一、冻存复苏人卵巢皮质在裸鼠体内的发育及卵细胞的提取（论文文献综述）
贾琪[1]（2017）在《牛卵巢组织窦前卵泡的冻存方法及不同培养体系对始基卵泡活性的影响》文中研究表明随着癌症早期诊疗水平的提高以及放化疗技术的进步,年轻女性癌症患者的生存率显着增加。但放化疗可能造成女性生育能力的下降甚至丧失,故在放化疗前保存生育能力的问题变得尤为重要。卵巢组织冷冻保存并移植已经被认为是保存生育能力的有效方法,然而有研究表明移植冻融的卵巢组织有可能将原肿瘤灶重新移入体内,因此体外培养或移植窦前卵泡可能是更安全的选择,然而在卵巢组织冷冻复苏后,分离出窦前卵泡前需确定冷冻对窦前卵泡活性的影响,以及选择有活性的窦前卵泡进行移植或体外培养。始基卵泡是卵巢组织内最丰富的卵泡,其仅有一小部分通过卵泡发育途径被激活,而大部分都闭锁,当始基卵泡池内始基卵泡的个数少于1000个时,绝经将随之而来,因此始基卵泡是女性生育能力保存的关键,因此,若能在体外成功的培养始基卵泡,对女性生育能力的保存有着重大的意义。目前国内外有多项研究致力于比较程序化冷冻法和玻璃化冷冻法冷冻卵巢组织的效果,但所得结果尚无定论。此外,目前国内尚无研究报道体外培养始基卵泡的最佳条件。本研究第一部分探讨两种冷冻方法对卵巢组织内窦前卵泡的活性影响,从而为体外培养以及移植窦前卵泡奠定基础。第二部分在体外用二维培养体系和藻酸钠凝胶三维培养体系培养冻融后单个始基卵泡,探讨始基卵泡在体外培养所需的最适的生长环境。目的探讨玻璃化冷冻法和程序化冷冻法对牛卵巢组织内窦前卵泡活性的影响,以及体外三维培养冻融的始基卵泡的最适藻酸盐浓度。材料与方法1、实验材料:取新鲜的牛卵巢组织,将卵巢组织皮质剪成大小约为0.5㎝×0.8㎝×0.3㎝的组织块。2、实验方法:（1）将卵巢皮质片随机分为新鲜对照组、程序化冷冻组、玻璃化冷冻组,每组各10片,后两组分别应用其相应的方法冷冻卵巢组织并复苏,三组均随机挑出3-4片卵巢组织用4%多聚甲醛固定,进行组织形态学分析。将三组余卵巢组织分别剪碎,加入Liberase DH酶消化,消化终止后随机挑取窦前卵泡,并记数,然后进行荧光染色,鉴定卵泡的活性。（2）玻璃化冷冻卵巢组织,解冻后分离出始基卵泡,将其置于二维培养系统（对照组）和浓度分别为0.5%,1%,2%藻酸钠凝胶中培养8天,每隔一天在显微镜下观察卵泡的生长情况,测量卵泡的直径并半量换液,将收集的培养液保存于-20℃的冰箱,并采用电化学发光免疫分析法（ECLIA）测定卵泡分泌的雌二醇（E2）的水平,并在培养8d后进行荧光染色,鉴定卵泡的活性。3、统计学方法:用SPSS21.0软件进行统计学分析,计数资料采用卡方检验,其他实验数据以均数±标准差（sx?）表示,采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果1、三组用组织学分析和用酶解法分离出的单个卵泡的结果均显示,卵巢组织内不同类型的窦前卵泡的数量分布的差异无统计学意义（P>0.05）,其中以始基卵泡为主,其次为初级卵泡,次级卵泡所占比例最少,未见窦状卵泡。2、荧光染色后,程序化冷冻组和玻璃化冷冻组的窦前卵泡中未受损的卵泡（V1）低于新鲜对照组,轻微受损卵泡和中度受损卵泡（V2+V3）及死亡卵泡（V4）均高于新鲜对照组,差异有统计学意义（P<0.05）,两冷冻组中的未受损的卵泡（V1）数量相比差异无统计学意义（P>0.05）。3、荧光染色后,在未受损的卵泡中,三组始基卵泡的差异无统计学意义（P>0.05）,程序化冷冻组初级卵泡低于新鲜组,差异有统计学意义（P<0.05）,而玻璃化冷冻组的初级卵泡较新鲜组无统计学差异,由于分离出次级卵泡所占比例低,故未行统计学分析,玻璃化冷冻与程序化冷冻组中未受损的初级卵泡相比,其差异无统计学意义（P>0.05）。4、体外培养始基卵泡8d后,发现卵泡在二维培养环境中难以存活,藻酸钠三维培养系统更适合体外培养始基卵泡。5、在浓度为0.5%,1%,2%的藻酸盐凝胶分别培养始基卵泡8天后发现,卵泡的直径均有不同程度的增加,其中在2%的藻酸钠凝胶组中直径增加最多（P<0.05）,荧光染色后,2%的藻酸钠凝胶组的未受损卵泡率较其他两组高,与0.5%藻酸钠凝胶组相比,差异有统计意义（P<0.05）,而与1%藻酸钠凝胶组相比无统计学差异（P>0.05）。检测三组浓度不同的藻酸钠凝胶组中E2的水平发现,E2随着培养时间的延长分泌增多,同时也符合各组卵泡的增长趋势,2%的藻酸钠凝胶组中分泌的最多,与0.5%藻酸钠组比,其差异有统计学意义（P<0.05）,而与浓度为1%的藻酸钠组相比,其差异无统计学意义。结论1、冷冻解冻过程对卵巢组织有一定的损伤,一部分初级卵泡和次级卵泡受损,但是对始基卵泡的活性影响较小。2、玻璃化冷冻法和程序化冷冻法均能较好的保存卵巢组织内窦前卵泡的活性。3、藻酸钠三维培养系统较二维培养系统更适合始基卵泡的生长。4、浓度为2%的藻酸钠凝胶较低浓度的藻酸钠凝胶更适合始基卵泡的生长发育。
张红[2]（2016）在《卵巢组织冷冻保存及其应用》文中研究说明自从人类精子库建立后,现又在探求建立卵子库。近年,科学家们试图通过卵巢组织冷冻法建立人类卵巢组织库,为女性提供生殖保险。目前,卵巢组织的冻存已成为人类生殖工程研究领域的热点之一,主要研究方向是卵巢组织冷冻的方法及其冷冻后的使用,通过与新鲜标本的对比,作出评估。现对国外近年有关卵巢组织冷冻保存的研究状况作一综述。
王兴玲[3]（2013）在《家兔和人卵巢组织冷冻复苏及异种移植的实验研究》文中指出近年来,随着社会的发展,生活水平的提高,人们对自身健康及生殖质量日益关注,对生殖能力的保存提出了越来越高的要求,由此极大地促进了学者们对人类卵巢组织冻存技术的研究和临床应用的探索。2008年,WHO调查发现140万例新增肿瘤患者中近70万是女性,<40岁育龄妇女占8%。放、化疗及手术等治疗有效地治疗了患者的疾病并延长了生命,但大剂量放疗、化疗和卵巢手术可导致年轻女性生殖力的丧失。保存女性生殖能力的方法有：取卵并行体外受精后胚胎冷冻、取卵后卵子冷冻、卵巢组织冷冻。因胚胎冷冻及卵子冷冻需要进行促排卵、取卵等较长周期的治疗,影响和延误恶性肿瘤患者的治疗,且只适用于已婚女性,因此应用受到限制。而卵巢组织冷冻保存不需要对卵巢进行药物刺激促排卵,在手术及化疗前直接切除卵巢组织进行冷冻,不影响患者自身原有恶性肿瘤及疾病的化疗及放疗,对女性生育储备的生殖内分泌功能保存有着重要的意义,为此类患者提供了一种补偿方法。20世纪50年代初,Parkes将大鼠卵巢组织切片慢速冷冻保存于-79℃的甘油盐水混合液中,快速解冻复苏后自体移植,之后观察到移植的卵巢组织出现卵泡生长发育,大鼠恢复了内分泌功能。20世纪90年代,卵巢组织冷冻随着冷冻科学技术的发展和改进以及各种抗冻剂的出现,发展非常迅速,不断有小鼠、绵羊和非人类哺乳类动物卵巢组织冷冻实验研究报道,并有冻融卵巢组织移植成功的案例。绵羊与人类卵巢无论是卵巢组织结构及排卵周期均较为相似,因此绵羊卵巢组织冻融并移植后获得成功的妊娠,为人类卵巢组织冻融技术的发展和应用提供了有意义的模型,并奠定了坚实的实验基础。Donnez J在腹腔镜下对一例何杰金氏患者自体原位移植了冻存6年的卵巢组织,随访发现该患者术后半年就恢复了月‘经周期,并有周期性排卵及黄体生成,术后11个月HCG测定和B超证实患者成功妊娠,并顺利分娩。我国开展卵巢组织冷冻技术还处于摸索阶段,陈子江等研究冷冻人卵巢皮质,观察卵巢皮质内各级卵泡形态及卵巢组织体外培养获得了一定的经验。卵巢组织冷冻保存的优势在于其可冷冻卵巢皮质原位未成熟的始基卵泡,因其具有相对静止、体积小、缺乏透明带及皮质颗粒的特性,容易耐受冷冻及复苏造成的损伤,成功的卵巢组织冷冻和复苏,可保存卵巢组织中大量结构完整、具有生存活力及发育能力的原始卵泡,从而开辟了一条卵巢早衰和恶性肿瘤患者的治疗新途径。有效的卵巢冷冻保存及复苏技术是建立卵子库的基本前提,复苏后卵巢组织的成功移植对女性生育力的保存及恢复具有重要意义。为了拯救面临威胁和濒危动物,保存基因多样性,世界各地基因组储存中心正在收集和冷冻来自这些动物的卵巢组织。卵巢冷冻保存及复苏还存在许多有待解决的问题,虽然在鼠类和大型灵长类动物中卵巢组织冷冻保存技术已有后代出生并获得了阶段性的研究成果,但用于人类卵巢组织的冷冻保存及复苏移植技术还存在许多问题,难以充分有效地的运用于临床,其关键难点包括确立最适宜的卵巢组织冷冻保存方案,因为冷冻过程中各个环节均有许多因素会影响卵巢组织的冻融效果,如组织切块的大小,所选择的冷冻方法、冷冻保护剂的种类及浓度、冷冻和复苏过程、操作人员的技术水平、硬件设备条件等,目前尚无定论的减少冷冻损伤的最佳冷冻方案。卵巢组织复苏移植后的成活情况是决定生殖能力能否恢复的关键。影响移植成功的因素有很多,首先是移植后局部灌注损伤：Aubard等学者在羊卵巢组织自体移植模型实验中发现,只有5%的原始卵泡在移植后能够存活,分析原因可能是移植后的卵巢未行血管吻合,自身无血供,而移植局部的血管再生至少需要48小时,在此期间由于血供不足可能对卵巢造成了不可逆的损伤,如何保护移植组织不受缺血缺氧损害是卵巢组织冻融后移植亟待解决的一个问题；其次是最适宜移植部位的确立：迄今为止,国内外研究尚无最适宜卵巢组织移植的最佳部位定论,但能确认的是最适宜的移植部位必须具备能为组织的植入和成活发育提供良好条件、并且方便卵泡的检测和穿刺取卵的部位；最后是卵巢组织同种自体移植后的安全性问题的解决：卵巢组织的冷冻和移植的不断进步,为癌症患者恢复其自身卵巢功能和保存生育能力带来了新的希望。但卵巢组织移植仍然存在着一定的风险。冻融卵巢组织同种移植多数是为了对恶性肿瘤患者的生育能力进行保存,因此有学者质疑,移植恶性肿瘤患者的冷冻卵巢组织中是否存在微小癌灶,从而导致移植后肿瘤细胞发生播散或者再复发。MuellerA等实验研究发现大鼠卵巢经同种异位移植后,发生性索间质瘤的几率达100%。关于移植组织安全性的监测,Dror等研究表明采用RT-PCR（?）邕够敏感的检测到癌症患者卵巢组织内残存的微小病灶,从而提高移植的安全性。因此,在决定移植前,采用先进的检测手段如聚合酶链反应(PCR、FISH、基因芯片等技术,检测移植卵巢组织内残存的微小病灶,以降低卵巢移植所带来的肿瘤细胞转移风险,有利于提高卵巢组织移植的有效性和安全性。关于卵巢组织冷冻、复苏、移植研究所采用的标本,人类卵巢组织冻存研究标本大多来自于因卵巢疾患而需要进行妇科手术的病人,由于她们年龄一般都比较大,卵巢中某些区域整群卵泡已经耗尽,同时合并有子宫内膜异位囊肿等卵巢病变,所以很难获得足够数量的卵泡标本,而且人类卵巢组织的冷冻、复苏、移植涉及诸多伦理问题,所以实验标本的获得非常珍贵而有限,实验数据不够充沛。有研究显示种属间卵巢原始卵泡没有明显差异,本实验前期选择家兔卵巢组织来进行研究,是由于其低廉的价格,广阔的来源,较短的繁殖周期,且人类与家兔卵巢始基卵泡中卵母细胞的大小及进入减数分裂的卵母细胞微细结构基本相似。在前期家兔卵巢冻存研究基础上,我们又对来自卵巢手术剥离的人类卵巢组织标本进行了冷冻、复苏和移植的研究。本研究分四个部分,即家兔卵巢组织冷冻复苏的实验研究、家兔卵巢组织异种异位移植的实验研究、人卵巢组织冷冻复苏的实验研究、人卵巢组织异种异位移植的实验研究四个阶段。通过采用不同冷冻程序（慢速程序化法、快速玻璃化法）、不同冷冻载体（麦管法、微滴法、坚硬表面法）、不同冷冻试剂及配伍方法（二甲基亚砜DMSO、乙二醇EG、丙二醇PROH）等分别对家兔及人卵巢组织进行了冷冻、复苏、体外培养、异体移植的系统研究,以期寻找适宜的卵巢组织冷冻复苏方案及移植部位,为临床开展人类卵巢组织冷冻及移植提供实验数据参考,为建立卵巢组织冷冻库奠定基础。第一部分：家兔卵巢组织冷冻复苏的实验研究研究目的采用不同冷冻保护剂（PROH、DMSO及EG）单独或联合应用于程序化或玻璃化法对家兔卵巢组织进行冷冻并复苏,观察复苏后卵巢组织中各级卵泡形态、卵巢组织Ⅱ型跨膜酪氨酸激酶受体（c-kit）和增殖细胞核抗原（ki67）以及主要组织相容性复合体类抗原（MHC-2）表达的变化,从而判断各种冷冻方案对家兔卵巢组织形态学、细胞增殖活性、卵巢组织抗原性的影响,以探讨相对适用于卵巢组织的冷冻复苏方案。研究方法及结果1四种不同冷冻复苏方法对家兔卵巢组织形态学的影响1.1研究对象及分组：选择清洁级性成熟雌性日本大耳白兔12只,随机分为四组,麻醉后开腹取其卵巢组织并切成lxlxlmm3块,按随机方法分组将家兔卵巢组织块分别进行慢速程序化（分A2及B2两个亚组,冷冻剂分别采用PROH、 DMSO）及快速玻璃化（分C2及D2两个亚组,冷冻剂分别采用DMSO+PROH、 DMSO+EG）冷冻并复苏；冷冻前每组各取少量新鲜卵巢组织块做为对照组（A1、B1、C1、D1）。1.2研究内容：通过卵巢组织学检测,观察新鲜对照组及各冷冻复苏组卵巢组织内各级卵泡比例、形态结构及正常形态率等变化。1.3研究结果1.3.1新鲜及冷冻复苏家兔卵巢组织形态学特点：来自各组家兔的新鲜卵巢组织切片中,显微镜下共计数各级卵泡1236枚,其中始基卵泡所占比率（88.2%）及其正常形态率（91.4%）均最高,初级卵泡及次级卵泡比率分别为8.4%和3.4%；计数来自三组冷冻复苏卵巢组织切片中的卵泡共954枚,其中始其卵泡857枚,占89.8%,初级卵泡占7.3%,次级卵泡仅占2.8%。1.3.2采用不同冷冻程序和冷冻剂处理后家兔卵巢组织各级卵泡形态学的变化：冷冻组中,以PROH慢速程序化冷冻组始基卵泡的形态正常率最高,达80.1%,明显高于DMSO程序化组（70.5%）及两组玻璃化组（DMSO+PROH及DMSO+EG组分别为67.6%,69.7%）,差异有统计学意义；将各冷冻组所观察到的各级卵泡合并计算,其中始基卵泡形态正常率（72.7%）,明显高于初级卵泡的形态正常率（55.7%）,因次级卵泡总数极少,所以未行统计学分析。1.3.3冷冻复苏前后家兔卵巢组织结构变化：镜下观察冷冻前家兔卵巢组织内可见排裂规则的卵巢间质细胞紧密包裹的各级卵泡。所有冷冻复苏组卵巢组织均可见以初级卵泡和次级卵泡为主的受损情况,这些卵泡与周围间质细胞分离,但始基卵泡受影响较小；各冷冻组卵巢间质细胞排裂紊乱、连接疏松,形成裂隙。2程序化及玻璃化冷冻对家兔卵巢抗原性及卵泡细胞增殖活性的影响2.1研究对象及分组：选择9只4-5月龄清洁级性成熟雌性日本大耳白兔,随机分为3组（新鲜对照组、PROH慢速程序化冷冻组、DMSO+EG’决速玻璃化冷冻组）,获取卵巢组织方法如前所述,切块待用。2.2研究内容2.2.1家兔卵巢组织相容性抗原（MHC-2）的表达：应用SP免疫组化法检测上述新鲜组及经两种冷冻方法处理后家兔卵巢组织MHC-2抗原表达的变化,通过观察MHC-2抗原的平均吸光度值,判断冷冻对卵巢组织抗原性的影响。2.2.2冷冻复苏对各级卵泡细胞增殖活性的影响：分离新鲜对照组及冷冻复苏组卵巢组织内大、小卵泡（直径分别为100-150μm及300-500μm）,对其进行体外培养后,采用3H标记的胸腺嘧啶核苷掺入试验（3H-TdR）,移入液闪瓶中上机测其脉冲信号数（cpm）,判断冷冻复苏对各级卵泡细胞增殖活性的影响。2.3研究结果2.3.1PROH程序化与DMSO+EG玻璃化冷冻法对家兔卵巢MHC-2表达的影响：免疫组化结果显示MHC-2主要表达于卵巢间质细胞和次级卵泡卵母细胞的胞膜,而始基卵泡及初级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞均无表达；玻璃化冷冻组较程序化组和新鲜对照组卵巢组织MHC-2抗原的平均吸光度值明显降低；程序化组与新鲜对照组平均吸光度值无明显差异。2.3.2PROH程序化与DMSO+EG玻璃化冷冻法对家兔卵泡细胞增殖活性的影响：通过3H-TdR掺入试验检测各组卵泡细胞增殖活性发现,程序化及玻璃化冷冻组与新鲜卵巢组小卵泡的cpm值差异无统计学意义,而冷冻组大卵泡的cpm值明显降低；两冷冻组间差异无统计学意义。3.不同玻璃化冷冻载体对家兔卵巢组织c-kit和W67表达的影响3.1研究对象及分组：选择12只4-5月龄清洁级性成熟雌性日本大耳白兔,按是否冷冻及玻璃化冷冻所选择的载体不同随机分为4组：新鲜对照组（A组）、麦管法玻璃化冷冻组（B组）、微滴法玻璃化冷冻组（C组）、坚硬表面法（SSV）玻璃化冷冻组（D组）。玻璃化冷冻试剂采用EG+DMSO;获取家兔卵巢组织方法如前所述,将卵巢组织切块待用。3.2研究内容：通过对冻融卵巢组织的组织学观察,并采用免疫组化法检测冻融卵巢组织Ⅱ型跨膜酪氨酸激酶受体（c-kit）和增殖细胞核抗原（Ki67）表达,判断冷冻对卵巢组织增殖活性及发育潜能的影响。3.3研究结果：采用免疫组化检测家兔新鲜及冻融卵巢组织,结果显示各级卵泡内卵母细胞的胞膜和/或胞浆中ki67蛋白均出现呈棕黄或棕褐色的阳性表达；与新鲜组相比较,经麦管法、微滴法、SSV法冷冻处理后Ki67和c-kit阳性率表达率差异无统计学意义。结论1. PROH慢速程序化冷冻方法用于家兔卵巢组织冷冻获得了较高的始基卵泡正常形态率及细胞增殖活性,可能是一种较好的冷冻方法。2.玻璃化方法虽使始基卵泡形态正常率降低,但也能使始基及初级卵泡卵母细胞保持良好的增殖活性,并可降低家兔卵巢组织抗原性,可能会减轻复苏后卵巢组织移植的免疫排斥,加之该技术操作简便,费用低廉,可能会有良好的应用前景。3.程序化冷冻及玻璃化冷冻对形态结构完整的小卵泡细胞增殖活力影响不明显,而大卵泡增殖活性明显下降。第二部分：家兔卵巢组织异体异位移植的实验研究研究目的在前期研究基础上,选择低浓度配伍比的DMSO+EG做为冷冻保护剂,玻璃化冷冻家兔卵巢组织,将新鲜及冷冻复苏后卵巢组织块分别移植于去势裸鼠颈部皮下,观察接受移植后裸鼠动情周期、激素分泌、子宫形态变化及移植物变化,以评价冷冻效果。研究方法1研究对象及分组选择清洁级性成熟雌性日本大耳白兔4只,取其卵巢组织处理后切块,分三组用于新鲜组织观察、新鲜移植、冷冻复苏移植；移植宿主采用8-10周龄的SPF级性成熟雌性Nu/Nu裸鼠36只,分4组（每组9只）,除正常对照组外,其余三组均切除双侧卵巢去势,之后分别用于新鲜组织移植、冻融组织移植及去势对照组。2研究方法2.1卵巢组织冷冻复苏方法：采用低浓度比二甲基亚砜（DMSO）+乙二醇（EG）作为冷冻保护液,通过坚硬表面铜块（SSV）法对卵巢组织进行玻璃化冷冻后快速复苏。2.2卵巢组织移植：麻醉裸鼠后,消毒并切开裸鼠左侧颈部皮肤,眼科镊分别夹取新鲜或冻融家兔卵巢组织多点移植于颈部皮下,缝合并标记移植部位。2.3家兔卵巢组织冷冻复苏后移植的效果评价2.3.1裸鼠阴道脱落细胞学观察：每天观察各组裸鼠阴道涂片上皮细胞变化以判断裸鼠动情周期恢复及持续时间。2.3.2裸鼠血中雌激素测定：全部正常对照组及部分移植组裸鼠有动情周期出现；去势未移植组无动情周期。分别测定对照组、去势组及移植后出现动情周期的裸鼠血清雌激素（E2）水平,判定卵巢功能情况。2.3.3裸鼠子宫形态学观察及移植物观察：移植35天后,切除各组裸鼠完整的子宫,分别于肉眼及镜下观察其形态学变化；切开新鲜及冷冻卵巢移植组裸鼠颈部皮肤,取出移植物,进行组织学观察。研究结果1裸鼠动情周期情况正常对照组裸鼠全部有规律的动情周期；新鲜移植组9个裸鼠中7个出现动情周期,冷冻移植组9个中6个出现动情周期,两移植组裸鼠恢复动情周期天数无差异,正常及移植组动情周期持续天数无差异。2裸鼠血中雌激素水平测定测定全部出现动情周期的裸鼠和去势裸鼠血中E2水平,两移植组恢复动情周期的裸鼠血中E2水平与正常对照组无明显差异,均明显高于去势组。3裸鼠子宫形态学观察去势组裸鼠子宫明显有别于有动情周期的裸鼠子宫,呈萎缩、苍白状,内膜薄,腺体少,表面被覆立方或者单层扁平上皮细胞；而正常对照及移植组裸鼠子宫色泽红润而有弹性,形态饱满,内膜厚且腺体粗大、量多,腺细胞胞浆丰富,内膜表面被覆单层高柱状或假复层上皮细胞。4卵巢组织移植物形态学观察取出裸鼠颈部皮下移植物进行观察,新鲜移植组与冷冻移植组移植物肉眼可见大部分长成淡黄色圆形或椭圆体,体积增大明显,移植物柔软,部分移植组织块表面出现凹凸不平的串珠状突起。存活的移植物镜下可见毛细血管生成,皮质内可见到各级卵泡及闭锁卵泡。结论采用低浓度DMSO+EG玻璃化冷冻法能够较好地保存卵巢组织的结构和功能,新鲜及冻融后的家兔卵巢组织裸鼠异种异位移植后能够存活,并具有内分泌功能。第三部分：人卵巢组织冷冻复苏的实验研究研究目的以不同浓度配伍的DMSO+EG做为玻璃化冷冻保护剂,分别以麦管法、微滴法及SSV法对人卵巢组织进行玻璃化冷冻,通过观察冷冻前后人卵巢组织中卵泡形态学变化、细胞凋亡率检测及复苏后卵巢组织体外培养上清液E2测定,评价不同冷冻复苏方案的效果。研究方法1研究对象2008.7-12月共收集20例因卵巢疾病而行腹腔镜手术的患者剥离的卵巢囊肿壁上残留组织,利用患者手术切除的废弃组织进行研究,该研究通过伦理委员会审核,并经患者知情同意。将收集到的卵巢组织切成约lxlxlmm3的组织块待用。2研究内容2.1卵巢组织冷冻及复苏：通过采用不同浓度的DMSO和EG制备两组玻璃化试剂（低浓度Ⅰ组,高浓度Ⅱ组）。将卵巢组织块分别在平衡液中和两种玻璃化冷冻液中浸泡暴露一定的时间后,再分别将卵巢组织块通过微滴法、麦管法和SSV法进行玻璃化冷冻,快速复温后进行组织学检查及体外培养。2.2复苏后人卵巢组织体外培养：定期收集组织培养上清液进行E2测定,14d后捞出卵巢组织块,固定染色行组织学检测。2.3人卵巢组织冷冻复苏效果判断：2.3.1冷冻前后卵巢组织中卵泡形态学分析：在卵巢组织块冷冻前后和体外培养14d后,观察各组卵巢组织结构及卵泡形态变化,计数正常形态和异常改变的卵泡比率,检测卵巢皮质内卵泡密度与分布以及各级卵泡的比例变化。2.3.2冻融卵巢组织各种细胞凋亡情况：采用DNA断裂原位末端标记法检测（Tunel）试剂盒,从DNA水平上检测冻融后卵巢组织内各种细胞凋亡情况。2.3.3卵巢组织体外培养上清液中雌二醇的检测：每48小时采集卵巢组织体外培养上清液,离心后保存在-80℃的冰箱中,以RIA法测定上清液中E2水平。结果1冷冻前后人卵巢组织中卵泡形态及各级卵泡比例变化DMSO+EG高浓度配伍Ⅱ组原始卵泡正常形态率（43.7%）较新鲜对照组（75.5%）及低浓度Ⅰ组（69.4%）明显下降,三组间各级卵泡所占比例无明显差异,均以始基卵泡比例最高。2冷冻复苏后人卵巢组织结构形态学变化新鲜人卵巢组织间质细胞排裂致密而规则,卵巢皮质中间质细胞紧密包裹各级卵泡。经两种不同配伍比例的玻璃化冷冻液处理并分别采用三种载体冷冻保存的人卵巢组织复苏后对始基卵泡影响不明显,但可见卵巢组织内部分间质细胞排列紊乱,疏松甚至出现分离。3人卵巢组织各类细胞冷冻复苏后凋亡情况冻融后人卵巢组织中各级卵泡中都没有出现阳性表达的棕色或棕褐色凋亡细胞；而卵巢组织内间质细胞的细胞核内发现有凋亡细胞。经单因素方差分析,玻璃化冷冻各组卵巢组织内间质细胞凋亡率与新鲜对照组相比,差异无统计学意义。4各冷冻组复苏后卵巢组织体外培养液中E2的变化低浓度配伍Ⅰ组各载体组卵巢组织培养液中E2的分泌水平均高于高浓度配伍组Ⅱ各载体组,其中SSV法载体间差异更显着,而各冷冻组内载体间差异无统计学意义。结论1.人卵巢组织内始基卵泡对冷冻损伤的耐受性高于初级卵泡。2.低浓度的冷冻保护剂配合SSV法玻璃化冷冻方案对保存人卵巢组织的效果较佳。第四部分：人卵巢组织异种异位移植的实验研究研究目的在前期研究基础上,采用低浓度比DMSO+EG做为冷冻保护剂,通过SSV法对人卵巢组织进行玻璃化冷冻复苏,并将人卵巢复苏组织块多点移植至去势裸鼠颈部皮下,观察接受移植的裸鼠阴道脱落细胞学、血E2分泌及子宫形态学变化,以判断冷冻效果。研究方法1研究对象及分组2009.11～2010.3,收集20例因卵巢疾病而行腹腔镜手术的患者剥离的卵巢囊肿壁上残留组织,利用患者手术切除的废弃组织进行冷冻复苏及异体移植研究,并在短期内处死移植裸鼠进行观察,对冷冻及移植效果进行评价,未对患者造成任何伤害,该研究通过伦理委员会审核,并经患者知情同意。将收集到的卵巢组织切成约1×1×1mm3的小块待用。移植宿主采用健康性成熟Nu/Nu裸鼠,按是否移植分为四组（正常对照组、新鲜移植组、冻存移植组、去势组）,后三组裸鼠切除双侧卵巢去势。2研究内容2.1冷冻及复苏：采用低浓度比DMSO+EG通过SSV法对卵巢组织进行玻璃化冷冻,快速复温法进行复苏。2.2卵巢组织移植方法：分别将新鲜及冻融复苏后人卵巢组织多点移植于相应组别裸鼠左侧颈部皮下。2.3观察指标：2.3.1裸鼠阴道脱落细胞学观察：移植术后第5天起每日对裸鼠阴道细胞学检测观察动情周期。2.3.2裸鼠血雌激素水平测定：分别于动情期采集移植组裸鼠血测定血清E2水平,判定卵巢功能情况；去势裸鼠于处死前采血检测。2.3.3裸鼠子宫形态观察及移植物收集：甲醛固定切除的各组裸鼠子宫,切片染色后于光镜下观察子宫内膜腺体和间质的形态；切开移植组裸鼠颈部移植部位寻找卵巢组织移植物。结果1移植后裸鼠动情周期恢复情况正常对照组阴道细胞呈持续规律的动情周期性变化,新鲜移植组中4/9裸鼠恢复动情周期,冷冻移植组3/9裸鼠恢复动情周期；去势组阴道有核上皮细胞和角化细胞逐渐消失,白细胞大量增加,脱落细胞未见周期性变化。新鲜移植组裸鼠首次恢复动情周期时间[（19.0±1.6）d]稍早于冷冻移植裸鼠[（22.3±1.2）d],但两组动情周期持续天数[（5.0±0.8）、（5.8±1.2）d]与正常对照组[（4.8±0.7）d]比较,差异无显着性意义。2移植组裸鼠子宫形态学变化移植组小鼠子宫增粗红润,弹性好,与正常对照组相似。移植组与正常组裸鼠子宫湿重明显重于去势对照组。光镜下观察,正常对照组及移植组裸鼠子宫内膜间质疏松,内膜腺体粗大、量多,腺细胞呈高柱状,胞浆丰富,有假复层上皮细胞。与之相反,去势组裸鼠子宫变细变薄,外观苍白,内膜萎缩变薄,间质致密,腺体数量少,腺腔较小,腺细胞呈静止期表现。恢复动情周期的移植组裸鼠虽有动情周期出现并有与正常对照组相近的E2分泌水平,但颈部移植部位却未寻找到明显移植物。3裸鼠血清平均E2水平新鲜与冷冻移植组有动情周期的裸鼠血清平均E2水平与正常对照组无明显差异,均显着高于去势裸鼠组。结论1.采用低浓度比DMSO+EG冷冻剂SSV法玻璃化冷冻人卵巢组织,复苏后行异体异位移植可获得与新鲜卵巢组织移植相同的效果。2.人卵巢组织异体异位裸鼠颈部皮下无血管吻合移植能够存活并恢复裸鼠动情周期及内分泌功能。
彭南妮,袁安文,邹红艳,吴方贵,许学岚,薛立群[4]（2011）在《卵巢移植国内研究进展》文中指出实验证明新鲜或冻存卵巢移植可恢复缺失或早衰病人的内分泌和生殖功能,近年来卵巢移植技术的研究已成为国外生殖生物学和生殖医学领域的研究热点,国内也开展了许多相关研究工作.本文就国内卵巢移植的研究进展作一综述.
李园园[5]（2010）在《环境化学物质VCD致卵巢早衰动物模型的构建》文中研究说明研究背景卵巢早衰病因和机理比较复杂,尚没有合理有效的治疗方法。卵巢早衰可严重影响患者的生活质量,而且直接促进某些严重疾病的发生,如卵巢早衰导致年轻妇女不育、提前闭经等一系列内分泌变化,增加心血管疾病的发生率,导致骨质疏松。因此,进一步探讨卵巢早衰（POF）的病因学及寻求有效的治疗方法是解决这个疾病的关键。鉴于POF人体研究的可行性低,建立与人类相似的生殖内分泌和组织学变化的POF模型对于POF发病机制的研究和进一步治疗具有重要价值。女性生来具有有限的原始卵泡池,生后不可再生。绝大多数原始卵泡将走向闭锁,只有不到1%的卵泡发育成熟并排卵。因此,暴露于原始卵泡毒性的化学物质中的女性生育能力就会受到损害,也可能使女性提早绝经。有研究发现环境物质能破坏卵泡中的卵母细胞进而影响卵巢功能,由于人们接触到越来越多的环境化学物质制品,职业暴露可能增加不孕及卵巢早衰的危险。因此环境物质对卵巢毒性的影响越来越受到关注。VCD（4-vinylcyclohexene diepoxide）是VCH（4-vinylcyclohexene）的主要代谢产物之一,VCH产生于生产橡胶轮胎、阻燃剂、杀虫剂、可塑剂及抗氧化剂等的过程中,研究发现VCH和VCD能选择性破坏雌鼠和短尾猴卵巢内的原始卵泡和初级卵泡,最终引起雌鼠卵巢早衰,而VCD是VCH卵巢毒性的主要活性形式。因此本研究选择VCD构建POF动物模型,通过观察阴道涂片及不同时间段卵巢组织学变化等判断造模效果,旨在观察卵巢逐步衰竭的过程及探讨该动物模型的成功率,和是否是能模拟生理性的卵巢早衰,为卵巢早衰的病因和治疗提供研究方法和实验依据。研究目的1.建立环境化学物质VCD致卵巢早衰小鼠模型。2.观察VCD作用下小鼠卵巢功能变化的相关指标。3.观察VCD用药后卵巢功能逐步衰竭的过程。4.提高人们对环境因素的关注。研究内容和方法1.研究对象：雌性昆明小鼠60只,28天龄,体重90±10 g,购自山东大学动物实验中心,温度控制在22±2℃,相对湿度为50%-60%,自由饮食,每天光照时间为12h。2.研究方法：2.1实验方案将60只小鼠随机分为VCD组、佐剂对照组、正常对照组和去势组四组,VCD组和芝麻油组分别每天腹腔注射同等量的VCD和芝麻油5ml／kg,注药2周后每天观察小鼠阴道涂片,观察小鼠动情周期变化。分别于注药后不同时间取卵巢和子宫组织做组织学检查,同时计数各级卵泡数目,观察小鼠子宫和卵巢的形态及组织学变化。2.2分组与用药将实验动物随机分为4组：A组：即VCD用药组20只,每天腹腔注射VCD160mg／kg,即5ml／kgVCD溶液（VCD溶于芝麻油中）,连续注射15天；B组：佐剂对照组即芝麻油组16只,每天注射同等剂量芝麻油5ml／kg,连续注射15天；C组：即正常对照组20只,不做任何处理；D组：即去势组4只,于注药第1天行双侧卵巢切除术。2.3实验观察指标①小鼠一般状态观察：观察处理后各组小鼠的活动、饮食及体重变化等情况。②小鼠动情周期的观察：每天取小鼠阴道分泌物涂片并HE染色,观察小鼠动情周期变化情况。③小鼠卵巢和子宫组织学变化：分别取不同时间段（d18,d37,d80和d120天）小鼠卵巢和子宫组织做病理切片并HE染色,切片厚度为5μm,每隔20μm取一张切片,光镜下观察小鼠卵巢和子宫的组织学改变。④不同时间段卵泡计数：于注药后d18,d37,d80和d120天分别卵泡计数,为避免重复计数卵泡,原始卵泡和初级卵泡以卵母细胞核作为标记物计数,次级卵泡和窦卵泡以卵母细胞核仁为标记物计数。每只取20张切片分别计数各级卵泡数目。结果1.动情周期变化：注药d60天VCD组动情周期不规则数占80%,d80天全部紊乱。芝麻油组和正常对照组动情周期变化较稳定,去势组小鼠均处于动情间期,无动情周期变化2.卵泡计数和卵巢组织学变化：注药d18天VCD组原始卵泡消失,初级卵泡较少见,次级卵泡和窦卵泡未见明显减少,注药d37天VCD组初级卵泡偶见或消失,次级卵泡和窦卵泡总数减少至正常对照组的10.08%（8.33／82.67）,其卵泡总数为正常对照组3.96%（11／278）,d80天VCD组各阶段生长卵泡数严重减少（P<0.01）；d120天VCD组5只小鼠卵巢体积均明显减小（5／5）,镜下见卵巢萎缩明显、皮质增厚、结构紊乱,各级卵泡消失或偶见,正常对照组和芝麻油组可见各级发育中的卵泡.3.子宫形态及组织学变化：注药d120天VCD组子宫体积萎缩、内膜变薄、腺腔小,类似于去势组子宫变化。正常对照组和芝麻油组子宫内膜较厚,固有层腺体丰富.结论1.用职业性环境化学物质VCD能成功建立卵巢早衰动物模型,实验方法简便,建模成功率高。2.本研究结果显示VCD能选择性破坏原始卵泡和初级卵泡,最终引起次级卵泡及窦卵泡的减少至消失,提示VCD作用于卵巢的靶细胞可能是原始卵泡和初级卵泡,卵巢组织学观察并未见炎型反应及坏死结构,其致卵巢早衰的机制可能是通过凋亡途径。3.用职业性环境化学物质VCD所致的卵巢早衰过程类似于女性生理性的卵巢早衰过程,这对于卵巢早衰的临床研究和治疗提供一定的帮助。4.保护女性远离卵巢毒性物质,对女性生殖健康至关重要。
王丹丹[6]（2010）在《人卵巢组织玻璃化冷冻保存方案的初步探讨》文中研究表明早期诊断、有效地放化疗以及骨髓移植的应用,明显改善了肿瘤的治疗效果,大大提高了肿瘤患者的生存率。但对于年轻的女性患者而言,生存率的提高并不意味着生活质量的提高。因为卵巢组织对这些细胞毒性治疗尤其是烷化剂及放疗特别敏感,有可能导致女性生殖内分泌功能的丧失。多方面的研究已经证实对这些患者实施卵巢组织冷冻保存是有效的。卵巢组织中存在大量的卵泡,如果能够有效地将其冷冻保存,需要时解冻并加以利用,必将为生命科学的进一步发展提供丰富的资源和强有力的研究平台。近年卵巢组织冷冻研究发展迅速,并逐渐成为生命科学研究中的热点问题。玻璃化冷冻技术是20世纪90年代发展起来的冷冻保存技术,目前已在胚胎冷冻保存方面得到广泛的应用,相继有学者报道了玻璃化冷冻成功保存鼠、兔、羊、猴等卵巢组织的研究,并证实玻璃化冷冻可以成为保存卵巢组织功能较为有效的手段。目的当前卵巢组织玻璃化冷冻保存还没有统一的冷冻方案,包括冷冻保护剂和冷冻载体。国内的卵巢组织玻璃化冷冻尚处于探索阶段,本次研究通过观察新鲜和冻融后的卵巢组织的某些生理特点,着重探讨不同玻璃化冷冻方案对人卵巢组织冷冻的效果,初步比较不同浓度玻璃化冷冻保护剂以及不同的冷冻载体对人卵巢组织玻璃化冷冻效果,初步建立一种人卵巢组织玻璃化冷冻方案。材料与方法1材料2008年8月至2009年3月间,本研究募集了20例因卵巢囊肿需要手术的患者,年龄为24-38岁（29.79±4.14）。活检卵巢组织均通过腹腔镜下获得,在进行囊肿剥离术后剪下附于囊肿壁上且无明显血栓的卵巢组织片进行实验。2方法2.1卵巢组织的处理将取得的卵巢组织片置于装有生理盐水液的试管内并放入冰桶中保存,30分钟内送至实验室,在磷酸盐缓冲液中反复漂洗、去除髓质,将卵巢皮质片切割成2*2*1mm3大小的组织块,放在磷酸盐缓冲液中备用。随机选取部分组织块置于中性福尔马林液中固定作新鲜对照组。2.2卵巢组织玻璃化冷冻保存采用低浓度比二甲基亚砜（DMSO）和乙二醇（EG）为玻璃化Ⅰ组,高浓度比为玻璃化Ⅱ组。将部分人卵巢组织块在平衡液和两种玻璃化冷冻液中暴露一定的时间后分别经微滴法、麦管法和坚硬表面玻璃化法（SSV）投入液氮中进行玻璃化冷冻保存。2.3卵巢组织冷冻复苏及体外培养采用三步复苏法将冷冻保存的组织颗粒逐个复苏,随机选取部分复苏后的卵巢组织块置于CO2培养箱中培养14天,每48小时收集培养上清液,离心、等待测激素水平。将剩余组织块及培养结束后的组织块中性固定后等待组织学检查。2.4组织学检查及激素水平测量每四个组织块为一待检平面行石蜡包埋,每个石蜡块以4μm厚度切片,行HE染色。以RIA测定上清液中雌二醇（estradiol, E2）水平,以评定冻融后卵巢组织的内分泌功能。3统计学处理利用SSPS13.0对数据进行统计学分析。组间原始卵泡形态正常率行χ2检验分析,组间凋亡率比较行单因素方差分析,体外培养两周各组间激素分泌量行随机配对方差分析,以a=0.05检验水准。1冷冻对人卵巢组织间质及各级卵泡比例和形态学的影响1.1冷冻对人卵巢组织间质的影响新鲜人卵巢组织间质细胞排列紧密且规律,将各级卵泡紧密的包裹在卵巢皮质内。与新鲜对照组相比,两种玻璃化冷冻方案冷冻保存的卵巢组织,复苏后均可见卵巢组织内部分间质细胞分离,但原始卵泡变化不明显。体外培养后卵巢组织间质细胞间连接疏松、甚至断裂形成裂隙,细胞排列紊乱。1.2冷冻对人卵巢组织内各级卵泡比例和形态学的影响与新鲜组相比,两冷冻组原始卵泡的数目和正常形态率都有不同程度的下降,但玻璃化Ⅰ组原始卵泡正常形态率差异无统计学意义（P>0.05）,玻璃化Ⅱ组差异有统计学意义（P<0.05）,两冷冻组间差异有统计学意义（P<0.05）。新鲜组与各冷冻组初级卵泡和次级卵泡数目均较少,本次研究中不再对其进行统计学分析。2冷冻对人卵巢组织中各类细胞凋亡情况的影响卵巢组织内原始卵泡、初级卵泡的卵母细胞以及颗粒细胞内均未见凋亡细胞的阳性表达；而卵巢组织内部分间质细胞的细胞核内可见阳性表达的凋亡细胞,呈棕色或棕褐色。与新鲜对照组相比,玻璃化冷冻各组卵巢组织内间质细胞凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）。3冷冻对复苏后卵巢组织分泌E2的影响组织体外培养期间,各冻融组分泌E2不断增高,两冷冻组间同种载体间差异有统计学意义（P<0.05）,两冷冻组内各载体间差异无统计学意义（P>0.05）。结论1各冷冻组中SSV法明显优于微滴法及麦管法,较适合卵巢组织冻存。2较低浓度冷冻保护剂及SSV玻璃化冷冻方法保存卵巢组织的效果更佳。
张爽[7]（2010）在《卵巢组织冷冻方法优化及抗损伤处理对移植结局影响的研究》文中研究说明目的：比较丙二醇（PROH）联合二甲基亚砜（DMSO）与乙二醇（EG）联合二甲基亚砜,（DMSO）作为冷冻保护剂（Cryoprotective agent, CPA）冷冻卵巢组织对卵泡的形态及移植后卵巢功能恢复的影响。并比较冻存后的卵巢组织自体异位移植后经血管内皮生长因子（VEGF）、维生素E （Vitamin E, VE）、中药黄芪（Astragalus, As）抗损伤处理,VEGF、VE抗损伤处理及不用任何药物抗损伤处理对移植卵巢组织形态和功能的影响。方法：将54只成年Wistar大鼠用随机数字表法分为9组,每组6只大鼠。1-8组行去势手术。1、3、5组大鼠取出的卵巢组织应用PROH联合DMSO作为CPA冻存；2、4、6组大鼠取出的的卵巢组织应用EG联合DMSO作为CPA冻存；7组大鼠去势后自体移位移植新鲜卵巢组织；8组大鼠行去势手术后不加任何处理；9组大鼠为正常对照组。1-6组大鼠卵巢组织置于注入相应CPA的麦管中进行程序化冷冻,放入液氮中保存两周,复温后行自体异位移植术。1、2组大鼠经VEGF、VE、As抗损伤处理；3、4组大鼠经VEGF、VE抗损伤处理；5、6组大鼠不用抗损伤药物处理。饲养两月,将各组大鼠麻醉后行腹主动脉取血检测血清雌二醇水平；并取出移植的卵巢组织置于10%中性福尔马林液固定,行HE染色后观察卵泡的形态及正常卵泡的数量。结果：大鼠卵巢组织经CPA A*液及CPA B▲液冻存,移植后经VEGF、VE、As#; VEGF、VE$抗损伤处理及不用药物抗损伤处理,比较血清雌二醇水平,分别进行t检验（P#*▲<0.05；pS*▲<0.05；P*▲<0.05.）。即无论是否应用药物抗损伤处理,PROH联合DMSO作为CPA冻存的卵巢组织移植后,大鼠血清雌二醇水平均高于EG联合DMSO作为CPA冻存组；大鼠卵巢组织经CPA A*液及CPAB▲液冻存,移植后经VEGF、VE、As#; VEGF、VE$抗损伤处理及不用药物抗损伤处理,分别比较血清雌二醇水平,并进行t检验。（p*#$>0.05；p▲#$>0.05；p*#<0.05；p<▲#0.05;p*S<0.05；p<▲s0.05.）。即无论应用那种CPA冻存,VEGF、VE、As抗损伤处理组与VEGF、VE抗损伤处理组比较血清雌二醇水平虽略有升高,但差异无统计学意义。但经VEGF、VE、As抗损伤处理组及VEGF、VE抗损伤处理组与未用药物抗损伤处理组比较血清中雌二醇水平均有显着性差异；大鼠卵巢组织经CPA A*液及CPA B▲液冻存,移植后经VEGF.VE.As#;VEGF.VE$抗损伤处理及不用药物抗损伤处理,分别比较次级卵泡百分率,并进行t检验（p*#$>0.05;p*#<0.05;p*$<0.05;p▲#$>0.05;p▲#<0.05;p▲$<0.05.）。即无论应用那种CPA冻存,VEGF.VE.As抗损伤处理组与VEGF.VE抗损伤处理组比较初级卵泡数略有增加,但差异无统计学意义。但经VEGF.VE.As抗损伤处理组及VEGF.VE抗损伤处理组与未用药物抗损伤处理组比较初级卵泡数量均有显着性差异。结论：应用程序化冷冻的方法,PROH联合DMSO作为CPA较EG联合DMSO作为CPA对冻存卵巢组织的损伤小,且对移植后卵巢组织形态和功能的恢复效果好,是更为合理的冷冻保护剂；移植后的卵巢组织应用VEGF.VE.As;VEGF.VE抗损伤处理组与未用药物处理组比较,卵巢组织的形态及功能恢复均差异显着,即抗损伤处理对卵巢组织形态及功能的恢复有效。应用VEGF.VE.As抗损伤处理组与VEGF.VE抗损伤处理组比较雌二醇水平略增高,初级卵泡数量略增加,但无统计学差异。尚不能认为VEGF.VE.As抗损伤处理较VEGF.VE抗损伤处理效果好。
王艳盛[8]（2010）在《成年绵羊与人胎儿卵巢组织大皮质片玻璃化冻存效果的研究》文中研究指明目的通过添加卵泡刺激素对绵羊卵巢、胎儿卵巢进行冷冻和移植前的干预,探索可保存卵巢间质、保护卵泡储备的简便、经济、有效的冻存法;通过绵羊卵巢组织自体和异体不同移植部位的比较,筛选最佳的移植部位,为临床应用提供科学依据。方法①不同体积的绵羊卵巢皮质块超玻璃化冷冻的间质细胞形态学观察:将3～6月龄的绵羊卵巢皮质按体积的不同分为三组,40mm3:5mm×4mm×2mm;80mm3:10mm×4mm×2mm;160mm3:10mm×8mm×2mm大小的组织块,采用两步渗透平衡法摸索适宜于不同体积的绵羊卵巢组织的玻璃化冷冻的渗透平衡时间,并对解冻后的卵巢进行间质细胞的光镜及分离细胞存活率的观察。②FSH干预对绵羊卵巢组织玻璃化冻存后异种异位移植效果的观察:在冷冻液、解冻液、培养液中添加FSH,将绵羊卵巢组织冻融后行裸鼠颈部皮下移植,通过血清E2测定、移植存活的卵泡计数评价FSH对大皮质卵巢组织异种移植的作用。③绵羊卵巢组织玻璃化冻存后自体移植:对40mm3体积的成年绵羊卵巢皮质进行玻璃化冻存,解冻后采用原位和异位卵巢移植,进行绵羊卵巢组织新鲜及玻璃化冻存卵巢的自体移植,通过移植存活卵泡数评价卵巢组织大皮质块移植的适宜部位和观察玻璃化冻存的卵巢组织自体移植后的发育结果。④玻璃化冻存绵羊卵巢组织异体移植:对40mm3体积的成年绵羊卵巢皮质进行玻璃化冻存,解冻后采用异体原位和异位卵巢移植,通过血清FSH、E2测定、移植存活卵泡数评价移植部位和观察玻璃化冻存的卵巢组织异体移植后的发育结果。⑤采用大皮质片最佳的玻璃化渗透平衡时间和FSH干预,进行胎儿卵巢组织大皮质片玻璃化冻存及培养。通过卵泡形态学观察、卵泡构成比和卵泡直径观察评价不同体积皮质片玻璃化冻存和FSH干预效果。结果①三种不同体积的卵巢皮质块在玻璃化冷冻液中经渗透平衡后,进行玻璃化冻存,组织学观察:A.间质细胞数量和形态变化:40mm3皮质块在玻璃化液渗透平衡不同时间下冷冻后,卵巢组织内基质细胞数量以渗透平衡7min组（16.00±2.16）与新鲜对照组（16.00±2.83）相似,5min、6min、8min组细胞数量较多,与新鲜对照组相比差异有统计学意义,P<0.05,卵巢组织内形态正常基质细胞百分率以渗透平衡7min组（79.50±6.95）和渗透平衡8min组（80.25±4.03）与新鲜对照组（88.00±3.56）相似,5min、6min组较低,与新鲜对照组相比,差异有统计学意义,P<0.05; 80mm3皮质块在不同渗透平衡时间下冷冻后,卵巢组织内基质细胞数量以渗透平衡11min组（20.050±2.38）、12min组（19.25±0.50）与新鲜对照组（18.00±2.45）相似,10min、13min组与新鲜对照组相比较多,差异有统计学意义,P<0.05,卵巢组织内形态正常基质细胞百分率除了渗透平衡11min组（84.00±0.81）与新鲜对照组（86.25±1.50）相似外,10min、12min、13min组与新鲜对照组相比较低,差异有统计学意义,P<0.05;160mm3皮质块在不同渗透平衡时间下冷冻后卵巢组织内基质细胞数量除渗透平衡19min组较低,17min、18min、20min组与新鲜对照组（18.50±1.73）相比较多,差异有统计学意义,P<0.05,以19min组（19.50±2.38）与新鲜对照组最接近;卵巢组织内形态正常基质细胞百分率以渗透平衡19min组（81.50±4.40）与新鲜对照组（85.25±4.99）相似外,其余各组与新鲜对照组相比较低,差异有统计学意义,P<0.05。B.绵羊卵巢组织冻存后基质细胞存活率:新鲜组及各冻融组基质细胞得数和存活率差异均无统计学意义,P>0.05。②FSH干预对绵羊卵巢组织玻璃化冻存后异种异位移植效果的观察:移植术后4w,FSH干预冻融移植组与新鲜移植组相比动情周期恢复率、每高倍视野卵泡计数差异均无统计学意义,P>0.05,高于非FSH干预的冻融移植组,P<0.05;动情周期恢复需要的天数接近于新鲜移植组,明显短于非FSH干预的冻融移植组,P<0.05。移植后4周,FSH干预冻融移植组组织学观察见卵泡发育,而非FSH干预的冻融移植组仅偶见原始卵泡。FSH干预冻融移植组与新鲜移植组相比血清E2水平差异均无统计学意义,P>0.05;未添加FSH的玻璃化冻存移植对照组血清E2水平低于FSH干预冻融移植组和新鲜移植组,P <0.05。③绵羊卵巢组织玻璃化冻存自体移植:与同体积新鲜取材卵巢正常卵泡数相比,新鲜原位移植6m取材见6.38%卵泡存活,冻融原位移植3m取材见5.74%卵泡存活,且都有发育的次级卵泡,新鲜及冻融异位移植均未见卵泡存活。④玻璃化冻存绵羊卵巢组织异体移植:血清FSH水平除新鲜异体原位移植组外,其他各组与空白对照组相比,差异有统计学意义,P<0.05;异体移植各组间相互比较,新鲜异体原位移植组与两异位移植组差异有统计学意义,P<0.05,与冻融异体原位移植组间差异无统计学意义;冻融异体原位移植组与两异位移植组和空白对照组间差别有统计学意义,P<0.05。血清E2水平除新鲜异体原位移植组外,其余各组与空白对照组相比,差异有统计学意义,P<0.05,异体移植各组间相互比较,新鲜原位移植组与其他三组之间差异有统计学意义,P<0.05;冻融原位移植组与两异位移植组之间差异有统计学意义,P<0.05;两异位移植组之间差异无统计学意义。移植物卵泡存活率:移植术后3m,同期发情处理,冻融异体原位移植见6.79%～2.42%卵泡存活。新鲜和冻融异位移植均未见存活卵泡。新鲜异体原位移植出现发情反应,继续饲养观察。⑤采用大皮质片最佳的玻璃化渗透平衡时间和FSH干预,进行胎儿卵巢组织大皮质片玻璃化冻存及培养:A形态正常卵泡构成比:新鲜组与两个冻融组相比P>0.05,无统计学意义。两个不同体积的冻融组比较P>0.05,无统计学意义。同体积的冻融组和培养4.5h组之间相比较,卵泡呈现发育表现,卵泡构成比有统计学意义。B卵泡直径:新鲜组和两冻融组相似,P>0.05,差距无统计学意义。两冻融组间比较P>0.05无统计学意义。同体积的冻融组和培养组之间相比较,培养组卵泡直径增大,差别有统计学意义。结论①玻璃化法可有效冻存体积为40mm3、80mm3及160mm3绵羊卵巢组织大皮质块中的基质细胞,为移植后的卵泡发育提供了细胞基础。②玻璃化冷冻、解冻液和培养液中添加10μg/mL FSH,可提高冻存绵羊卵巢组织裸鼠体内异位移植的存活率,促进体外培养卵泡的发育。③绵羊卵巢组织大皮质片冻存后,正常卵泡数与新鲜组相似,玻璃化冻存后移植存活卵泡数与新鲜移植组接近,但均表现为大量的卵泡丢失。④适宜的玻璃化液渗透平衡时间可有效冻存人胎儿卵巢大皮质片,冻融过程的FSH添加并不影响早期卵泡的构成比,但是体外培养4.5h可使一定量的原始卵泡发育至早期初级卵泡阶段。
彭南妮[9]（2009）在《卵巢异性移植小鼠两性配子同体发育、受精及胚胎发育研究》文中研究指明卵巢异性移植对充分利用动物生殖细胞资源具有特殊的应用价值。为探讨卵巢异性移植中两性配子同体发育、受精及胚胎发育能力,本研究通过卵巢异性移植构建雌、雄性腺同体模型,在哺乳动物小鼠中对卵巢异性移植受体雄鼠性腺、精子、相关基因表达进行了检测,并首次对同体发育两性配子体外受精和胚胎发育能力进行了研究,获得以下研究结果:1.在卵巢移植后21d和28d,卵巢移植体生长发育良好,有大的有腔卵泡发育;卵巢移植受体的睾丸、附睾形态正常,与对照组雄鼠无明显异常,各组间雄鼠体重、睾丸附睾湿重及睾丸附睾与体重的比值均差异不显着（P＞0.05）。组织学检查结果也表明,移植组睾丸生精细管、附睾头和附睾尾的结构正常,管腔内均有精子分布,与对照组比较形态上无明显差异。这表明卵巢移植体未对雄性受体睾丸组织产生明显的影响。2.卵巢移植体的生长及卵泡发育未对雄性移植受体精子的生成及成熟产生明显影响,雄性受体精子的形态、精子畸形率（7.62%和7.78%）保持在与对照组相近水平,无显着差异。3.通过卵巢移植受体雄鼠在卵巢移植后21～60 d期间与正常雌鼠合笼配种,观测了卵巢移植体对受体鼠生育能力的影响。结果显示,在卵巢移植后21～60天期间卵巢移植体仍有卵泡发育的生理状态下,试验组受体鼠具有与对照组雄鼠同样的生育能力,试验组的平均窝产仔数（8.83±2.10）与对照组（9.85±2.34）无明显差异。这一结果也与受体鼠精子形态学的观察结果相一致,说明在雌、雄性腺同体的受体鼠中,睾丸精子的发生与成熟过程没有受到卵巢移植体功能活动的明显干扰,受体鼠精子具有体内受精能力并能繁殖正常后代。4.采用RT-PCR方法对小鼠精子发生及凋亡相关基因Pgk2、Dazl、Prm2和Bax的表达进行了分析,未发现不利于精子发生的表达异常,说明卵巢移植对雄性受体小鼠的精子发生在分子水平上未产生明显的损害作用。5.通过体外受精试验初次证实,在卵巢异性移植构建的雌、雄性腺同体生理环境中,同体发育的两性配子具有体外受精和胚胎发育至囊胚的潜能。这些同体发育的两性配子可以相互结合完成受精过程,其2-细胞胚胎发育率和囊胚发育率可分别达到60.4%和33.9%。这表明雌雄异体繁殖模式的动物仍保留着雌、雄配子可以同体发育、受精的潜能,同时也说明小鼠雄性个体的生理环境也能满足卵子发育所需的基本条件。6.本试验通过体外受精和胚胎移植辅助生殖技术,首次成功繁殖了同体发育两性配子的新生后代,共有3只母鼠妊娠并生下6只发育仔鼠,其移植成功率（或妊娠率）、产仔率分别为25.0%和4.2%;观察和比较了试验组与正常繁殖对照组新生仔鼠3周哺乳期的体重增长变化,结果表明两组新生仔鼠3周龄体重及增长趋势基本相同。结果表明,在卵巢异性移植受体中,雌、雄配子不仅具有同体发育、受精潜能,而且可以通过体外受精和胚胎移植辅助生殖技术繁殖新生后代。其新生仔鼠具有正常生长发育能力。7.研究对雌雄性腺同体发育两性配子体外受精繁殖的后代雄鼠进行了生育能力评价。试验组2只后代雄鼠与正常雌鼠配种繁殖,均能使母鼠受孕,平均窝产仔数达9.60±3.98只,与正常雌、雄鼠配种对照组相比无显着差异（P＞0.05）。结果表明卵巢异体移植后同体发育配子产生的新生后代具有正常繁殖能力,配子同体发育不影响其子代的繁殖能力。
廖海艳,周卫国[10]（2007）在《卵巢冷冻保存和移植的历史、现状及前景》文中进行了进一步梳理随着卵巢组织冷冻保存方法和冷冻技术的发展,生殖系的保存已变成了现实,卵巢组织冷冻和移植将作为一种保存种质资源最长远的选择,如冻存卵巢组织移植为年轻女性患者恢复内分泌及生育能力提供了可能。试验表明,冻存卵巢移植后其功能可恢复,并能保持较长期功能。文章就卵巢冷冻保存和卵巢移植技术的发展进步,卵巢组织冷冻和移植的历史、研究进展、方法、影响因素及临床应用进行综述。
二、冻存复苏人卵巢皮质在裸鼠体内的发育及卵细胞的提取（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、冻存复苏人卵巢皮质在裸鼠体内的发育及卵细胞的提取（论文提纲范文）
（1）牛卵巢组织窦前卵泡的冻存方法及不同培养体系对始基卵泡活性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一部分 两种冷冻方法对牛卵巢组织内窦前卵泡活性的影响 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 第二部分 探讨体外三维培养冻融的牛始基卵泡最适藻酸盐浓度 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（3）家兔和人卵巢组织冷冻复苏及异种移植的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词汇对照表 |
| 引言 |
| 第一部分：家兔卵巢组织冷冻复苏的实验研究 |
| 1 研究对象及实验材料 |
| 2 研究内容及研究结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 附图 |
| 第二部分：家兔卵巢组织异体异位移植的实验研究 |
| 1 研究对象及材料 |
| 2 研究方法及内容 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附图 |
| 第三部分：人类卵巢组织冷冻复苏的实验研究 |
| 1 研究对象及材料 |
| 2 研究方法及内容 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附图 |
| 第四部分：人卵巢组织异体异位移植的实验研究 |
| 1 研究对象及材料 |
| 2 研究方法及内容 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 附录三 |
| 综述 卵巢组织玻璃化冻存及移植的研究现状与应用前景 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 在学期间发表的论文和科研成果 |
（4）卵巢移植国内研究进展（论文提纲范文）
| 1 卵巢移植的应用研究 |
| 1.1 卵巢内分泌功能的维持与恢复 |
| 1.2 繁殖保种 |
| 1.3 动物模型的建立 |
| 2 移植卵巢的生长发育与功能研究 |
| 2.1 皮下移植 |
| 2.2 肾囊下移植 |
| 3 冷冻保存与移植研究 |
| 3.1 程序法冷冻保存与移植 |
| 3.2 玻璃化冷冻保存与移植 |
| 4 卵巢移植有关的免疫学研究 |
（5）环境化学物质VCD致卵巢早衰动物模型的构建（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 主要符号说明 |
| 论文正文 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 技术路线 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表及附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）人卵巢组织玻璃化冷冻保存方案的初步探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 论文部分 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述部分 人卵巢组织冷冻保存的研究进展及应用前景 |
| 参考文献 |
| 个人简历在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（7）卵巢组织冷冻方法优化及抗损伤处理对移植结局影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 第二章 结果 |
| 2.1 化学发光法测定血清雌二醇水平及不同组别间比较 |
| 2.2 卵巢组织HE染色后,比较各组卵泡分布;计算形态正常卵泡的百分率;并观察各组卵巢组织的形态结构 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
（8）成年绵羊与人胎儿卵巢组织大皮质片玻璃化冻存效果的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 实验一 成年绵羊卵巢组织大皮质片冻存效果研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 实验二 胎儿卵巢组织大皮质片冻存效果研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 个人简历 |
（9）卵巢异性移植小鼠两性配子同体发育、受精及胚胎发育研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 国外卵巢移植研究进展 |
| 1.1 国外卵巢移植研究概况 |
| 1.2 卵巢移植研究方法 |
| 1.3 卵巢移植在生物医学界的应用 |
| 2 卵巢移植国内研究进展 |
| 2.1 国内卵巢移植的应用 |
| 2.2 国内卵巢移植方法研究 |
| 2.3 冷冻保存卵巢的移植及其功能的恢复研究 |
| 3 目前卵巢移植技术中存在的问题 |
| 3.1 缺血对移植卵巢的损伤 |
| 3.2 免疫排斥反应对异体移植卵巢的影响 |
| 3.3 冷冻保存对移植卵巢的损伤 |
| 4 本研究的目的意义与目标 |
| 4.1 本研究的目的意义 |
| 4.2 本研究的内容与目标 |
| 参考文献 |
| 第二章 小鼠移植卵巢对雄性受体生殖机能的影响研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 试验设计 |
| 1.4 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 卵巢移植体与卵母细胞的回收与观察 |
| 2.2 睾丸、附睾和精囊腺组织形态观察及睾丸附睾体重的比值 |
| 2.3 精子采集与形态学检查 |
| 2.4 睾丸、附睾组织学观察 |
| 2.5 卵巢移植对受体繁殖力的影响 |
| 2.6 卵巢异性移植受体睾丸、附睾精子发生与凋亡相关基因的表达分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于卵巢移植体对雄性受体睾丸的影响 |
| 3.2 关于卵巢移植体对雄性受体精子的影响 |
| 3.3 关于卵巢移植体对受体鼠精子及生育能力的影响 |
| 3.4 关于睾丸、附睾精子发生与凋亡相关基因的表达分析 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 同体发育两性配子受精及胚胎发育能力研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 试验设计 |
| 1.4 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 异性移植卵巢及成熟卵母细胞的形态学观察 |
| 2.2 体外受精与早期胚胎体外发育 |
| 2.3 胚胎移植 |
| 2.4 子代的生长发育 |
| 2.5 子代的繁殖能力 |
| 3 讨论 |
| 3.1 异性移植卵巢卵母细胞的成熟 |
| 3.2 同体发育两性配子体外受精与胚胎体外发育 |
| 3.3 关于胚胎移植 |
| 3.4 关于子代的生长发育 |
| 3.5 关于子代繁殖性能 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 总结 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 附录A 英文缩写名词索引 |
| 致谢 |
| 作者简历及在读期间科研学术成果 |
（10）卵巢冷冻保存和移植的历史、现状及前景（论文提纲范文）
| 1 卵巢组织冷冻移植历史 |
| 2 卵巢组织冷冻移植现状 |
| 2.1 卵巢组织冷冻移植的动物试验 |
| 2.2 卵巢组织冷冻移植的部位和保护剂的选择 |
| 3 卵巢组织冷冻移植前景及应用 |
| 3.1 同种异体移植和异种移植 |
| 3.2 自体原位和异位移植 |
| 4 影响因素及前景 |
四、冻存复苏人卵巢皮质在裸鼠体内的发育及卵细胞的提取（论文参考文献）
- [1]牛卵巢组织窦前卵泡的冻存方法及不同培养体系对始基卵泡活性的影响[D]. 贾琪. 郑州大学, 2017(02)
- [2]卵巢组织冷冻保存及其应用[A]. 张红. 中国中药杂志2015/专集：基层医疗机构从业人员科技论文写作培训会议论文集, 2016
- [3]家兔和人卵巢组织冷冻复苏及异种移植的实验研究[D]. 王兴玲. 郑州大学, 2013(10)
- [4]卵巢移植国内研究进展[J]. 彭南妮,袁安文,邹红艳,吴方贵,许学岚,薛立群. 邵阳学院学报(自然科学版), 2011(01)
- [5]环境化学物质VCD致卵巢早衰动物模型的构建[D]. 李园园. 山东大学, 2010(09)
- [6]人卵巢组织玻璃化冷冻保存方案的初步探讨[D]. 王丹丹. 郑州大学, 2010(06)
- [7]卵巢组织冷冻方法优化及抗损伤处理对移植结局影响的研究[D]. 张爽. 延边大学, 2010(11)
- [8]成年绵羊与人胎儿卵巢组织大皮质片玻璃化冻存效果的研究[D]. 王艳盛. 宁夏医科大学, 2010(03)
- [9]卵巢异性移植小鼠两性配子同体发育、受精及胚胎发育研究[D]. 彭南妮. 湖南农业大学, 2009(10)
- [10]卵巢冷冻保存和移植的历史、现状及前景[J]. 廖海艳,周卫国. 动物医学进展, 2007(05)