg·g-1;而洗脱时两种糖苷几乎同时完全洗脱,70%乙醇作为最佳洗脱液经过2.5 BV后甜菊糖苷被全部洗脱下来。经过两步法纯化处理后,甜菊糖苷纯度从原来的35.65%提高到了91.48%,甜菊糖苷总收率为77.53%。（3）Q sepharose 6 FF纯化蚓激酶实验在p H为5,Na Cl浓度为0.1 mol·L-1洗脱时可分离到纯度较高的单一条带,蛋白纯度达到95.3%,浓度为0.354 mg·m L-1,通过纤维平板法测酶活,计算出洗脱1的单位酶活力为6.72·103 IU·mg-1,相比于原液中酶活力为1.79·103 IU·mg-1,经过Q sepharose 6 FF的纯化,单位酶活力提高到了原来的4倍。（4）通过对甜菊糖苷和蚓激酶的纯化工艺中各过程中目标有机物的检测的研究发现在纯化过程中均检测到纯化介质中迁移而来的有机残留物,甜菊糖苷纯化工艺中1,4-二乙基苯溶出量为13.27μg·g-1,单位质量树脂有机物迁移量为0.40～8.74μg·g-1,其中脱色流穿样品中有机残留物的迁移量最大占65.84%;而蚓激酶纯化实验中甲基异丙基甲酮溶出量为4.79μg·m L-1,单位体积介质中有机物迁移量为0.17～1.67μg·m L-1,其中平衡流出液样品中有机残留物的迁移量最大占37.75%。
刘丹,杨晓波,王颖,于丽红,石焱,张英杰,康万军[2]（2019）在《蚓激酶对胃癌SGC7901细胞增殖抑制和凋亡诱导作用》文中研究表明目的:探讨蚓激酶（LBK）对胃癌SGC7901细胞的调控作用,并阐明其作用机制。方法:取对数生长期SGC7901细胞,将细胞分为对照组和2、4、8 U·mL-1 LBK组。采用MTT法检测不同时间段（24、48和72h）各组SGC7901细胞增殖抑制率,采用细胞划痕实验检测各组SGC7901细胞体外迁移能力,采用流式细胞术检测各组SGC7901细胞凋亡率和不同细胞周期细胞百分率,采用Western blotting法检测各组SGC7901细胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达水平。结果:MTT检测,与对照组比较,作用24、48和72h后不同剂量LBK组SGC7901细胞增殖抑制率明显升高（P<0.01）。细胞划痕实验,与对照组比较,4和8U·mL-1LBK组SGC7901细胞划痕距离明显增加（P<0.01）。流式细胞术检测,与对照组比较,4和8U·mL-1 LBK组SGC7901细胞凋亡率明显升高（P<0.01）,G1期和S期细胞百分率明显降低（P<0.01）,G2期细胞百分率明显升高（P<0.01）。Western blotting法检测,与对照组比较,8U·mL-1 LBK组SGC7901细胞中Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,Bax和caspase-3蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。结论:LBK可抑制胃癌细胞株SGC7901增殖和迁移能力,且能够诱导细胞凋亡,其可能的机制是通过调节Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达水平来实现的。
雷敬玲[3]（2015）在《磁性壳聚糖微球固定化蚯蚓纤溶酶及其性质研究》文中认为蚯蚓纤溶酶是从蚯蚓体内提取的同时具有纤溶酶活性和纤溶酶原激活活性的蛋白质,是一种具有抗凝、溶纤、改善血液流变学性质的血栓病治疗药物,应用前景广泛。本文以环氧基活化后偶联大豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球为载体固定化蚯蚓纤溶酶,为蚯蚓纤溶酶的分离纯化提供理论依据。具体内容如下:（1）以Fe304纳米粒子为磁核,戊二醛为交联剂,span-80为乳化剂制备磁性壳聚糖微球,其最佳工艺条件:壳聚糖溶液浓度10 mg·mL-1,油水比5:1,搅拌速率600 r·min-1,戊二醛体积分数3%（v/v）。通过红外光谱、扫描电镜、磁强计等对磁性壳聚糖微球的物性进行表征,结果表明微球粒径分布均一分散性好,成功包裹Fe304粒子后最小粒径为215 nm。通过磁响应性分析该微球的饱和磁强度为67 emu·g-1,具有超顺磁响应性。（2）以环氧氯丙烷为活化剂对制备得到的磁性壳聚糖微球进行活化,其最佳工艺条件:二甲基亚砜体积分数50%（v/v）,环氧氯丙烷体积分数40%（v/v）,NaOH浓度1.6 mol·L-1,反应时间4h,活化温度40℃,微球表面环氧基修饰密度为211 μmol·g-1。（3）以大豆胰蛋白酶抑制剂为配基偶联到活化的微球上,得到微球偶联大豆胰蛋白酶抑制剂的最佳工艺条件:pH7,反应时间6 h,振动转速200 r·min-1,大豆胰蛋白酶抑制剂含量16%（v/v）,大豆胰蛋白酶抑制剂的偶联率为14 mg·g-1微球。（4）以大豆胰蛋白酶抑制剂为配基偶联的磁性壳聚糖微球为载体,对蚯蚓纤溶酶固定化,得最佳工艺条件:反应时间2.5 h,pH 7.5,微球与蚯蚓纤溶酶的固液比1:20,酶浓度15 KU·mL-1,得固定化蚯蚓纤溶酶最高活性为166U·mg-1,活力回收率为55%。固定化与游离蚯蚓纤溶酶具有相似的酶学性质,但固定化酶的耐酸碱性较游离酶更好,稳定范围更宽;储藏稳定性好,4℃保存30天后酶活仍保留78%而游离酶仅保留32%;随温度升高固定化和游离蚯蚓纤溶酶活性减小趋势逐渐增大,酶失活速率加快,当温度超过60℃时,两者失活现象明显,但固定化蚯蚓纤溶酶的热稳定性明显优于游离酶。动力学分析表明,在30～60℃范围内,固定化和游离蚯蚓纤溶酶热失活的表观活化能分别为130.43 kJ·mol-1和116.65 kJ·mol-1。
殷建建[4]（2015）在《蚯蚓抗损伤有效成分对小鼠创伤愈合作用的研究》文中进行了进一步梳理目的：为了探讨蚯蚓抗损伤有效成分（EADEC）促进创伤愈合、抗菌消炎作用及机理,本实验将探索蚯蚓抗损伤有效成分对小鼠机械性损伤模型的治疗作用,为其对创伤愈合的治疗效果及机制提供理论依据,对今后动物源性药物制剂的研发及蚯蚓提取物在药用的延展提供新的思路。内容及方法：1、蚯蚓抗损伤有效成分采用电击蚯蚓、超声波细胞破碎、硫酸铵盐析、超滤管超滤、细菌筛过滤等方式进行提取。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和药敏试验测定其蛋白质分子量范围及抑菌性检测。添加丙二醇、吐温80、蔗糖、Nacl等赋形剂制备成喷剂。2、采用KM小鼠60只,建立小鼠背部创伤模型,平均分为空白对照组、京万红治疗组和蚯蚓抗损伤有效成分组进行喷涂治疗。每日观察临床及局部愈合情况,并在3、7、11、15d后各宰杀四只,采取血液检测WBC、Gran、Lymph并分离血清测定羟脯氨酸（Hyp）、IL-6、TGF-β含量,对创伤皮肤进行组织形态学观察和免疫组化实验。实验所得数据均采用SPSS19.0统计学处理软件,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1、EADEC的蛋白分子量主要集中在15-35KD、45-55KD以及60-70KD之间；它对大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌以及枯草芽孢杆菌抑菌圈范围在6-10mm之间。2、EADEC在对小鼠创面愈合时间为14d,相比京万红组和空白对照组分别提前1d和2.5d; EADEC和京万红在第15d创面愈合率均可以达到100%,相比空白对照组提高3%；EADEC和京万红能使小鼠血液中的WBC、PLT、Gran升高；通过显微镜观察发现,EADEC组及京万红组成纤维细胞、胶原纤维较多且排列整齐,细胞质丰富,稚嫩肉芽组织迅速形成,肉芽组织中毛细血管生长旺盛,与空白对照组差异明显（p<0.05）; EADEC组中Hyp、IL-6和TGF-β的含量好于其他两组。结论：1.对小鼠局部创伤喷涂EADEC具有明显的促创伤愈合作用,能够促进小鼠创面愈合时间,减少损伤期炎症的发生,进而提高愈合质量。2. EADEC促创伤愈合的机制主要通过加速Hyp、TGF-β的分泌,进而提高胶原蛋白的合成,促进毛细血管和成纤维细胞的增殖；并通过加速IL-6、血液中WBC、PLT、 Gran的生成,加速清除坏死组织及异物,提升机体免疫力,减轻机械性损伤的炎症反应,降低感染几率,加速创面愈合。
雷敬玲,赵钟兴,王朝阳,朱长姐,冯丽锦,卢强基[5]（2015）在《固定化蚯蚓纤溶酶热稳定性及热失活动力学研究》文中研究表明通过纤维蛋白平板法测定蚯蚓纤溶酶在不同温度下的酶活力,对固定化和游离蚯蚓纤溶酶的热失活动力学进行初步分析。实验表明:随温度升高固定化和游离蚯蚓纤溶酶活性减小趋势逐渐增大,酶失活速率加快。当温度超过60℃时,两者失活现象明显,但固定化蚯蚓纤溶酶的热稳定性明显优于游离酶。动力学分析表明,在3060℃范围内,固定化和游离蚯蚓纤溶酶热失活的表观活化能分别为130.43 k J·mol-1和116.65 k J·mol-1。
董启钧[6]（2014）在《蚯蚓生物工程技术研究进展》文中研究说明蚯蚓在临床应用广泛,药理活性显着,提取成本低廉,蚯蚓的生物技术产品开发具有广阔的前景。本文对蚯蚓生物工程技术研究进展进行综述。
谢德芳[7]（2013）在《蚓激酶的分离纯化、酶学性质及体外模拟消化的研究》文中进行了进一步梳理蚓激酶是一组具有激酶和纤溶酶活性的丝氨酸蛋白水解酶的总称，具有强烈的溶栓作用，并具有给药方便、副作用小和抗凝等特点，常被用作新型的溶栓药物。本论文以赤子爱胜蚓为原料，采用盐析、超滤、凝胶过滤层析和离子交换层析等手段，对蚓激酶进行提取纯化，制备高纯度的产品，研究其酶学性质；并利用体外模拟法探讨蚓激酶在胃肠道的消化吸收，为蚓激酶的应用开发提供理论依据。其研究结果如下：试验一、蚓激酶的提取纯化的研究以赤子爱胜蚓为原料，通过组织破碎、盐析、超滤、Sephadex G-75凝胶过滤层析和DEAE-Sephedrosa FF离子交换层析等先进工艺技术进行提纯，分离得到蚓激酶纯品。采用纤维蛋白平板法进行酶活力检测，经过离子交换层析纯化后，得到比活为4006.8IU/mg，纯化倍数为10.1倍的纯品。SDS-PAGE电泳分析知道纯化的产品分子量分布在20KD60KD之间。试验二、蚓激酶酶学特性的研究研究温度、pH值及金属离子对已纯化的蚓激酶活性的影响。结果表明：提取的蚓激酶产品在pH611之间酶相对比较稳定；在20℃60℃之间该酶具有较好的稳定性；Hg2+对酶活有完全抑制作用，而Mg2+对酶活有明显的激活作用。体外溶栓试验表明，蚓激酶还具有直接溶解血栓和激活纤溶酶原，间接溶解血栓的双重功效。试验三、蚓激酶体外模拟消化及对细胞增殖作用的研究采用两步体外消化模拟法及Caco-2细胞模型模拟肠上皮细胞技术研究蚓激酶对人体消化系统的影响及吸收利用率。胃蛋白酶―胰蛋白酶法体外消化测得蚓激酶的消化率约为90%左右；Caco-2细胞模拟法可看出，纯化后0.1mg/ml和0.01mg/ml两个浓度的酶溶液对细胞生长的作用效果均呈现为促进作用，1mg/ml的酶溶液作用效果同纯化前，但增强的趋势比纯化前大，且高浓度的蚓激酶会抑制细胞的生长增值，一定纯度的低浓度蚓激酶会促进细胞生长，纯化后0.01mg/ml的酶溶液在各个时间点对细胞活性均有促进作用。
周海[8]（2010）在《蚓激酶的提取纯化、酶学性质及抗血栓效果研究》文中提出本试验以赤子爱胜蚓为原料,探讨了蚓激酶的纯化工艺参数,并对蚓激酶的酶学性质和蚓激酶的溶栓效果进行了研究。试验分为两个部分:试验一:蚓激酶的提取、纯化及酶学性质研究以赤子爱胜蚓为原料,经过匀浆抽提、硫酸铵分段盐析、膜分离、Sephadex G-75,DEAE-Sepharose 6 Fast Flow和Phenyl Sepharose High Performance色谱分离、电泳等技术对蚓激酶进行分离纯化及鉴定,并研究pH、温度、金属离子与抑制剂对蚓激酶活性的影响以及蚓激酶的作用机理。结果表明:经分离纯化后的蚓激酶比活为5100 U/mg,SDS-PAGE电泳分析得两条带,相对分子质量为32000和33500;在中性和略偏碱性环境中稳定且活性高;温度适应范围广;不同种类及浓度的金属离子对蚓激酶活性的影响不尽相同;抑制剂及底物特异性研究发现,蚓激酶属于丝氨酸蛋白酶,同时含有二硫键。体外溶栓试验表明,蚓激酶具有直接溶解纤维蛋白和激活纤溶酶原的双重作用。试验二:蚓激酶抗角叉菜胶诱导大鼠血栓形成及对凝血指标的影响试验通过大鼠角叉菜胶血栓模型,对蚓激酶的溶栓效果进行了研究。结果显示,高剂量的蚓激酶能够降低角叉菜胶诱导的大鼠尾部血栓形成率,减小角叉菜胶诱导的大鼠尾部血栓平均长度,并对血栓长度的持续增长有缓解作用;与模型对照组相比,高、低剂量组均能使凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）延长,纤维蛋白原含量（Fib）下降,其中高剂量组PT显着延长（P<0.05）,维蛋白原含量明显降低（P<0.05）,差异具有统计学意义;而且,高剂量的蚓激酶还能缓解注射角叉菜胶引起的体重负增长,说明蚓激酶能够提高机体的纤溶功能,具有预防和缓解血栓形成的作用。
田鹏[9]（2009）在《蚓激酶转基因苜蓿（Medicago sativa）及丹参（Salvia miltiorrhizae）的构建及检测》文中研究说明蚯蚓纤溶酶（Earthworm Fibrinolytic Enzymes,EFE）,又称蚓激酶,属于多组分的蛋白水解酶类,它们广泛分布于多种蚯蚓的消化道内腔及体液中,可能与摄取食物的吸收和利用有关。蚓激酶可以直接水解纤维蛋白,因此,它们既具有溶解现有血栓、也同时具有阻止血栓继续形成的功效;此外,有部分种类的蚓激酶还可以将纤溶酶原激活并转化为纤溶酶、或刺激人血管内皮细胞释放组织纤溶酶原激活剂（t-PA）,从而能够间接溶解血栓。与其它溶栓剂所不同的是,蚓激酶的毒副作用比较小,而且还可以口服给药,因此,作为一种新型的溶栓药剂,无疑具有十分广阔的应用前景。目前,在临床上应用的蚓激酶均源自人工饲喂的蚯蚓,然而,依靠人工从蚯蚓中提取蚓激酶仍然存在很多问题,比如蚯蚓饲养和繁殖周期长,生产工艺复杂和生产质量不稳定等,这些不利因素都在很大程度上制约了蚓激酶的规模化生产、利用及普及。在转基因植物中表达蚓激酶单一组分,开辟了利用植物生物反应器生产蚓激酶的新领域,可为今后蚓激酶药物降低生产成本和在临床上的更广泛应用奠定坚实基础。本研究选用苜蓿和丹参这两种常见的植物作为表达蚓激酶单一组分的宿主植物,这是因为:1)苜蓿是世界上最重要的豆科牧草之一,具有品质优、产量高、适应性强、易于贮存以及加工等许多的优点,此外,其作为生物反应器生产的重组类蛋白药物可直接口服,而且无毒无害,便于今后的规模化生产和推广;2)丹参作为一味历史悠久的中药,其本身具有扩张冠状动脉、降低胆固醇和血脂、抑制凝血和激活纤溶系统等多种作用,在临床治疗心脑血管疾病方面应用广泛且疗效十分显着。若实现蚓激酶在丹参中的表达,可通过二者的协同作用,进一步增强丹参在防治心血管疾病方面的疗效,改善丹参的药用品质。在苜蓿生物反应器构建过程中,利用本课题组先前建立的比较成熟的苜蓿组织培养再生体系,通过农杆菌介导方法,成功地将蚓激酶CST1和CST2-1基因分别导入到保定苜蓿中,先后获得转CST1基因的卡那霉素抗性再生苗130株和转CST2-1基因的卡那霉素抗性再生苗92株。对这些转基因植株进行PCR和PCR Southern检测,结果证实多数卡那霉素抗性植株分别含有上述蚓激酶编码组分。从PCR检测为阳性的转CST2-1基因再生植株中,任意选取两株进行基因组DNA Southern Blot检测,结果证实目的基因CST2-1确实已整合到苜蓿基因组中。通过ELISA,对外源蛋白表达情况进行了检测与分析,结果发现多数卡那霉素抗性植株在405nm处的吸光值都大于非转基因苗（阴性对照）,但与蚓激酶肠溶胶囊溶剂相比,其数值偏低,这表明蚓激酶基因在转基因苜蓿细胞中是有表达的,但表达效率非常低。外源转基因遗传稳定检测结果发现,经多3～5次无性继代培养后的转基因苜蓿叶片在含有卡那霉素的培养基上仍能正常分化出健康的愈伤组织,这表明外源的蚓激酶基因在转基因苜蓿中通过无性繁殖可以稳定遗传给后代。在丹参生物反应器构建过程中,首先通过对丹参的转化和培养条件进行了优化,使丹参再生幼苗的褐化和玻璃化现象大大减轻,更加完善了丹参的组织培养遗传转化再生体系。通过农杆菌介导方法,同样成功地将蚓激酶CST1和CST2-1基因分别导入到丹参中,分别获得卡那霉素抗性再生苗25株和33株。对这些再生植株进行PCR和PCR Southern检测和分析,结果证实多数卡那霉素抗性植株分别含有上述蚓激酶编码组分。从PCR检测为阳性的转CST2-1基因再生植株中,任意选取两株进行基因组DNA Southern Blot检测,结果证实目的基因CST2-1确实已整合到丹参基因组中。同样利用ELISA法对蚓激酶外源蛋白表达情况进行了检测与分析,结果发现外源蛋白表达普遍微弱,在一定程度上稍微高于转基因苜蓿的结果类似。外源转基因遗传稳定检测结果发现,经多3～5次无性继代培养后的转基因丹参叶片在含有卡那霉素的培养基上仍能正常分化出健康的愈伤组织,这表明外源的蚓激酶基因在转基因丹参中通过无性繁殖可以稳定遗传给后代。
郭金明[10]（2008）在《单环刺螠纤溶酶UFEⅠ的分离纯化和性质研究》文中研究表明血栓性疾病是严重危害人类健康的常见多发病,心脑血管疾病中有很大比例本质为血栓病,它主要危害心、脑、肺等的血管系统,造成成年人死亡或残疾。在我国,每年有超过260万人死于心脑血管疾病,每年需要进行溶栓治疗的病人超过300万人,并且,这类疾病的发病率曾逐年上升趋势。纤溶疗法是治疗血栓性疾病的主要手段之一,迄今溶栓药物已发展了三代,但距理想的溶栓药物尚有差距。寻找和开发新型溶栓剂仍是心脑血管疾病治疗的重要内容。鉴于海洋生物活性物质具有独特的优点,海洋生物日益成为新药开发的珍贵资源。本实验室经多年研究,从海洋无脊椎动物单环刺螠中寻找和分离了一种新型纤溶酶。现将主要研究结果分述如下:单环刺螠纤溶酶在单环刺螠体腔液及内脏等组织内含量丰富,经优化工艺可提取多种酶活力组分,很可能是一组同工酶。我们试用两套工艺均能制得单环刺螠纤溶酶UFEⅠ,达电泳纯,经过提取分离纯化工艺的酶纯化倍数可达11-12倍,产品酶得率可达27.0-30.0%。单环刺螠纤溶酶经Native-PAGE电泳分析,该酶纯度已经达到99%;经SDS-PAGE和飞行质谱测定其分子量约为23,800Da;糖含量测定表明,该酶不是一种糖蛋白。单环刺螠纤溶酶,在45℃以下时酶活力稳定,6 h内酶的活性基本保持不变;在10种不同pH（3、4、5、6、7、8、9、10、11）的缓冲液中于室温下放置24 h,酶活无明显改变。单环刺螠纤溶酶的最适反应温度为45℃,最适pH约为6.5。Ag+离子对单环刺螠纤溶酶有抑制作用,Mn2+和Mg2+离子对酶有活化作用。其他金属离子。以酪蛋白为底物,根据双倒数作图法（Lineweaver-Burk plot）求出的酶反应的动力学常数为:Km=3.48×10-3mol·L-1,Vmax=1.20×10-2mol·L-1·min-1。单环刺螠纤溶酶对纤维蛋白具有很高的亲和性,不仅可以降解纤维蛋白,还具有较高的激酶活性,这使得该酶能够激活纤溶酶原并使之转化为纤溶酶,从而间接地溶解纤维蛋白。体外抗凝、溶栓实验结果表明:与蚓激酶相比,单环刺螠纤溶酶具有更好的抗凝作用和溶栓效果,而且对血红细胞损伤较小。综上所述,由于单环刺螠纤溶酶分子量小、酶活性稳定、溶栓活性强、对血红细胞损伤小等优点,做为溶栓剂具有潜在的应用开发价值。
二、蚯蚓纤溶酶的分离纯化及其动力学性质研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、蚯蚓纤溶酶的分离纯化及其动力学性质研究（论文提纲范文）
（1）离子交换树脂有机物检测及其在应用过程中的迁移研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 生物分离介质 |
| 1.2.1 层析介质分类 |
| 1.2.2 离子交换树脂 |
| 1.3 离子交换树脂中的有机残留来源 |
| 1.4 有机残留物的检测技术 |
| 1.5 甜菊糖苷的分离纯化 |
| 1.5.1 甜菊糖苷简介 |
| 1.5.2 甜菊糖苷主要成分的结构 |
| 1.5.3 甜菊糖苷的分离纯化工艺 |
| 1.5.4 甜菊糖苷的检测方法 |
| 1.6 蚓激酶的分离纯化 |
| 1.6.1 蚓激酶简介 |
| 1.6.2 蚓激酶的分离纯化工艺 |
| 1.7 纯化工艺中离子交换树脂中有机残留物迁移的实验研究 |
| 1.8 立题意义及研究思路 |
| 1.8.1 立题意义 |
| 1.8.2 研究思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 样品 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 检测方法的确立 |
| 2.2.2 甜菊糖苷的纯化 |
| 2.2.3 蚓激酶的纯化工艺 |
| 2.2.4 有机残留物在纯化过程中的迁移 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 有机残留物检测方法的建立 |
| 3.1.1 顶空平衡温度的优化 |
| 3.1.2 顶空平衡时间的优化 |
| 3.1.3 8 种有机残留物标准品的出峰情况 |
| 3.1.4 方法学考察 |
| 3.1.5 小结 |
| 3.2 甜菊糖苷的纯化 |
| 3.2.1 甜菊糖苷水提液的脱色 |
| 3.2.2 大孔吸附树脂提取甜菊糖苷 |
| 3.2.3 小结 |
| 3.3 蚓激酶的纯化 |
| 3.3.1 蚓激酶的纯化工艺 |
| 3.3.2 小结 |
| 3.4 离子交换树脂中有机残留物在应用中的迁移研究 |
| 3.4.1 有机残留物1,4-二乙基苯的迁移规律 |
| 3.4.2 蚓激酶纯化过程中有机物的迁移规律 |
| 3.4.3 小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（2）蚓激酶对胃癌SGC7901细胞增殖抑制和凋亡诱导作用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞、主要试剂和仪器 |
| 1.2 细胞株培养 |
| 1.3 药物分组 |
| 1.4 MTT法检测细胞增殖抑制率 |
| 1.5 细胞划痕实验检测SGC7901细胞迁移距离 |
| 1.6 AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期百分率 |
| 1.7 Western blotting法检测SGC7901细胞中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达水平 |
| 1.8统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 各组SGC7901细胞增殖抑制率 |
| 2.2 各组SGC7901细胞划痕距离 |
| 2.4各组SGC7901细胞中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达水平 |
| 3 讨论 |
（3）磁性壳聚糖微球固定化蚯蚓纤溶酶及其性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 血栓及抗血栓药物 |
| 1.1.1 血栓简介 |
| 1.1.2 抗血栓药物 |
| 1.2 蚯蚓纤溶酶 |
| 1.2.1 蚯蚓纤溶酶的概述 |
| 1.2.2 蚯蚓纤溶酶的分离纯化 |
| 1.3 磁性微球的概述 |
| 1.3.1 磁性微球的结构 |
| 1.3.2 磁性微球的制备 |
| 1.3.3 磁性微球的应用 |
| 1.4 选题研究意义与主要内容 |
| 1.4.1 选题研究意义和目的 |
| 1.4.2 选题的主要内容 |
| 第二章 磁性壳聚糖微球的制备及表征 |
| 2.1 实验试剂和设备 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 磁性壳聚糖微球的制备 |
| 2.2.2 磁性壳聚糖微球的表征 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 制备磁性壳聚糖微球工艺优化 |
| 2.3.2 磁性壳聚糖微球的表征 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 磁性壳聚糖微球的活化和偶联工艺研究 |
| 3.1 实验试剂和仪器 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 磁性壳聚糖微球活化 |
| 3.2.2 磁性壳聚糖微球环氧基活化度分析 |
| 3.2.3 大豆胰蛋白酶抑制剂提取 |
| 3.2.4 大豆胰蛋白酶抑制剂活性测定 |
| 3.2.5 磁性壳聚糖微球偶联 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 磁性壳聚糖微球活化工艺优化 |
| 3.3.2 磁性壳聚糖微球偶联工艺优化 |
| 3.4 本章小节 |
| 第四章 磁性壳聚糖微球固定化蚯蚓纤溶酶 |
| 4.1 实验试剂和仪器 |
| 4.1.1 材料与试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 蚯蚓纤溶酶提取 |
| 4.2.2 蚯蚓纤溶酶的固定化 |
| 4.2.3 蚯蚓纤溶酶活性测定 |
| 4.2.4 固定化蚯蚓纤溶酶pH稳定性 |
| 4.2.5 固定化蚯蚓纤溶酶储藏稳定性 |
| 4.2.6 固定化蚯蚓纤溶酶热稳定性 |
| 4.2.7 固定化蚯蚓纤溶酶失活动力学参数的测定 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 尿激酶标准曲线 |
| 4.3.2 磁性壳聚糖微球固定化蚯蚓纤溶酶工艺条件研究 |
| 4.3.3 固定化蚯蚓纤溶酶的活力回收率 |
| 4.3.4 固定化蚯蚓纤溶酶的酶学性质 |
| 4.3.5 固定化蚯蚓纤溶酶热失活动力学参数测定 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录 |
（4）蚯蚓抗损伤有效成分对小鼠创伤愈合作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 一、文献综述 |
| 1.1 创伤愈合的研究进展 |
| 1.1.1 创伤愈合的基本过程 |
| 1.1.1.1 炎症反应期 |
| 1.1.1.2 增殖期 |
| 1.1.1.3 成熟期 |
| 1.1.2 创伤愈合的影响因素 |
| 1.1.2.1 中性粒细胞 |
| 1.1.2.2 巨噬细胞 |
| 1.1.2.3 成纤维细胞 |
| 1.1.2.4 血管内皮细胞 |
| 1.1.2.5 淋巴细胞 |
| 1.1.2.6 转化生长因子β(TGF-β) |
| 1.1.2.7 血小板衍生生长因子(PDGF) |
| 1.1.2.8 白细胞介素(IL) |
| 1.1.2.9 羟脯氨酸(Hyp) |
| 1.2 蚯蚓有效成分的研究进展 |
| 1.2.1 蚯蚓创伤愈合的有效成分及分离 |
| 1.2.1.1 抗菌肽 |
| 1.2.1.2 抗氧化系成分 |
| 1.2.1.3 纤溶酶 |
| 1.2.1.4 镇痛有效成分 |
| 1.2.2 蚯蚓提取物对创伤愈合的作用及机理 |
| 1.2.2.1 止血及解热镇痛作用 |
| 1.2.2.2 抗菌消炎及抗氧化作用 |
| 1.2.2.3 促进创伤愈合作用 |
| 1.2.3 蚯蚓提取物对动物创伤的临床应用 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 二、实验材料与研究方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.1.1 蚯蚓 |
| 2.1.2 小鼠 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 耗材、药品、试剂 |
| 2.2.3 试剂盒 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 蚯蚓抗损伤有效成分的技术路线 |
| 2.3.2 蚯蚓抗损伤有效成分的提取工艺 |
| 2.3.2.1 蚯蚓粗样品的制备 |
| 2.3.2.2 硫酸铵盐析、超滤 |
| 2.3.3 蚯蚓抗损伤有效成分蛋白分子量测定及抑菌性实验 |
| 2.3.3.1 蚯蚓抗损伤有效成分蛋白分子量测定 |
| 2.3.3.2 蚯蚓抗损伤有效成分抑菌性实验 |
| 2.3.4 蚯蚓抗损伤制剂的制备 |
| 2.3.5 动物实验 |
| 2.3.5.1 实验动物及分组 |
| 2.3.5.2 动物机械性损伤模型的制作 |
| 2.3.5.3 给药方式 |
| 2.3.6 实验观察指标与检测方法 |
| 2.3.6.1 临床观察 |
| 2.3.6.2 局部观察 |
| 2.3.6.3 组织学观察 |
| 2.3.6.4 相关免疫学指标测定 |
| 2.3.7 数据处理与统计学检查 |
| 三、实验结果与分析 |
| 3.1 蚯蚓抗损伤有效成分蛋白分子量及抑菌性测定 |
| 3.1.1 蛋白分子量测定 |
| 3.1.2 蚯蚓抗损伤制剂对常见细菌的抑菌性 |
| 3.2 临床观察 |
| 3.3 创面愈合率和愈合时间比较 |
| 3.4 血液学测定结果 |
| 3.5 组织病理学观察 |
| 3.6 ki-67蛋白在小鼠皮肤中免疫组化的表达 |
| 3.7 血清相关指标的测定结果 |
| 3.7.1 血清中羟脯氨酸含量的测定结果 |
| 3.7.2 血清中IL-6含量的测定结果 |
| 3.7.3 血清中TGF-β含量的测定结果 |
| 四、讨论 |
| 4.1 蚯蚓抗损伤有效成分的分离工艺 |
| 4.2 蚯蚓抗损伤有效成分制剂的筛选 |
| 4.3 蚯蚓抗损伤有效成分促进小鼠创伤愈合作用 |
| 4.3.1 调节血细胞及毛细血管作用 |
| 4.3.2 促进创伤组织生长 |
| 4.3.3 调节羟脯氨酸(Hyp)含量的作用 |
| 4.4 蚯蚓抗损伤有效成分对细胞因子的影响 |
| 五、全文总结 |
| 参考文献 |
| 中英文缩词表 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）固定化蚯蚓纤溶酶热稳定性及热失活动力学研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 磁性壳聚糖微球的制备及表征 |
| 1.2.1. 1 磁性壳聚糖微球的制备 |
| 1.2.1. 2 磁性壳聚糖微球的表征 |
| 1.2.2 蚯蚓纤溶酶活性的测定 |
| 1.2.2. 1 尿激酶标准曲线的制作 |
| 1.2.2. 2 蚯蚓纤溶酶活性测定 |
| 1.2.3 固定化蚯蚓纤溶酶制备 |
| 1.2.4 蚯蚓纤溶酶热失活测定 |
| 1.2.5 蚯蚓纤溶酶热失活动力学参数的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 磁性壳聚糖微球的表征 |
| 2.1.1 磁性壳聚糖微球红外光谱分析 (FT-IR) |
| 2.1.2 磁性壳聚糖微球扫描电镜分析 (SEM) |
| 2.2 蚯蚓纤溶酶热失活动力学测定 |
| 2.2.1 尿激酶标准曲线 |
| 2.2.2 蚯蚓纤溶酶热失活测定 |
| 2.2.3 蚯蚓纤溶酶热失活动力学参数的测定 |
| 3 结论 |
（6）蚯蚓生物工程技术研究进展（论文提纲范文）
| 1 活性成分及生物技术研究 |
| 1.1 纤溶酶: |
| 1.2 纤溶酶原激活剂: |
| 1.3 钙调素 (Ca M) 和钙调素结合蛋白。 |
| 1.4 胆碱酯酶: |
| 1.5 过氧化氢酶: |
| 1.6 抗肿瘤成分。 |
| 1.7 抗微生物蛋白: |
| 1.8 兼具溶血和凝血作用的蛋白: |
| 2 结语和展望 |
（7）蚓激酶的分离纯化、酶学性质及体外模拟消化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蚓激酶的分离纯化及理化性质 |
| 1.1.1 蚓激酶的分离纯化 |
| 1.1.2 蚓激酶的理化性质 |
| 1.2 蚓激酶的作用机理及应用 |
| 1.2.1 蚓激酶的药理作用 |
| 1.2.2 蚓激酶的作用机理 |
| 1.2.3 蚓激酶的临床应用 |
| 1.3 体外模拟消化的研究进展 |
| 1.3.1 两步体外模拟法 |
| 1.3.2 Caco-2 细胞单层模型 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 1.5 主要研究内容 |
| 第二章 蚓激酶的分离纯化研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料与试剂 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 蛋白标准曲线制作与浓度测定 |
| 2.1.4 蚓激酶活力检测方法 |
| 2.1.5 蚓激酶的分离纯化 |
| 2.1.6 蛋白质分子量分布研究 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 蚓激酶的分离纯化 |
| 2.2.2 分子量分布研究 |
| 2.3 小结 |
| 第三章 蚓激酶酶学性质的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料与试剂 |
| 3.1.2 主要仪器与设备 |
| 3.1.3 体外的血栓溶解试验 |
| 3.1.4 pH 稳定性和最适 pH 测定 |
| 3.1.5 热稳定性和最适温度测定 |
| 3.1.6 金属离子对酶活的影响 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 体外血栓溶解试验 |
| 3.2.2 pH 对蚓激酶稳定性的影响 |
| 3.2.3 温度对蚓激酶稳定性的影响 |
| 3.2.4. 金属离子对酶活的影响 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 蚓激酶体外模拟消化及对细胞增殖作用的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料与试剂 |
| 4.1.2 主要仪器与设备 |
| 4.1.3 体外消化试验 |
| 4.1.4 蚓激酶刺激对细胞的增殖作用 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 酶样的粗蛋白含量 |
| 4.2.2 酶活标曲 |
| 4.2.3 胃蛋白酶、胰蛋白酶的最适用量选择 |
| 4.2.4 酶样的体外消化率 |
| 4.2.5 细胞增殖活性试验 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 结论与建议 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 有待于进一步解决的问题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（8）蚓激酶的提取纯化、酶学性质及抗血栓效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 溶栓药物的作用及其开发现状 |
| 1.1.1 心脑血管疾病及危害 |
| 1.1.2 血栓形成机制和溶栓机理 |
| 1.1.3 溶栓药物 |
| 1.2 蚯蚓及药用成分 |
| 1.2.1 蚯蚓的药用成分及药用作用 |
| 1.2.2 蚯蚓作为畜禽饲料开发利用 |
| 1.3 蚓激酶研究进展 |
| 1.3.1 蚓激酶的分离纯化研究 |
| 1.3.2 蚓激酶的理化性质 |
| 1.3.3 蚓激酶的纤溶特点 |
| 1.3.4 底物特异性 |
| 1.3.5 抑制剂与金属离子 |
| 1.3.6 蚓激酶的肠道吸收 |
| 1.3.7 蚓激酶的药效研究 |
| 1.3.8 蚓激酶临床应用研究 |
| 1.3.9 毒性实验 |
| 1.3.10 开发利用 |
| 1.4 本课题研究目的、意义与内容 |
| 1.4.1 目的与意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第2章 蚓激酶的提取纯化及酶学性质研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料与试剂 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 蛋白浓度测定 |
| 2.1.4 蚓激酶活性测定 |
| 2.1.5 蚓激酶的分离纯化 |
| 2.1.6 蛋白质纯度鉴定及相对分子质量（Mr）测定 |
| 2.1.7 体外的血栓溶解试验 |
| 2.1.8 pH 稳定性和最适pH 测定 |
| 2.1.9 热稳定性和最适温度测定 |
| 2.1.10 金属离子与抑制剂对蚓激酶的影响 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 蚓激酶的分离纯化 |
| 2.2.2 纯度鉴定及Mr 测定 |
| 2.2.3 体外的血栓溶解试验 |
| 2.2.4 pH 对蚓激酶活性的影响 |
| 2.2.5 温度对蚓激酶活性的影响 |
| 2.2.6 金属离子与抑制剂对蚓激酶活性的影响 |
| 2.3 小结 |
| 第3章 蚓激酶抗角叉菜胶诱导大鼠血栓形成及对凝血指标的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料及动物 |
| 3.1.2 蛋白浓度及活性测定 |
| 3.1.3 蚓激酶的生物制备 |
| 3.1.4 动物分组和造模 |
| 3.1.5 检测指标与方法 |
| 3.1.6 数据处理 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 蚓激酶对角叉菜胶大鼠体重的影响 |
| 3.2.2 蚓激酶对角叉菜胶大鼠血栓形成的影响 |
| 3.2.3 蚓激酶对角叉菜胶大鼠凝血指标的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论与建议 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（9）蚓激酶转基因苜蓿（Medicago sativa）及丹参（Salvia miltiorrhizae）的构建及检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1 蚓激酶的研究进展 |
| 1.1 蚓激酶的分离纯化 |
| 1.1.1 蚓激酶分离纯化方法 |
| 1.1.2 蚓激酶的分离纯化的研究进展 |
| 1.2 蚓激酶的理化特性 |
| 1.3 蚓激酶的分子生物学特性 |
| 1.3.1 蚓激酶组分 |
| 1.3.2 蚓激酶的核苷酸编码序列及同源性比较 |
| 1.4 蚓激酶的纤溶特性的研究 |
| 1.4.1 对纤维蛋白原及纤溶酶原研究 |
| 1.4.2 底物特异性研究 |
| 1.4.3 酶抑制剂的研究 |
| 1.5 重组蚓激酶的表达 |
| 1.6 蚓激酶的应用 |
| 1.7 存在的问题 |
| 1.8 展望 |
| 2 植物生物反应器的研究进展 |
| 2.1 植物外源蛋白表达系统 |
| 2.1.1 稳定的遗传表达系统 |
| 2.1.2 植物病毒表达系统 |
| 2.1.3 植物叶绿体表达系统 |
| 2.1.4 油体表达系统 |
| 2.2 植物反应器的优点 |
| 2.2.1 植物反应器是一种高效、廉价的生产系统 |
| 2.2.2 具有真核生物的加工修饰功能 |
| 2.2.3 具有应用安全性 |
| 2.3 存在的问题 |
| 2.3.1 外源蛋白在植物中表达一直都存在表达量低的问题 |
| 2.3.2 适用于做转基因宿主的植物范围还很窄 |
| 2.3.3 复杂糖基化问题 |
| 2.3.4 植物生产的药用蛋白口服时易被胃蛋白酶降解 |
| 2.3.5 蛋白提取加工生产成本非常高 |
| 2.4 展望 |
| 3 苜蓿生物技术的研究进展 |
| 3.1 苜蓿的组织培养 |
| 3.1.1 品种基因型 |
| 3.1.2 外植体的类型 |
| 3.1.3 培养基的种类 |
| 3.1.4 激素的配比 |
| 3.2 苜蓿的遗传转化技术 |
| 3.2.1 农杆菌介导的遗传转化 |
| 3.2.2 基因枪法转化 |
| 3.2.3 电击法转化 |
| 3.3 苜蓿遗传转化的研究进展 |
| 3.3.1 转抗病虫害基因苜蓿的研究 |
| 3.3.2 苜蓿的品质改良 |
| 3.3.3 转抗逆基因苜蓿的研究 |
| 3.3.4 转抗除草剂基因苜蓿的研究 |
| 3.4 转基因苜蓿作为生物反应器的研究现状和应用前景 |
| 4 丹参生物技术的研究进展 |
| 4.1 丹参的离体培养 |
| 4.1.1 丹参的组织培养 |
| 4.1.2 丹参的细胞培养 |
| 4.1.3 人工诱导多倍体 |
| 4.2 丹参基因工程的研究进展 |
| 4.2.1 丹参次生代谢基因工程的研究 |
| 4.2.2 丹参抗病基因工程的研究 |
| 4.2.3 丹参抗逆基因工程的研究 |
| 4.2.4 其它丹参功能基因的研究 |
| 4.2.5 丹参作为植物反应器的研究 |
| 4.3 丹参生物技术的存在的问题与展望 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 苜蓿的遗传转化与转基因植株的检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 菌株和质粒 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 培养基 |
| 1.1.5 PCR引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 农杆菌介导的苜蓿转化 |
| 1.2.2 CTAB法提取苜蓿基因组DNA |
| 1.2.3 转基因植株的PCR检测 |
| 1.2.4 碱裂解法小量提取质粒DNA |
| 1.2.5 Southern分析 |
| 1.2.6 ELISA分析 |
| 1.2.7 蛋白纤溶活性的测定 |
| 1.2.8 TAME法测定转基因植株及蚓激酶肠溶胶囊中蚓激酶活性及标准曲线的绘制 |
| 1.2.9 转基因植株再生的Kan抗性检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 苜蓿转基因植株的获得 |
| 2.2 转基因植株的PCR检测 |
| 2.3 转基因植株的Southern检测 |
| 2.4 转基因植株表达蛋白的ELISA检测 |
| 2.5 蛋白纤溶活性的测定 |
| 2.6 TAME法测定转基因植株及蚓激酶肠溶胶囊中蚓激酶活性及标准曲线的绘制 |
| 2.7 转基因植株再生的Kan抗性检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 丹参的遗传转化与转基因植株的检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 菌株和质粒 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 培养基 |
| 1.1.5 PCR引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 农杆菌介导的丹参遗传转化 |
| 1.2.2 基因组DNA的提取 |
| 1.2.3 转基因植株的PCR检测 |
| 1.2.4 碱裂解法小量提取质粒DNA |
| 1.2.5 Southern分析 |
| 1.2.6 ELISA分析 |
| 1.2.7 蛋白纤溶活性的测定 |
| 1.2.8 TAME法测定转基因植株中蚓激酶表达活性 |
| 1.2.9 转基因植株再生的Kan抗性的检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 丹参转基因植株的获得 |
| 2.2 转基因植株的PCR检测 |
| 2.3 转基因植株的Southern检测 |
| 2.4 转基因植株表达蛋白的ELISA检测 |
| 2.5 蛋白纤溶活性的测定 |
| 2.6 TAME法测定转基因植株中蚓激酶活性 |
| 2.7 转基因植株再生的Kan抗性检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 结论 |
| 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）单环刺螠纤溶酶UFEⅠ的分离纯化和性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 血栓性疾病概述 |
| 1.1 血栓性疾病危害与类型 |
| 1.2 凝血和抗凝的基本原理 |
| 1.2.1 凝血系统 |
| 1.2.2 抗凝系统 |
| 1.2.3 纤溶系统 |
| 1.2.3-1 纤溶系统的组成 |
| 1.2.3-2 纤维蛋白降解过程及其调控 |
| 1.3 血栓性疾病的治疗 |
| 1.4 治疗血栓性疾病的药物 |
| 1.4.1 抗凝血药物 |
| 1.4.2 抗血小板药物 |
| 1.4.3 溶栓药 |
| 1.4.3-1 第一代溶栓药 |
| 1.4.3-2 第二代溶栓药 |
| 1.4.3-3 第三代溶栓药 |
| 1.4.4 现有溶栓药的作用途径 |
| 1.4.5 抗血栓的中草药 |
| 1.5 临床常用纤溶酶与具有临床应用前景的纤溶酶 |
| 1.5.1 动物来源纤溶酶 |
| 1.5.2 微生物来源纤溶酶 |
| 1.5.2-1 葡激酶(staphylokinase,SAK) |
| 1.5.2-2 纳豆激酶(nattokinase,NK) |
| 1.5.2-3 根霉(Rhizopus chinensis)12# |
| 1.6 海洋生物来源的心脑血管药物及活性物质 |
| 1.6.1 海洋生物多糖类及其衍生物 |
| 1.6.2 海洋生物中蛋白及糖蛋白类 |
| 2 海洋无脊椎动物单环刺螠研究 |
| 2.1 生态习性及环境 |
| 2.2 形态解剖 |
| 2.3 分类与进化 |
| 2.4 营养 |
| 2.5 生物活性物质 |
| 2.6 单环刺螠的潜在开发价值与未来展望 |
| 3 立论依据 |
| 3.1 选题依据与背景情况 |
| 3.2 课题研究的目的与意义 |
| 第二章 单环刺螠纤溶酶UFEI的筛选与分离纯化 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料、试剂与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 蛋白浓度测定: |
| 2.2.2 以酪蛋白为底物Folin-酚试剂法测定酶活力: |
| 2.2.2-1 Folin-酚试剂的制备: |
| 2.2.2-2 标准曲线的制备 |
| 2.2.3 酶的纤溶活性确定: |
| 2.2.4 统计学方法: |
| 2.3 纤溶酶的制备工艺 |
| 2.3.1 工艺A |
| 2.3.2 工艺B |
| 3 结果 |
| 3.1 酶粗品的制备 |
| 3.2 酶的分离纯化 |
| 3.3 酶UFEIa的分离纯化收率 |
| 3.4 酶的纤溶活性确定: |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 酶UFEIa的纯度鉴定和分子量测定 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试剂与主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 纤溶酶组分纯度的测定: |
| 2.2.2 SDS-PAGE电泳操作步骤: |
| 2.2.3 分子量测定: |
| 2.2.4 统计学方法: |
| 3 结果 |
| 3.1 单环刺螠纤溶酶的非变性和变性凝胶电泳 |
| 3.2 质谱图谱 |
| 3.3 电泳后酶区带活性的检验 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 单环刺螠纤溶酶的酶学性质研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试剂与主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 温度对酶反应的影响(琼脂糖纤维蛋白平板法) |
| 2.2.2 pH对酶反应的影响(琼脂糖纤维蛋白平板法) |
| 2.2.3 金属离子对酶反应的影响(酪蛋白为底物Folin-酚试剂法) |
| 2.2.4 底物浓度对酶反应速度的影响(以酪蛋白为底物Folin-酚试剂法) |
| 2.2.5 激酶活力测定 |
| 2.2.5-1 平板制作 |
| 2.2.5-2 溶液配制 |
| 2.2.5-3 蛋白水解酶活性测定 |
| 2.2.5-4 激酶活性测定 |
| 2.2.5-5 样品效价计算 |
| 2.2.6 酶蛋白的糖含量测定(王秀奇等,1999) |
| 2.2.7 统计学方法: |
| 3 结果 |
| 3.1 温度对酶反应的影响 |
| 3.2 pH对酶反应的影响 |
| 3.2.1 以琼脂糖纤维蛋白平板法测得不同pH条件下酶的稳定性 |
| 3.2.2 酶的最适反应pH: |
| 3.3 金属离子对酶反应的影响 |
| 3.4 底物浓度对酶反应速度的影响 |
| 3.5 酶的动力学常数 |
| 3.6 激酶活力测定结果 |
| 3.7 单环刺螠纤溶酶的糖含量 |
| 4 讨论 |
| ⅰ 单环刺螠纤溶酶作为溶栓剂的可能作用机制 |
| ⅱ 酶学性质的研究 |
| 5 小结 |
| 第五章 单环刺螠纤溶酶的体外抗凝和溶栓活性研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 蚓激酶的提取: |
| 2.2.2 单环刺螠纤溶酶抗凝活性检测 |
| 2.2.3 UFEIa和EFE体外溶栓比较研究 |
| 2.2.4 统计学方法: |
| 3 结果 |
| 3.1 酶的抗凝效果 |
| 3.2 酶对血红细胞形态和释放量的影响 |
| 3.3 两种酶不同浓度下水解血栓速度的比较 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、蚯蚓纤溶酶的分离纯化及其动力学性质研究（论文参考文献）
- [1]离子交换树脂有机物检测及其在应用过程中的迁移研究[D]. 朱贺文. 江南大学, 2021(01)
- [2]蚓激酶对胃癌SGC7901细胞增殖抑制和凋亡诱导作用[J]. 刘丹,杨晓波,王颖,于丽红,石焱,张英杰,康万军. 吉林大学学报(医学版), 2019(01)
- [3]磁性壳聚糖微球固定化蚯蚓纤溶酶及其性质研究[D]. 雷敬玲. 广西大学, 2015(05)
- [4]蚯蚓抗损伤有效成分对小鼠创伤愈合作用的研究[D]. 殷建建. 湖南农业大学, 2015(02)
- [5]固定化蚯蚓纤溶酶热稳定性及热失活动力学研究[J]. 雷敬玲,赵钟兴,王朝阳,朱长姐,冯丽锦,卢强基. 食品工业科技, 2015(21)
- [6]蚯蚓生物工程技术研究进展[J]. 董启钧. 黑龙江科技信息, 2014(16)
- [7]蚓激酶的分离纯化、酶学性质及体外模拟消化的研究[D]. 谢德芳. 武汉轻工大学, 2013(04)
- [8]蚓激酶的提取纯化、酶学性质及抗血栓效果研究[D]. 周海. 武汉工业学院, 2010(03)
- [9]蚓激酶转基因苜蓿（Medicago sativa）及丹参（Salvia miltiorrhizae）的构建及检测[D]. 田鹏. 中国农业科学院, 2009(10)
- [10]单环刺螠纤溶酶UFEⅠ的分离纯化和性质研究[D]. 郭金明. 中国海洋大学, 2008(03)